تقنية التتبع الموصوفة في هذا البروتوكول يساعدنا على دراسة morphogenesis العصبية ومفاجئة الاتصال في نظام الخلايا العصبية الحركية من Drosophila. يمكن للصبغة الدهنية أن تنتشر بسرعة إلى كل جزء من الغشاء الخلوي بكثافة عالية للغاية. هذا هو السبب في بروتوكول لدينا يحل بكفاءة للعثور على هياكل من الخلايا العصبية المسمى.
إذا كان يمكن الوصول إلى محطة محور عصبي باستخدام ميكروسيبيت الحقن ، يمكن تطبيق هذه التقنية على أي خلية عصبية في مراحل اليرقات والبالغين من الذباب أو في الكائنات الحية الأخرى. إذا لم يكن لديك أي خبرة في تشريح أو استخدام ناخن دقيق العملية على العينة، يمكن أن يكون تحديا. فهم تشريح الجنين، وسوف تساعد مع التوجيه للجزء المناسب من الأدوات لتنفيذ تشريح أو dinjection.
لبدء، وإعداد وتخطيط جميع المواد جمع الجنين. إعداد جهاز الترشيح عن طريق قطع أنبوب 50 ملليلتر، وقطع فتح ثقب في الغطاء. ثم تعيين مرشح شبكة مع 100 المسام ميكرومتر في بين الأنبوب والغطاء.
إعداد حقنة صبغ micropipette وإبرة تشريح من نفس الأنابيب الشعرية مع القطر الداخلي من 1.2 ملليمتر. سحب الأنابيب مع ميكروبيبيت، سحب في 7٪ من 170 فولت الحد الأقصى للإنتاج لإنشاء إبرة حادة مع تفتق من حوالي 0.4 سم في الطول. لإعداد ميكروسيبيت حقن صبغ، نقع طاحونة مع عامل التبول ووضع الإبرة على المشبك micropipette في 25 إلى 30 درجة.
ثم خفض طرف على ثلثي نصف القطر من مركز سطح مشط. طحن الإبرة في حين أن حقنة مع أنابيب يدفع الهواء في ذلك. وضع علامة micropipette مع علامة دائمة طرف غرامة للإشارة إلى موقف الفتحة في الطرف بعد شطب لأنه يمكن أن يكون تحديا لتحديد مكان الفتحة الضيقة التي يتم تشكيلها في زاوية.
السماح للذباب لوضع البيض بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة وجمع الأنابيب مع البيض في الصباح. لجمع الأجنة، إزالة الكلور البيض على لوحة مع 50٪ التبييض لمدة خمس دقائق. بمجرد أن يتم مسح الكلورات ، صب محتويات اللوحة من خلال جهاز الترشيح أو مصفاة الخلايا لعزل الأجنة.
استخدام زجاجة ضغط من الماء لتخفيف التبييض اليسار على لوحة وجمع أكبر عدد ممكن من الأجنة عن طريق decanting الخليط في التصفية. اغسل الأجنة ثلاث إلى أربع مرات بالماء حتى تتبدد رائحة التبييض. إزالة مرشح من الجهاز وغسلها على آخر لوحة نظيفة بالماء.
ثم قم بديس الماء من الطبق الجديد الذي تعمل عليه الأجنة. استخدم ملقطًا جيدًا لتحديد خمسة إلى 10 أجنة في 15 ساعة بعد وضع البويضة ووضعها على شريط مزدوج من جانب واحد مع الجانب الظهري الذي يواجه ما يصل. أضف ملحاً من حشرات الرنين إلى بركة التشريح لحماية الأجنة من الجفاف.
استخدم إبرة زجاجية تحت مجهر تشريح لسحب الجنين من الغشاء المتوسط من الشريط على الزجاج ، مع الحرص على عدم تلف الأنسجة الداخلية للجنين. ثم قطع من خلال خط منتصف جنين واحد على سطح انها من الجزء الخلفي إلى الطرف الأمامي. قم بقلب الأنسجة الظهارية من المركز وأرفق الحافة البشرة على سطح الشريحة الزجاجية.
استخدام إبرة أنبوب متصلة مع فتح تلميح من حوالي 300 ميكرومتر لpirate أو ضربة الهواء لإزالة جذوع القصبة الهوائية الطولية الظهرية وكذلك أي الشجاعة المتبقية. استخدام 4٪ PFA وBBS لإصلاح الأجنة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة على شاكر المدارية. ثم يغسل لهم ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
وصمة عار الأجنة مع ميكرولتر واحد من الأجسام المضادة بيروكسيديز المضادة للفرس مترافق مع صبغة سيانين3 و 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لمدة ساعة واحدة على شاكر المدارية. وكرر يغسل في برنامج تلفزيوني. لملء الحقن micropipette، وضعه في حامل الشعرية.
