يستخدم هذا البروتوكول ميكروديساكشن الليزري وتسلسل الحمض النووي الريبي لتحليل التعبير التفاضلي للرنا عن التغايرية داخل الذاكرة، مثل مناطق تراكم الخلايا الليسنيمالية أو مناطق غزو الورم. وقد تم تحسين هذه الطريقة للحفاظ على نوعية جيدة الأنسجة الأنسجة وسلامة الحمض النووي الريبي لتسهيل الحصول على عينات ميكروديسكشن الليزر عالية الجودة. هذا الأسلوب حساس و إعادة إنتاج عالية.
ويمكن استخدامه لدراسة مورفولوجيا الورم وعدم تجانس في نماذج مختلفة من الأورام. مجهرية الليزر من أنسجة ورم الدماغ المجمدة هي تقنية فعالة من حيث التكلفة وموثوق بها لعزل المناطق التشريحية المنفصلة من مجموعات الخلايا من أنسجة الورم لدراسة ملفاتهم الجزيئية. يمكن استخدام LMD للحصول على معرفة ميكانيكية متعمقة حول الأحداث الجزيئية التي تحدث أثناء تطور الورم ، ويمكن أن تكشف عن أهداف علاجية جديدة.
في التخمة الحيوية في الجسم الحي من عبء ورم الماوس تصل إلى إشارة بين مرة واحدة 10 إلى 6 و 10 مرات واحدة إلى الفوتونات 7. تدفق حل تيرودي أكسجين من خلال نظام الدورة الدموية من الماوس تحمل الورم القتل الرحيم حتى تم تطهير الكبد والرئتين تماما من الدم. مواصلة perfusing الحيوان مع 30٪ محلول السكروز حل في حل التيرود لمدة 15 دقيقة إضافية.
لتقييم نجاح الضخ ، تأكد من أن الرقبة والذيل والساقين جامدة في نهاية الدورة الدموية. ثم حصاد الدماغ وفقا للبروتوكولات القياسية وتخزين الدماغ بين عشية وضحاها في حل السكروز 30٪. للتحضير للتبريد، وملء جرة مع isopentane الباردة-2-ميثيلبوتان ووضع جرة في وعاء مملوءة النيتروجين السائل.
في حين أن المذيب هو تقشعر لها الأبدان، لطخة الدماغ الجافة على قطعة من ورقة التصفية ووضع الدماغ في Cryomold المسمى. بعناية في حوالي خمسة ملليلتر من درجة الحرارة المثلى قطع المتوسطة إلى مركز Cryomold ووضع الدماغ في القالب في الاتجاه المطلوب. باستخدام ملقط نظيفة، ضع بسرعة Cryomold في إيسوبينتان-2-ميثيلبوتان المبرد لمدة 30 إلى 40 ثانية.
مرة واحدة وقد توطدت المتوسطة القطع، ونقل Cryomold على الجليد الجاف والتفاف Cryomold وانجذاب أنسجة الدماغ المجمدة في رقائق الألومنيوم للتخزين ناقص 80 درجة مئوية. للحصول على أقسام أنسجة ورم الدماغ المجمدة ، قم أولاً بتعيين درجة حرارة التبريد بين ناقص 20 ونيقص 24 درجة مئوية ، ووضع كتلة العينة في غرفة التبريد لمدة 30 إلى 60 دقيقة. في حين أن العينة هو اكويريبراتينغ، وتنظيف الغرفة وحامل سكين مع 100٪ الإيثانول ورش فرش المقطع مع RNase محلول التنظيف.
عندما تكون العينة جاهزة، قم بإزالة القالب واستخدم وسيلة قطع جديدة لإرفاق كتلة الأنسجة المجمدة على قرص العينة في cryostat. ضع الكتلة في حامل القرص ومحاذاة الكتلة مع شفرة السكين. الحصول على 10 أقسام ميكرومتر من الدماغ باستخدام واحدة من فرش Rnase خالية من لتسطيح بعناية وفك قطع الأنسجة على سطح القطع.
لتركيب أقسام أنسجة الدماغ على الشرائح، اضغط بسلاسة على الجانب المشحون بشكل إيجابي من شريحة زجاجية PEN الخالية من RNase على القسم ووضع الشريحة في مربع تخزين داخل الغرفة. عندما يتم تجميع كافة الشرائح، ضع مربع التخزين عند ناقص 80 درجة مئوية. لإذابة وسيطة القطع قبل تشريح الليزر الجزئي، غمر الشرائح في 30 ثانية متتابعة تنازلية الإيثانول الغمر متبوعة حل البنفسجي الكريستال تلطيخ لمدة 20 ثانية وخمس ثوان في 0.5٪ محلول إيوسين Y.
في نهاية حاضنة eosin Y، استخدم ورق التصفية لمنع الشرائح الجافة وتجفيف الشرائح في غمرات الإيثانول التصاعدية المتتابعة. بعد غمر الإيثانول لمدة 60 ثانية، شطف الشرائح في حاوية من الزيلين لمدة ثلاث دقائق. بعد ذلك، قم بتجفيف الشرائح على سطح خال من RNase في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 ثوانٍ قبل تركيب العينات في وسط التركيب المعد مع مياه خالية من RNase.
