يستخدم هذا الأسلوب Transwell المشتركة في الثقافة لدراسة إشارات الباراكرين المستخدمة من قبل الخلايا السرطانية لقمع الاستجابة المناعية. يمكن استخدام هذه الطريقة لاكتشاف اليغانندات المفرزة الجديدة ، وكذلك الأسس الآلية لآثارها القمعية المناعية. لقد استخدمنا هذه الطريقة سابقًا لإظهار كيف يمكن للعوامل التي يفرزها الورم أن تضعف النسخ الجيني المؤيد للالتهابات.
ونحن نعتقد أن هذه الأداة لها آثار واسعة النطاق في دراسة قمع المناعة المستمدة من الورم. واحدة من المزايا الرئيسية لهذه التقنية هو أنه يمكن استخدامها لدراسة إشارات الباراكرين بين الخلايا السرطانية والخلايا المناعية دون متغير يحتمل أن يكون مربكا من اتصال الخلايا إلى الخلية. هذه المنصة هي أيضا قابلة لمجموعة متنوعة من التقنيات البيولوجية الجزيئية لتحليل المصب.
بعد حصاد الضامة البريتونية، لوحة لهم مباشرة في الغرف العليا من 0.4 ميكرومتر البوليستر غشاء إدراج ثقافة المشتركة ستة بئر لوحة. ثم يضاف DMEM إلى البئر بحيث تحتوي الغرفة العليا على ملليلتر واحد وتحتوي الغرفة السفلية على 1.5 ملليلتر. احتضان لمدة ثلاثة أيام في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
أولاً، الخلايا السرطانية المتاحة تجارياً في الوسط الخاص بها، بعد اتباع أساليب زراعة الأنسجة الموصى بها. بعد ذلك، غسل الخلايا السرطانية المرتبطة مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني. إضافة 0.05٪ التربسين في EDTA واحتضان في 37 درجة مئوية حتى تنفصل الخلايا.
ثم إعادة تعليق الخلايا في الوسائط التي تحتوي على FBS. استخدام عداد الهيموسيت أو عداد الخلية لكمية العدد الإجمالي للخلايا والطرد المركزي في 220 مرات G لمدة خمس دقائق إلى بيليه. أثناء الطرد المركزي، يُطرّح الوسط من الغرف العلوية والسفلى من الضامة التي تحتوي على لوحات دعم غشاء نفاذية واستبدالها بوسيلة جديدة.
بالنسبة للغرف السفلية التي سيتم فيها وضع الخلايا السرطانية، املأ بميليلتر واحد من المتوسط بدلاً من 1.5 ملليلتر لترك حجم كاف لإضافة الخلايا. عندما يكون الطرد المركزي كاملاً، يُطلق التوسّط من خلايا الورم المُرَكَّب ويُعيد تعليق الخلايا في DMEM المكمَّلة بتركيز 300,000 خلية لكل ملليلتر. إضافة 0.5 ملليلتر من هذا تعليق الخلية إلى الغرفة السفلى من الآبار المطلوبة.
للحث على التعبير الجيني الملتهب، علاج الضامة بشكل واحد أو مشترك في الثقافة عن طريق إضافة إنترفيرون غاما بتركيز 100 نانوغرام لكل ملليلتر و LPS بتركيز 50 نانوغرام لكل ملليلتر. تغيير مدة أوقات العلاج في الثقافة حسب الحاجة. يحدث تنشيط الضامة في غضون ساعتين ، ويحدث بعض الكبت بواسطة الورم من قبل ثماني ساعات.
تنتج الثقافة المشتركة لمدة 24 ساعة قمعًا قويًا ومتسقًا مشتقًا من الورم. كتحكم سلبي، تُزرع الثقافة بشكلٍ غير مُعالج وتُترك دون علاج. وكتحكم إيجابي، تعامل الضامة ذات الثقافة الذاتية مع الانفيرون غاما و LPS بنفس التركيزات المستخدمة للعينات.
بعد انقضاء وقت الحضانة المطلوب، عزل الخلية أو حالة ثقافة المتوسطة حسب الرغبة اعتماداً على احتياجات الاختبار. لعزل الخلية لتحلل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي، يُشعّر الوسيط من كلا غرف البئر ويغسل مرة واحدة بمليلترين من برنامج تلفزيوني. تطبيق RNA lysis المخزن المؤقت إلى الغرفة العلوية التي تحتوي على الضامة.
بعد هذا، كشط بلطف الغشاء لإطلاق الخلية lysate ونقلها إلى أنبوب جمع لمزيد من المعالجة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة RNA عزل عدة. تتضمن طريقة الثقافة المشتركة الموصوفة هنا ثقافة الضامة والخلايا السرطانية دون اتصال جسدي. وتستخدم الضامة البريتونية المستزرعة في غياب الخلايا السرطانية والضوابط السلبية والإيجابية.
الضامة البريتونية المشتركة في الثقافة في وجود الخلايا السرطانية B16F10 ولكن دون تنشيط المحفزات لا تزيد من التعبير عن الجينات المرتبطة الموالية للالتهابات. وهذا يعني أن الأربطة التي تفرزها الأورام إما غير كافية للحث على التعبير الجيني المؤيد للالتهابات في حد ذاتها ، أو إذا كان هناك تنشيط مناعي عن طريق إفرازات الورم ، فإن أربطة الباراكرين كافية لقمعها إلى مستوياتها الأصلية. يوضح هذا الأسلوب المشترك في الثقافة أنه عندما يتم استزراع الضامة المستقطبة بواسطة الإنترفيرون جاما و LPS في وجود خلايا الورم ، تم تقليل قمع التعبير الجيني المرتبط بالالتهاب بنسبة تصل إلى 60 ٪ لوحظ مستوى مماثل من قمع الجينات الضامة المؤيدة للالتهابات عندما يتم استبدال خط خلية الضامة المورين J774 عن الضامة البريتونية.
وقد حددت الأعمال السابقة البروتين S كعامل الورم التي يمكن أن تمنع تفعيل الضامة، لذلك يتم استخدام نموذج دعم الغشاء المشترك بالاقتران مع lysA لمقايسة تركيز البروتين S في وسائل الإعلام مكيفة بعد 24 ساعة. في وسائل الإعلام مكيفة من انترفيرون غاما وBPS المعالجة B16F10 خلايا الميلانوما، يتم التعبير عن البروتين S في تركيز ما يقرب من 475 نانوغرام لكل ملليلتر. الضامة البريتونية تعامل في نفس الظروف أعرب عن البروتين S في ما يقرب من 61 نانوغرام لكل ملليلتر.
ومن المثير للاهتمام، عندما شارك في تربية، وتركيز البروتين S في غاما انترفيرون وLPS المعالجة بشكل جيد كان حوالي 86 نانوغرام لكل ملليلتر. وهذا يشير إلى أن إما الضامة استيعاب البروتين الذي يخفيه الورم S أو أن كمية البروتين S التي تفرزها خلايا B16F10 انخفضت بشكل كبير عندما يكون في وجود الضامة. هذه النتائج تسليط الضوء على التغيرات العميقة من تنشيط الضامة وإشارات الباراكرين عندما يتم زراعة الضامة مع الخلايا السرطانية.
يمكن لطريقة Transwell المشتركة في الثقافة الإجابة على مجموعة متنوعة من الأسئلة المتعلقة بالإشارة الباراكرين. يمكن إجراء تحليل البقعة الغربية لتحديد كيفية تغيير البروتينات التي يتم الكشف عنها بالورم مسارات الإشارات المختلفة في الضامة.