في المكان التالي الشريحة صبغ على خشبة المسرح واستخدام micromanipulator لوضعها على الشريحة. ثم ضبط المرحلة لوضع micropipette على الصبغة. جمع الصبغة في micropipette عن طريق تحديد ضغط الحقن إلى ما بين 200 و 500 الهكتوباسكال, وقت الحقن بين 0.1 و 0.5 ثانية وضغط التعويض إلى الصفر لمدة خمس دقائق.
مرة واحدة وقد تم جمع الصبغة، وإزالة الشريحة الصبغة ووضع العينة على مرحلة المجهر. ثم زيادة ضغط التعويض إلى مجموعة من 30 إلى 60 هيكتوباسكال وخفض micropipette في العينة. استخدم العدسة 10 مرات الهدف لتحديد مكان الجنين ومحاذاة micropipette مع الجنين.
تغيير العدسة الهدف إلى غمر الماء 40 مرة العدسة. وغمر العدسة في برنامج تلفزيوني. استخدام المجهر الفلوريس للتأكد من مورفولوجيا الخلايا العصبية التي تميزت CyP Cy3 المضادة للHRP وتحديد موقع الحقن.
عندما يكون الجنين في التركيز تغيير موقف micropipette لإجراء اتصال لطيف مع غيض من محور الاهتمام. ثم استخدام المجهر حقل مشرق أثناء الحقن لرؤية قطرات الصبغة. إسقاط الصبغة في تجزئة البطن الأيمن عند تقاطع عصبي عضلي من aCC أو RP3 مع إما DID أو DiO.
استخدام السيطرة على اليد للافراج عن الصبغة وإزالة micropipette. ثم الانتقال إلى موقع الحقن التالي. احتضان العينة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة على شاكر المدارية قبل التصوير.
باستخدام ملقط غرامة، وإزالة الأشرطة من الشريحة الزجاجية. لتركيب العينة، إعداد زلة غطاء مع كمية صغيرة من الشحوم فراغ في الزوايا الأربع. وضعت بعناية على العينة، مع التأكد من تجنب فقاعات الهواء.
ادفع زلة الغطاء لأسفل لضبط المساحة من العينة للسماح بمسافة العمل بين العدسة الهدف والشريحة. إزالة أي برنامج تلفزيوني زائد مع مناديل المهمة. ختم تماما حواف زلة الغطاء مع طلاء الأظافر.
الصورة في 10 مرات و 100 مرة التكبير مع المجهر confocal ومعالجة الصور ، مع برنامج imageJ. وقد استخدم هذا البروتوكول لتسمية الوراء الخلايا العصبية الحركية aCC إغراء العضلات واحد وRP3 الخلايا العصبية الحركية innervating العضلات ستة وسبعة. الفروع Dendritic من ACC وRP3 تظهر الخلايا العصبية الحركية تداخل واسع النطاق.
كلا الخلايا العصبية هي ثنائي القطب، وإنشاء اثنين من مجموعات مختلفة من dendrites. لإثبات القدرات الكمية لهذه الطريقة، تم حساب العدد الإجمالي للنصائح dendrite في نوع البرية وDscam1 المسوخ. يتم عرض dendrites ipsilateral من aCC للنوع البرية ، ولكن لوحظت بعض dendrites إييسيراتال لتحول Dscam1.
عند محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن حجم قطرة صبغ أمر بالغ الأهمية، وهو ما يقرب من 10 إلى 20 ميكرومتر. اختبار حجم الشريط على جانبين ثم تطبيقه على موقع الحقن. باستخدام هذا الإجراء، يمكننا الاستفادة من خاصية تحويل الصور من مسبار DID للحصول على صور فائقة الدقة لغشاء البلازما.
بهذه الطريقة يمكننا دراسة التوصيف الهيكلي الفائق للأغشية المتشابكة عند الوصلة العصبية العضلية. فعلنا النقرة. قمنا بتحليل ظاهري للتشعبات aCC في سلالة متحولة ، واكتشفنا أن حقن Dscam1-Dock-Pak يحدد موقع التغرين المتجث في aCC.
