الهدف الرئيسي من هذه المخطوطة هو تقديم إجراء تصويري للمجهر TIRF الضوئي القائم على رقاقة المطورة حديثًا والمجهر المحلي أحادي الجزيء، مثل dSTORM. المكون الرئيسي هنا هو رقاقة الضوئية التي يتم إجراؤها من سلسلة من موجه الموجات الضوئية. يتم توجيه الضوء داخل موجه الموجات الضوئية على أساس الانعكاس الداخلي الكلي.
بعض الضوء موجود على السطح في شكل موجات متألقة. تلك الموجات المتألقة، تتحلل بشكل كبير بعيدا عن السطح، مع عمق اختراق بضع مئات من نانومتر. وهذا يجعلها مناسبة لإضاءة TIRF.
تتوفر إضاءة TIRF عبر موجه الموجات الضوئية على مساحة كبيرة للغاية ، والتي يتم تعريفها من خلال هندسة دليل الموجة ، وبالتالي فهي مناسبة بشكل مثالي للتصوير عالي الإنتاجية. الفرق الرئيسي بين TIRF التقليدية وإعداد dSTORM بالمقارنة مع نهجنا هو أننا نستخدم رقاقة ضوئية لإلقاء الضوء على العينة، بدلا من إرسال الضوء من خلال عدسة التصوير الهدف. نهجنا فصل الإضاءة وجزء ضوء جمع، وفتح إمكانيات التصوير الجديدة.
ضع الرقاقة في طبق بيتري الزجاجي باستخدام مُلقط رقاقة، واغطيها بالكامل بحل هيلمانيكس بنسبة 1٪. ضع طبق بيتري على الساخنة في 70 درجة لمدة 10 دقائق. بينما لا يزال على السطح الساخن، فرك السطح مع مسحة الأنسجة غرفة نظيفة.
إزالة رقاقة من طبق بيتري. شطف مع ما لا يقل عن 100 ملليلتر من الماء ديون. شطف مع ما لا يقل عن 100 ملليلتر من الايزوبروبانول، مع الحرص على أن المذيبات لا تجف على السطح لمنع بقع التبخر.
شطف مع ما لا يقل عن 100 ملليلتر من الماء ديون. انفخ الرقاقة ببندقية النيتروجين إعداد في وقت لاحق من 150 ميكرومتر PDMS عن طريق الغزل في طبق بيتري.
استخدم مشرطًا لقطع إطار 1.5 سنتيمترًا تقريبًا من طبقة PDMS. ارفع الإطار من طبق بيتري مع ملاقط. إيداعه شقة على رقاقة نظيفة ومصقول.
العينة جاهزة الآن لبذات الخلايا. بعد بذر الخلية، قم بإزالة الشريحة من الوسائط. استخدام الأنابيب لإزالة أي السوائل الزائدة من خارج غرفة PDMS.
إزالة السائل الحالي من داخل غرفة PDMS مع pipet في حين إضافة ما يقرب من 60 ميكرولتررس برنامج تلفزيوني نظيفة في نفس الوقت. استبدال برنامج تلفزيوني مع 60 microliters برنامج تلفزيوني نظيفة، والسماح لها احتضان لمدة دقيقة واحدة. كرر الخطوة السابقة، والسماح لها احتضان لمدة خمس دقائق هذه المرة.
إزالة برنامج تلفزيوني، واستبداله مع 60 ميكرولترات من محلول الصبغة. اترك العينة لاحتضانها لمدة 15 دقيقة، ولحمايةها من الضوء. اغسل العينة باستخدام برنامج تلفزيوني باستخدام الإجراء الموصوف مسبقًا.
إزالة برنامج تلفزيوني، واستبداله مع 40 ميكروليتر من المخزن المؤقت للتصوير في نفس الوقت. ضع غطاء على القمة، ومنع فقاعات الهواء من التشكل تحتها. اضغط بلطف على غطاء الأغطية مقابل غرفة التصوير لإزالة أي وسائط زائدة.
