نحن وصف طريقة فعالة من oligodendroglial تنقية الخلايا النسب والثقافة. وهذا يسمح لمعالجة الآليات الجزيئية التي تتحكم في تمايز القلة الحمراء وتفاعلاتها مع الخلايا العصبية خلال عملية الوميلين. هذه التقنية تهتز ليست مكلفة، وهو الأمثل للحصول على كمية عالية من oligodendrocytes.
هذه الثقافات تسمح بإنتاج oligodendrocyte مكيفة المتوسطة والثقافات المشتركة من oligodendrocytes مع الخلايا العصبية. التصلب المتعدد هو مرض يسببه التنسيقية دي myelination في الجهاز العصبي المركزي، والثانوية لفقدان oligodendrocytes. ثقافة Oligodendrocytes توفر أداة لفهم أفضل لكيفية تعزيز إعادة myelination.
فقط ثقافة الخلية oligodendroglial يمكن أن توفر رؤى في الآليات الجوهرية التي تنظم التطورات والبيولوجيا من oligodendrocytes. الثقافات المشتركة مع الخلايا العصبية تسمح للحصول على نظرة ثاقبة في آثارها على علم وظائف الأعضاء العصبية. للبدء ، استخدم ملقط منحنية للحفاظ على رأس الحيوان على مستوى العين.
استخدم مقصًا جراحيًا صغيرًا لإجراء شق صغير في قاعدة الجمجمة وقطع الجمجمة بعد خط وسط الدماغ. استخدام ملقط لتقشير بلطف قبالة جزأين من الجمجمة من خط الوسط. استخدم ملعقة جراحية صغيرة لإزالة الدماغ من تجويف الرأس.
وضع الدماغ في طبق بيتري 60 ملليمتر يحتوي على الجليد الباردة PBS الجلوكوز على الجليد. عرض تحت مجهر ستيريو، واستخدام ملقط غرامة لإزالة المخيخ، جذع الدماغ، والمصابيح الشمية من نصفي الكرة الدماغية. استخدام ملقط غرامة لفصل نصفي الكرة الدماغية اثنين.
استخدام ملقط غرامة لتقشير قبالة السحايات. ضعي الكورتيزات الدماغية في طبق بيتري من 60 ملليمتراً على الجليد. في غطاء تدفق لامينر، استخدم مشرط حاد لختم الكورتيز الدماغي ناعماً.
نقل الأنسجة المفروم إلى أنبوب 50 ملليلتر تحتوي على انزيم الهضم المتوسطة. احتضان لمدة 30 دقيقة في حاضنة مرطبة في 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد ذلك، استخدم ماصة لإزالة بلطف إنزيم الهضم المتوسط مع التأكد من أن الأنسجة القشرية لا تزال في الجزء السفلي من الأنبوب.
استخدام P1000 micropipette لإضافة ملليلتر واحد من DMEM 10٪ مصل العجل الجنيني و triturate بلطف الأنسجة. استخدم فلتر 70 ميكرون ومكبس حقنة ذات ملليلتر واحدة لتصفية الأنسجة القشرية في أنبوب 50 ملليلتر. شطف الأنسجة المتبقية على جدار الأنبوب الداخلي من أنبوب 50 ملليلتر عدة مرات مع DMEM 10٪ مصل العجل الجنين.
ملء أنبوب 50 ملليلتر مع DMEM 10٪ مصل العجل الجنين. أجهزة الطرد المركزي عند 423 مرة ز لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. إزالة بعناية فائقة و resuspend بيليه الخلية مع مليلتر اثنين من دموم 10٪ مصل العجل الجنين.
triturate بلطف بيليه الخلية مع p1000 micropipette ومن ثم، مع p200 micropipette. تخفيف تعليق الخلية مع حجم مناسب من دموم 10٪ مصل العجل الجنين. لوحة خمسة ملليلتر من تعليق الخلية على قارورة T-150 في كثافة واحدة من 10 مرات إلى الخلايا الخامسة لكل سنتيمتر مربع.
إضافة 20 ملليلتر من دميم دافئ 10٪ مصل العجل الجنينية لكل قارورة T-150. احتضان في حاضنة مرطبة في 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد اهتزاز العينة بين عشية وضحاها في 250 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية، حصاد زان في قارورة تحتوي أساسا خلايا النسب oligodendrocyte، ولكن أيضا، بعض الخلايا الصغيرة، وطبقة على أطباق بيتري غير المغلفة 100 ملليمتر.
