تعتبر عملية نقل الإشارة من أهم المواضيع في مجال البحوث البيولوجية والصيدلانية. فإنه يتطلب البروتينات غشاء لنقل الإشارات إلى البروتين شريك الإشارات داخل الخلايا. تم تصميم هذا البروتوكول لإجراء فحص منهجي للمنظفات تحضيراً لمجمع إشارات يهدف إلى تحديد الهيكل.
يستخدم هذا البروتوكول التقنيات المتاحة عادة في مختبر بيولوجي راسخ ويمكن إجراءه بسهولة من قبل المبتدئين في هذا المجال. نحن تتألف هذه الأساليب للعثور على المعلمة الأكثر أهمية في إعداد مجمع البروتين الغشاء. للبدء، ذوبان 30 غراما من HEK293 GNT I ناقص خلية بيليه إلى درجة حرارة الغرفة ونقلها إلى الكأس.
إضافة 120 ملليلتر من المخزن المؤقت PBS التي تحتوي على كوكتيل مثبطات البروتياز ومتجانسة باستخدام التجانس Dounce أو المجانسة الكهربائية في 13, 000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية. ضبط مستوى الصوت إلى 150 ملليلتر مع المخزن المؤقت PBS. أضف بلطف 10٪ DDM إلى الخلايا المتجانسة لإعطاء تركيز نهائي بنسبة 1.25٪ حرك على الجليد لمدة ساعة واحدة.
بعد solubilization، الطرد المركزي الخلية lysate في أربع درجات مئوية و 150، 000 مرات G لمدة 45 دقيقة لإزالة الحطام غير المزول. نقل مفجّر إلى زجاجة 500 ملليلتر وإضافة 10 ملليلتر من 50٪ 1D4 المناعية تقارب الراتنج. خلط بلطف الخلية سولوبيليد اللزاجة والراتنج لمدة أربع ساعات أو بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية للسماح بروتين ملزمة.
تحميل خليط راتنج lysate إلى عمود مفتوح لجمع الراتنج. غسل الراتنج مع 10 مجلدات العمود من غسيل العازلة أ لإزالة مادة البروتين الملوث. إغلاق صمام وإعادة تعليق الراتنج مع اثنين من وحدات التخزين عمود من A.Next العازلة، تحت حالة الضوء الأحمر خافت، إضافة 9-cis شبكية العين إلى الراتنج resuspended إلى تركيز نهائي من 50 ميكرومولار.
مزيج بلطف في أربع درجات مئوية لمدة أربع إلى 16 ساعة في الظلام لربط شبكية العين. بعد ذلك، افتح القيمة وإزالة المخزن المؤقت من العمود. غسل الراتنج مع 20 وحدات التخزين عمود من العازلة A، تليها 15 وحدات التخزين عمود من المخزن B لإزالة الشبكية غير منضم.
Resuspend الراتنج في اثنين من وحدات التخزين عمود من العازلة B ثم تقسيم تعليق الراتنج بالتساوي إلى 10 أعمدة التخلص من 10 ملليلتر. إزالة العازلة من 10 أعمدة ثم resuspend الراتنج في كل ملليلتر واحد من العازلة C لتغيير المنظفات. احتضان لمدة ساعة واحدة على الجليد.
كرر الغسيل والاحتضان في العازلة C مرة أخرى. إزالة المخزن المؤقت من الأعمدة ثم resuspend الراتنج في 0.8 ملليلتر من العازلة elution لكل عمود. مزيج بلطف لمدة ساعتين.
جمع elution من كل عمود في أنبوب. Resuspend الراتنج في 0.7 ملليلتر من عازلة elution لكل عمود. مزيج بلطف لمدة ساعة واحدة.
جمع elution من كل عمود في نفس الأنابيب. في الظلام، تحميل البروتين المراوغة إلى cuvette الكوارتز. قياس طيف عينة البروتين.
تضيء البروتين مباشرة في cuvette لمدة دقيقتين مع تمريرة الضوء من خلال 495 نانومتر طويلة تمريرة مرشح. قياس طيف العينة المضاءة. إجراء نفس القياس لجميع عينات البروتين تنقية في المنظفات التسعة الأخرى.
