بروتوكول لدينا يسمح لعزل وفصل KRAS المجهزة بشكل صحيح في العائد العالي. إنتاج رقة فرقة أصيلة وcarboxymethylated يجعل من الممكن إجراء التجارب التي لديها KRAS في غشاء تماما كما هو الحال في خلايا الثدييات. ارتفاع العائد من البروتوكول يميزه عن العمل السابق.
نحن عادة تنقية ثلاثة إلى خمسة ملليغرام من البروتين لكل لتر من مواد التعبير. وهذا يسمح لنا بإجراء مجموعة متنوعة من التجارب البيولوجية الفيزيائية والهيكلية. تحور KRAS في 20٪ من السرطانات و 90٪ في سرطان البنكرياس.
لذا فإن وجود بروتوكول لإنتاج بروتين مُعالج بشكل أصلي مفيد جدًا لتطوير شاشات الأدوية بحيث يمكنك دراسة البروتين الفعلي كما سيكون على غشاء الخلايا السرطانية. هذا البروتوكول هو أيضا مفيدة جدا لدراسة البروتينات الأخرى التي هي فارينيلات ومعالجتها بشكل كامل في الخلايا. وعلى هذا النحو، كل ما عليك القيام به هو مبادلة خارج KRAS مع البروتين من الفائدة ووضعها في فيروس الباكولو.
الخطوات الحاسمة هي تلك حول تبادل اللونية الموجبة. استخدام العمود السليم والحد من الوقت البروتين هو في انخفاض العازلة الملح ضرورية للنجاح. فهم أن هطول الأمطار ليست نوع من العالم الثلجي الحدث يساعد على توجيه تلك الجديدة إلى البروتوكول.
يتم تعزيز هذا بإظهار الحاجة إلى تقسيم تحميل عمود تبادل الموجبة إلى عدة أحمال أصغر. بعد lysing الخلايا، وتوضيح lysate، وتنقية البروتين الهدف من قبل IMAC، وتحليل كسور البروتين باستخدام صفحة SDS وتلطيخ Coomassie. تجمع الكسور الذروة وs dialyze تجمع بين عشية وضحاها ضد اثنين من لترات من العازلة D في أربع درجات مئوية.
في اليوم التالي، قم بإزالة العينة من غسيل الكلى والطرد المركزي عند 4,000 مرة ز لمدة 10 دقائق لإزالة أي ترسب. العينة النهائية التي تم توضيحها و اضحة غالبا ما تكون ضبابية ولكن يمكن تطبيقها على العمود CEX دون مزيد من المعالجة. إعداد 20 ملليلتر تبادل العمود عن طريق غسله مع ثلاثة مجلدات العمود من العازلة G، ثم مع ثلاثة مجلدات العمود من F.Next العازلة، وتمييع 20 ملليلتر من عينة dialyzed إلى تركيز كلوريد الصوديوم النهائي من 100 ملليمولار عن طريق إضافة 20 ملليلتر من المخزن E وتطبيق العينة على عمود تبادل.
ومن الأهمية بمكان للتخفيف من كمية صغيرة من العينة بدلا من جميع مرة واحدة، وينبغي تطبيق العينات المخففة على العمود مباشرة بعد التخفيف للحد من هطول للبروتين. استمر في تحميل العمود مع عينة مخففة حديثاً حيث يقترب التخفيف السابق من نهاية الحمل. ثم غسل العمود إلى امتصاص خط الأساس 280 مع العازلة F التي تتطلب عادة وحدات التخزين ثلاثة أعمدة.
Elute البروتين من العمود مع التدرج 400 ملليلتر من العازلة F إلى 65٪ العازلة G، وجمع eluent في ستة كسور ملليلتر. بمجرد اكتمال التدرج ، استمر في غسل العمود للحصول على وحدات تخزين أعمدة إضافية 1.5 من 65٪ من العازلة G.Choose الكسور الإيجابية استنادًا إلى كل من صفحة SDS وتحليل البقع الزرقاء Coomassie وكذلك فحص أثر الأشعة فوق البنفسجية للكروماتوغرام. ثم قم بتجميع البروتين وهضمه مع Protease His6 TEV وفقًا لاتجاهات المخطوطات.
بعد الهضم وغسيل الكلى، قم بتحميل البروتين على عمود IMAC 20 ملليلتر مع المخزن المؤقت A عند ثلاثة ملليلتر في الدقيقة. جمع سبعة كسور ملليلتر خلال هذا الكروماتوغرافيا وغسل العمود مع ما مجموعه ثلاثة مجلدات العمود من العازلة A أو حتى يتم الوصول إلى امتصاص خط الأساس. Elute البروتين الهدف مع خمسة تدرج حجم العمود من المخزن المؤقت C من 0٪ إلى 10٪، وجمع سبعة كسور ملليلتر.
ثم تحديد الكسور الموجبة مع صفحة SDS. عند تحليلها مع صفحة SDS ، يجب أن تحتوي على شريط داكن يهاجر إلى حوالي 65 كيلودالتون الذي يتوافق مع بروتين الانصهار His6-MBP-tev-KRAS4b. ويهاجر الاتحاد المشترك بين البلدان وشركة FNTAb إلى 48 كيلودالطن.
خطوة CEX ضمن تنقية أمر بالغ الأهمية لأنه يقلل من مدى تحلل البروتي وإثراء البروتين المجهزة بالكامل، ولكن هو الجزء الأكثر تعقيدا من البروتوكول. نتيجة نموذجية من هذه الخطوة لها ثلاثة الذروة البارزة مع KRAS4b-FMe ولكن يمكن أن تكون ملفات تعريف elution متغير. تحليل الكتلة سليمة باستخدام ESIMS تأكيد الكتلة الجزيئية الدقيقة للبروتينات، وبالتالي نسبة النسبية من farnesylation أو carboxymethylation.
في حين أن القرعة النهائية النموذجية تحتوي على بعض KRAS4b-FARN القابلة للكشف ، كانت هذه النسبة أقل من 15٪ من حيث ذروة الارتفاع من هذا التحليل. تم استخدام التحليل الشامل الأصلي لتحديد كتلة KRAS4b المرتبطة الناتج المحلي الإجمالي. تم استبدال المذيبات العينة خلات الأمونيوم لضمان ليونة التأين مما يسمح للمجمع الأصلي بالبقاء سليمة.
تم قياس التفاعل بين KRAS4b-FMe والليبوسومات مع الرنين البلازمون السطحي للتحقق من الفرقينيلية وcarboxymethylation مطلوبة لـ KRAS4b-FMe للارتباط بالأغشية. كما هو متوقع، KRAS4b-FMe ملزمة liposomes بينما لم تتم معالجة KRAS4b. تقليل الوقت الذي يتعرض فيه البروتين لملح منخفض هو الجانب الأكثر أهمية من البروتوكول الذي يؤثر على العائد.
البروتين هو فقط لفترة وجيزة في هذا تركيز الملح المنخفض بعد التخفيف في العازلة E.The البروتين يمكن استخدامها لمجموعة متنوعة من التجارب الفيزيائية الحيوية التي تستخدم المحاكاة الغشاء مثل liposomes أو نانوديسك للتحقيق في الدهون التي تتفاعل مع KRAS. باستخدام هذه البيانات، يمكننا البدء في استقراء كيفية تفاعل KRAS مع غشاء البلازما للخلية. باستخدام تنقية KRAS-FMe، كان زملاؤنا قادرين على حل هيكل الكريستال الأشعة السينية من KRAS في مجمع مع مرافق محدد لشكل من هذا البروتين farnesylated والميثيل.
