في هذه الدراسة، استخدمنا الخفافيش MHC الفئة الأولى كنموذج لتلخيص المنهجية، وتقييم جدوى من فئة MHC الهجين أنا معقدة مع بيتا-2 مصغّر غير مغاير. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن استبدال الثدييات B2M لا يؤثر بشكل كبير على عرض الببتيد. في الواقع، فإن فئة MHC الهجينة يمكنني تفعيل بنية مماثلة وظيفة للجزيء الأصلي.
يمكن استخدام هذه التقنيات لتسهيل الدراسة الوظيفية والمهيكلة لـ MHC I لتقييم استجابة الأنسجة أثناء الأمراض المعدية والعلاج المناعي للورم. لE.coli التحول الثقافة إضافة 10 نانوغرام من plasmid التي تحتوي على الخفافيش أو الإنسان MHC الفئة الأولى بيتا اثنين من سلسلة الهيدروجين microglobulin إلى 100 ميكرولترات من تعليق تعادل والاستحمام تعليق في الجليد لمدة 30 دقيقة. في نهاية الحضانة، والحرارة البكتيريا لمدة 90 ثانية في 42 درجة مئوية، والعودة إلى الثقافة حمام الجليد لمدة دقيقتين.
بعد ذلك إضافة 800 ميكرولتر من مرق lysogeny إلى الثقافة، وهز التعليق على منصة هزاز لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية، و 200 التناوب في الدقيقة الواحدة. في نهاية الحضانة، انتشار 100 ميكرولترات من البكتيريا على شفرة الثقافة المضادة للمضادات الحيوية المناسبة المقاومة. في صباح اليوم التالي، واختيار استنساخ واحد البكتيرية تحولت مؤخرا وتطعيم استنساخ مع ثلاثة ملليلتر من LB مع المضادات الحيوية المتوسطة.
ضع الثقافة على منصة هزاز في 37 درجة مئوية لمدة 12 إلى 16 ساعة. في صباح اليوم التالي، نقل 500 ميكرولترات من المخزون البكتيري المنشط إلى 50 ملليلتر من LB مع المضادات الحيوية المتوسطة، وإعادة البكتيريا إلى حاضنة هزاز بين عشية وضحاها. تقسيم المخزون البكتيري المنشط المتبقية إلى 500 ميكرولتر aliquots وإضافة كل aliquot إلى 500 ميكرولتر وحدات التخزين من 40 ٪ الجلسرين ، للتخزين ناقص 80 درجة مئوية.
لتوليد كميات كبيرة من البروتين المؤتلف، في صباح اليوم التالي نقل التعليق البكتيري إلى لترين من LB مع المضادات الحيوية المتوسطة بنسبة واحد إلى 100، وإعادة الثقافة إلى حاضنة هزاز حتى يتم تحقيق امتصاص 0.6 في 600 نانومتر. ثم، إضافة واحد ملليمتر IPTG إلى الثقافة للحث على التعبير عن الجينات عبر. بعد أربع إلى ست ساعات من الحث، ونقل الثقافة البكتيرية إلى زجاجات للطرد المركزي، وإعادة تعليق الكريات الخلية البكتيرية في 60 ملليلتر من برنامج تلفزيوني للزجاجة الواحدة.
ثم تحرير البروتين المؤتلف أعرب عن طريق تعطيل الخلايا بالموجات فوق الصوتية 99 مرات، لمدة ست ثوان وفاصل زمني من 12 ثانية في 300 واط لكل سونيكيشن. لاحتواء الجسم تنقية جمع البكتيريا سونيكاتيد عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق الكريات في حجم مناسب من الغسيل العازلة لاثنين من الطرد المركزي إضافية. بعد الغسيل الثاني، إعادة تعليق الهيئات إدراج وإعادة تعليق العازلة، وتوضع جانبا 20 ميكرولتر aliquot من العينة لصفحة SDS لاختبار نقاء الجسم إدراج.
الطرد المركزي العينة المتبقية، وتزن هيئة إدراج تحتوي على بيليه. إضافة العازلة حل إلى الكريات إلى تركيز النهائي من 30 ملليغرام من الجسم إدراج لكل ملليلتر من العازلة. واستخدام stirrer المغناطيسي لتحريك ببطء الحل في أربع درجات مئوية، حتى يتم حل الهيئات إدراج في العازلة حل.
بعد التخلص من الرواسب، وتخزين الهيئات إدراج في ناقص 20 أو ناقص 80 درجة مئوية. لإعادة التكتّن بمركب MHC، أضف 5 ملليمولار مُخفض الجلوتاثيون و0.5 مللُر تأكسد الجلوتاثيون في 250 إلى 300 ملليلتر، وهو عازل إعادة رقعة من أربع درجات مئوية. وتحريك ببطء الحل على مُحرك مغناطيسي عند أربع درجات مئوية لمدة 10 إلى 20 دقيقة.
لسلسلة الهيدروجين MHC وبيتا اثنين من تخفيف ميكروغلوبولين، تحميل الجسم إدراج في حقنة ملليلتر واحد وحقن كامل حجم ملليلتر من محلول الجسم إدراج في لتر واحد من المخزن المؤقت refolding بالقرب من شريط اثارة، للحصول على تخفيف سريع وفعال. بعد ذلك ، قم بحل خمسة ملليغرام لكل ملليلتر من الببتيد في كبريتيد ثنائي الميثيل ، وسرعة حقن 200 ميكرولتر من الببتيد في محلول إعادة الطييف كما هو موضح للتو. بعد 10 إلى 20 دقيقة من التحريك البطيء ، حقن ثلاثة ملليلتر من أجسام إدراج سلسلة H في حجم لتر واحد جديد من عازلة إعادة الطييف والسماح لإعادة التحريك للمضي قدما في أربع درجات مئوية لمدة ثماني إلى 10 ساعات.