كل من الدول المظلمة والمضاءة. تحت الضوء العادي، لكل حالة المنظفات إعداد 100 ميكرولترات من رودوبسين في 0.7 ملليغرام لكل ملليلتر. تحت الضوء الأحمر الخافت، إعداد 100 ميكرولترات من خليط من رودوبسين في 0.7 ملليغرام لكل ملليلتر ومصغرة GO في 0.2 ملليغرام لكل ملليلتر.
تكملة الخليط مع كلوريد المغنيسيوم ملليمولار واحد. تضيء الخليط مع الضوء من 495 نانومتر طويلة تمرير مرشح واحتضان لمدة 30 دقيقة. قم بنقل العينات إلى قارورة العينات التلقائية ووضعها في علبة العينة.
برنامج ملف أسلوب لأتمتة سلسلة SEC يعمل لكل عينة مع العينات التلقائي تحميل 77 ميكرولتررس من العينة إلى العمود وجهاز تنقية 25 ملليلتر من SEC المخزن المؤقت لكل تشغيل. سجل الامتصاص في 280 نانومتر و 380 نانومتر. جمع الكسور الذروة من rhodopsin وrodopsin-mini-GO المعقدة في حجم الاحتفاظ حول 12.9 ملليلتر.
تحليل العينات rhodopsin اليسار وكسور الذروة من rhodopsin-mini-GO المعقدة على أربعة إلى 12٪ SDS denaturing هلام التدرج مع تلطيخ الأزرق Coomassie. إعداد مزيج 200 ميكرولتر من رودوبسين في ملليغرام واحد لكل ملليلتر وPNGase F في 0.01 ملليغرام لكل ملليلتر. اخلط جيداً و احتضن على الثلج بين عشية وضحاها.
إعداد خليط 200 ميكرولتر من رودوبسين في ملليغرام واحد لكل ملليلتر و Endo F1-13 في 0.01 ملليغرام لكل ملليلتر. اخلط جيداً و احتضن على الثلج بين عشية وضحاها. تحليل نتيجة الهضم من قبل SDS-الصفحة وCoomassie تلطيخ الأزرق.
في هذه الدراسة، إنتاج إعداد تنقية صغيرة النطاق بروتين كاف لإجراء المزيد من التحليلات. الأطياف المرئية للأشعة فوق البنفسجية من rhodopsin تظهر حالة الظلام 9-cis الشبكية ملزمة rhodopsin في منحنيات زرقاء. بعد الإضاءة، 9-cis شبكية العين هو deproteinated وesomerizes في جميع عبر شبكية العين.
نسب ماصة في 280 نانومتر على ماصة 488 نانومتر وماصة في 280 نانومتر على ماصة في 380 نانومتر تصور استقرار rhodopsin تنقيتها في كل المنظفات. حجم استبعاد الكروماتوغرافيا لمحات من rhodopsin ورودودبسين ميني GO المعقدة تنقيتها في 10 المنظفات المختلفة تظهر هنا. يتم عرض ملف تعريف البروتينات علامة القياسية كتراكب جنبا إلى جنب مع عينة DDM.
يتم عرض تفسير ملامح الذروة لMNG مع السيناريو المثالي ينظر إلى DDM، DM، Cymal-6، Cymal-5، وOGNG. يُظهر الملف الشخصي المُكبّر لعينة OGNG كلاً من الرودوبسين والرودودبسين-ميني-جو المعقدة التي تم استعصاءها حول نفس حجم الاستبقاء. يتم عرض تحليل SDS-Page لعينات الريودوبسين و SEC المنقية من مجمع رودوبسين-mini-GO هنا.
هذا الرقم يظهر تحليل SDS الصفحة من deglycosylation rhodopsin مع إنزيمات إندو F1 وPNGase F. من المهم إجراء فحص المنظفات بطريقة منهجية ، بحيث يمكن مقارنة تأثير كل منظفات فردية بوضوح دون غموض. للبروتين من كمية مختلفة، يمكن أيضا أن تستخدم تحليل التحول الحراري لدراسة تأثير المنظفات على استقرار البروتين.
وبفضل هذه الطريقة، ونحن قادرون على إعداد بروتين مستقر معقدة وحل في نهاية المطاف هيكل الكريستال فقدت في تجميع الجغرافية. وقدمت رؤى هامة في خصوصية التفاعل البروتيني GPCR-G.