بعد 10 إلى 20 ثانية، قم بنقل الشرائح إلى منصة ميكروديستيكشن المجهر. لالتقاط الليزر microdissection، تشغيل الطاقة قبل تشغيل الليزر. المقبل، بدوره على وحدة تحكم المجهر في الكمبيوتر وبدء برنامج التقاط الليزر microdissection.
في لوحة التحكم بالمجهر، حدد التكبير 10 مرات. تحت التحكم الليزر، تعيين المعلمات الليزر لتشريح الأنسجة وحدد تردد ليزر من 120 هرتز وتيار ليزر من 100٪ ل الدقيقة microdissection الليزر، تعيين السرعة إلى 10 وتعيين الفتحة إلى 10 ميكرومتر. ثم تعيين السلطة إلى 53.
تحميل جامع الأنسجة التي سوف القبض على الأنسجة التالية للقسم وانقر فوق زر التفريغ الثاني. استبدال جامع فارغة مع DNase و رناز خالية من 0.5 ملليلتر PCR أنابيب مسطحة الرأس تحتوي على 30 ميكرولترات من عازلة تحلل لكل أنبوب. ارجع جامع إلى الجهاز وانقر فوق متابعة المتابعة.
تحميل العينة المجهزة على المجهر وانقر فوق إفراغ في برنامج microdissection الليزر. حتى العينة على حامل الشريحة ووضع حامل الشريحة على المسرح. انقر فوق متابعة للمتابعة وحدد رسم قص في إطار قص الأشكال.
استخدام الضوابط المجهر للعثور على منطقة الاهتمام ورسم مخطط حول المنطقة من الاهتمام. ثم حدد أنبوب جامع الوجهة وانقر فوق ابدأ قص للمضي قدما microdissection الأنسجة. عندما تم تشريح جميع المناطق ذات الاهتمام، نقل أنابيب جامع من حامل على الجليد الجاف حتى انهم معالجة المصب.
للحصول على الأنسجة مع مورفولوجيا متفوقة وسلامة الحمض النووي الريبي، تم تقييم مختلف النهج في التسريب. لتشريح المناطق ذات الاهتمام ، فمن الضروري وصمة عار الأنسجة مع الأصباغ غير ضارة للرنا. في وقت لاحق من الغشاء العصبي للورم الفئران مع حل التيرود و 30 ٪ سكروز تليها حضانة بين عشية وضحاها في 30 ٪ من السكروز النتائج في الحفاظ على مورفولوجيا وسلامة الحمض النووي الريبي من أنسجة الماوس.
على الرغم من أن تثبيت الأنسجة شبه الشكلية يؤدي إلى مورفولوجيا الأنسجة عالية الجودة، تتأثر سلامة الحمض النووي الريبي سلبا. لا تؤثر الأساليب الأخرى مثل استخدام حضانة حل التيرود، أو حل التيرود بالإضافة إلى 30٪ من حضانات محلول السكروز على جودة الحمض النووي الريبي ، ولكن يتم ملاحظة دقة مخفضة في مورفولوجيا الأنسجة. إذا لم يتم تركيب الأنسجة مع تصاعد المتوسطة، وتصبح أقسام المجففة والمرفرفات يتدهور في حين تصاعد عينات الأنسجة مع 15٪ تصاعد المتوسطة الذائبة في الماء يحافظ على مورفولوجيا الأنسجة ذات جودة عالية.
الليزر التقاط microdissection المجهر التصوير يسمح اختيار أنسجة الورم لتشريح. هذه المنطقة من اختيار الفائدة ثم يسمح تشريح المناطق ذات الاهتمام داخل كل عينة الأنسجة لتحليل سلامة الحمض النووي الريبي. الحفاظ على وجودة عالية مورفولوجيا الأنسجة الورم وسلامة الحمض النووي الريبي أمر بالغ الأهمية.
حل التيرود و 30٪ السكروز perfusion مع الحفاظ بين عشية وضحاها في 30٪ السكروز يحسن بشكل كبير مورفولوجيا الأنسجة لLMD. تثبيت سريع للووما، تلطيخ وتركيب مع حل GAN هو خطوة حاسمة للحفاظ على جودة الحمض النووي الريبي ومنع الشقوق من تشكيل داخل الأنسجة. نوصي بالقطعة على الأقل 2.5 مرة 10 إلى 6 ميكرومتر مربع مجموع الورم لكل منطقة الأنسجة للحصول على كميات مناسبة من RNA لمراقبة الجودة RNA وتحليل النسخ.
LMD تمكن من تحليل مسارات الإشارات الجزيئية التي تنظم عدم تجانس الورم الدبقي والغزو الذي يمكن أن يكشف عن أهداف جديدة محتملة للتنمية الانتقالية في المستقبل في نماذج الورم الدبقي قبل الكلينيكي.