لتحديد تركيز البروتين الذي أعيد طيه يضاف مخزن التبادل إلى غرفة مضغوطة مع غشاء أوكسيداز متعدد النحاس 10 كيلودالتون، وتركيز المخزن المؤقت إلى 30 إلى 50 ملليلتر. نقل حل إعادة التكديس إلى أنبوب الطرد المركزي، وإزالة الرواسب عن طريق الطرد المركزي. نقل بعناية supernate إلى الغرفة وزيادة تركيز العازلة إلى حجم النهائي من ما يقرب من ملليلتر واحد.
إزالة أي الملوثات النهائية عن طريق الطرد المركزي ونقل السوبر إلى أنبوب معقمة. استخدام عشر مائة GL حجم العمود استبعاد لتنقية البروتينات ، وجمع العينات في الذروة ، وتحليلها باستخدام صفحة SDS. جمع قمة مجمع MHC وتركيز البروتين إلى تركيز نهائي من 15 ملليغرام لكل ملليلتر.
ثم تخفيف المجمع إلى 7.5 ملليغرام لكل ملليلتر التركيز. لأداء تبلور MHC المعقدة والببتيد باستخدام تقنية نشر بخار قطرة الجلوس ، أضف 0.8 ميكرولترات من العينة إلى لوحة بلورية تجارية وختم اللوحة. اِثُل محلول العينة ضد 100 ميكرولترات من محلول الخزان عند أربع أو 18 درجة مئوية، واستخدم المجهر لمراقبة نمو البلورات بانتظام على مدى الأشهر الستة القادمة.
لحماية المبردة، في نهاية التجربة، ونقل بلورات إلى محلول تخزين يحتوي على 20٪ الجلسرين قبل تبريد العينات بسرعة في تيار النيتروجين الغازي 100 درجة كلفن. ثم جمع بيانات الحيود بالأشعة السينية وفقا للبروتوكولات القياسية. لتحديد هيكل المجمعات الكريستالية، افتح بيانات الحيود الهيكلي عالية الدقة في برنامج Denzo ضمن حزمة برامج HK L 2000، واختر نموذجًا أوليًا في بنك بيانات البروتين.
لتحديد بنية البروتين، افتح البيانات في برنامج "فير MR" في CCP4، واستخدم نموذج الأشعة السينية المكررة لصقل المفصل الأولي. ثم استخدم فينيكس صقل وحدها ووضع مشترك للأشعة السينية وحدها صقل، والنيوترون المشترك لصقل الأشعة السينية. بعد كل جولة من الصقل، تحقق يدويا النموذج ضد Fo-Fc، و 2Fo-Fc خرائط الكثافة النووية الإيجابية في كوت.
في هذه التجارب التمثيلية، تم تقييم القدرات الملزمة لفيروس هيندرا Hendra فيروس واحد الببتيد إلى الخفافيش MHC فئة I سلاسل الهيدروجين مع الخفافيش المتجانسة بيتا اثنين من ميكروغلوبولين وبيتا الإنسان heterologous اثنين microglobulin. في كلا التحليلين، تشكلت بلورات ذات دقة عالية من خلال الرناتون مع سلسلة الضوء الجزئية بيتا اثنين. في غياب بيتا اثنين من الغلوبولين، وهذه المجمعات لا تشكل.
في الفئة MHC I سلسلة الهيدروجين Hendra فيروس واحد، الإنسان بيتا اثنين من هيكل microglobulin، والمخلفات المحفوظة H31، D53، W60، وY63 من بيتا الإنسان اثنين من الغلوبولين، والتي تتوافق مع الخفافيش بيتا اثنين من ميكروغلوبولين، جعل الاتصال مع الجزء السفلي من الأخدود ربط الببتيد والحفاظ Q8، Y10، R12، و 24 بقايا، والتي تتوافق مع اثنين من بيتا microglobulinس ملزمة إلى المجال الثلاثة ألفا. في الخفافيش العامة والهياكل البشرية، متوسط الجذر المتوسط مشتق مربع من المخلفات واحد إلى 184 من سلاسل الهيدروجين هو 0.248 تحت كل من الكربون ألفا ذرة تراكب، مما يدل على أنه لا توجد اختلافات بين هذين المجمعين. هيكل محاذاة الببتيد يظهر أن تأكيدات Hendra فيروس واحد الببتيدات في هذين المجمعين متشابهة تماما.
تسلسل المحاذاة يظهر أيضا أن الأحماض الأمينية من بيتا اثنين من الغلوبولين من أنواع مختلفة يتم الحفاظ عليها بشكل كبير. من المهم أن نقدم للمجمعات المعادية بكفاءة عالية للإبلاغ. ولذلك، فمن الأهمية بمكان لتحديد مناسبة بيتا اثنين من الجلوبيولين الصغيرة واستخدام هيئات إدراج تنقية للغاية.
ويمكن استخدام هذا البروتوكول للحصول على مستقر MTC I المعقدة من خلال بيتا المحتملة اثنين من بدائل ميكروغلوبولين في الأنواع الأخرى، وإلى وجود هم MTC أنا هيكل ودالة. يمكن استخدام البيانات التي تم الحصول عليها من هذه الدراسات لتقييم استجابات الخلايا التائية أثناء الأمراض المعدية والأمراض المناعية.