احتضان أطباق بيتري لمدة 15 دقيقة في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون. وهذا يسمح بإزالة الخلايا الصغيرة من خلال التصاق سريع التفاضلي على سطح الطبق. في غضون ذلك، ملء كل قارورة T-150 مع 25 ملليلتر من الحارة، أعدت حديثا المتوسطة الثقافة واحتضان في حاضنة مرطبة في 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون حتى الهز الثاني.
بعد ذلك، نقل المابير من أطباق بيتري إلى أطباق بيتري جديدة غير مغلفة 100 ملليمتر للسماح بالتصاق الخلايا الصغيرة المتبقية. احتضان أطباق بيتري لمدة 15 دقيقة في حاضنة مرطبة في 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون. إزالة supernatant من كل اثنين من أطباق بيتري، والتي تحتوي على خلايا النسب oligodendrocyte غير الملتزم، ونقلها إلى أنبوب 50 ملليلتر.
تجاهل أطباق بيتري مطلية بالميكرغليا. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب لمدة خمس دقائق في 423 مرات ز. إزالة بعناية فائقة و resuspend بيليه الخلية مع ملليلتر واحد من بوتينشتاين ساتو المتوسطة.
تجمع جميع الكريات في أنبوب مشترك 50 ملليلتر وضبط مستوى الصوت إلى 20 أو 30 ملليلتر اعتمادا على كثافة الخلية مع بوتينشتاين ساتو المتوسطة. لوحة اثنين أو ثلاثة precoated 100 ملليمتر أطباق بيتري مع 10 ملليلتر من تعليق الخلية. احتضان في حاضنة مرطبة في 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
بعد ساعتين، قم بمسح الحطام من أطباق بيتري عن طريق تحديث كل من وسط بوتنشتاين ساتو. احتضان لمدة يومين في وسط في حاضنة مرطبة في 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد يومين، فحص الثقافة تحت المجهر.
في غطاء تدفق لارينار، في ظل ظروف معقمة، تجديد المتوسطة الثقافة مع 10 ملليلتر من 10 MPB-27 المتوسطة منخفضة دافئة. احتضان لمدة يومين في حاضنة مرطبة في 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون. لحصاد OCM، وجمع supernatant تحتوي على oligodendrocytes سرية العوامل.
تصفية تعقيم OCM باستخدام مرشح 0.22 ميكرون. في هذا البروتوكول، تم تنقية خلايا النسب oligodendrocyte من الثقافات الدبقية عن طريق هز قبالة الفلكيات وmicroglia. تحليل التعبير عن علامات مختلفة تشير إلى أن الثقافات oligodendrocyte كانت في معظمها قبل oligodendrocytes مع 90 زائد أو ناقص 4 ٪ من الخلايا الإيجابية O4 ، 85 زائد أو ناقص 7٪ NG2 الخلايا الإيجابية، و 4.7 زائد أو ناقص 2.1٪ من الخلايا الإيجابية PLP، في حين أن 7.2 زائد أو ناقص 2.5٪ من الخلايا كانت GFAP الخلايا الفلكية الإيجابية.
تمت إضافة OCM المنتجة من مثل هذه الثقافات في ثلاثة أيام في المختبر لثقافات الخلايا العصبية فرس النهر النقية. هذا العلاج يعزز تجميع البروتينات نوتال. تمت دراسة myelination من الخلايا العصبية فرس النهر من خلال إضافة oligodendroctyes في 14 يوما في المختبر.
من 20 إلى 24 يوما في المختبر، والتلطيخ المناعي لعلامات الميلين، مثل البروتين الأساسي الميلين، سمح التصور من شرائح myelin والعقد من Ranvier. برنامج تلفزيوني الأساسية مهم لإزالة السحايات. المقاصة السريعة أمر بالغ الأهمية لصلاحية oligodendroctyes وتحقيق نقاط القوة من تدفق تطبيقها مع ماصة.
يمكن إضافة وسيطة مكيفة Oligodendrocyte إلى الثقافات العصبية للحصول على نظرة ثاقبة في تأثير العوامل التي تفرز oligodendroctyes على علم وظائف الأعضاء العصبية. يمكن أيضًا إجراء الثقافات المشتركة من oligodendroctyes مع الخلايا العصبية لدراسة عملية الوثنية.