استخدام pipet لإزالة أي وسائط الزائدة خارج الغطاء. تنظيف المنطقة خارج غطاء مع مسحة رطبة للمياه لتجنب بلورات التي شكلتها بقايا وسائل الاعلام الغمر المجفف. يتكون هذا الإصدار من الإعداد من ثلاثة مكونات رئيسية.
المجهر مع حامل مرشح، مصدر الضوء الأبيض، وكاميرا، ومسدس الهدف. مرحلة اقتران، وهو عبارة عن مرحلة بيزو ثلاثية المحاور، مع ليزر الألياف مقرونة، وعدسة اقتران. مرحلة العينة، وهي مرحلة يدوية ذات محور واحد، مع طرف والميل، مع حامل فراغ.
يتم تركيب كل من مرحلة الالاقتران والعينة على مرحلة مزودة بمحركات من محورين لترجمة العينة. ضع الرقاقة على شاحنة التفريغ ، مع جانب اقتران نحو هدف اقتران. تأكد من أن الشريحة هي تقريباً البعد البؤري واحد بعيداً عن هدف اقتران.
تشغيل مضخة فراغ. تشغيل الليزر إلى ميلي واط واحد. ضبط تقريبا ارتفاع رقاقة بحيث يضرب شعاع على حافة منه.
أطفئ الليزر قم بتشغيل مصدر الضوء الأبيض. اختر عدسة هدف منخفضة التكبير، على سبيل المثال، 10x.
ركز المجهر على دليل الموجة. ترجمة المجهر على طول الموجة لمعرفة ما اذا كان الانحياز بشكل جيد مع المسار البصري. نقل المجهر إلى حافة اقتران.
قم بتشغيل الليزر عند ميللي واط أو أقل. ترجمة المجهر على طول حافة اقتران للعثور على ضوء الليزر. ركّز الشعاع على حافة الشريحة.
اضبط مرحلة الاقتران على طول المسار البصري في الاتجاه الذي يقلل من حجم بقعة شعاع الليزر حتى يختفي. الشعاع هو الآن إما فوق أو تحت سطح رقاقة. ضبط ارتفاع مرحلة اقتران حتى يظهر بقعة شعاع وتكبير.
كرر الخطوتين السابقتين حتى يشكل الليزر بقعة مركزة. نقل بقعة مركزة إلى موجه الموجة من الفائدة. ترجمة المجهر على مسافة قصيرة بعيدا عن الحافة بحيث بقعة شعاع مركزة لم تعد مرئية.
أطفئ الضوء الأبيض. ضبط التباين. إذا كان موجه الموجة هو توجيه، وينبغي أن الضوء المتناثرة على طول موجه الموجة تكون واضحة للعيان.
ضبط محور مرحلة اقتران لتعظيم كثافة الضوء المتناثرة. أطفئ الليزر تشغيل الضوء الأبيض.
اضبط التباين إذا لزم الأمر. انتقل إلى منطقة التصوير. التركيز مع الهدف المطلوب تخيل.
أطفئ الضوء الأبيض. أدخل فلتر الفلوريسنس، ثم قم بتحويل طاقة الليزر إلى ميلي واط واحد. تعيين وقت تعرض الكاميرا إلى ما يقرب من 100 مللي ثانية.
ضبط التباين حسب الحاجة. تأكد من أن اقتران لا يزال الأمثل. حدد موقع منطقة ذات أهمية للتصوير.
تشغيل المرحلة piezo حلقات إلى متوسط خارج العقد. التقط ما لا يقل عن 300 صورة. قم بتحميل مكدس الصور الملتقط إلى فيجي باستخدام مكدس ظاهري.
من قائمة الصور في فيجي، اختر مكدسات، و Z Project. احسب صورة TIRF عن طريق اختيار نوع الإسقاط، متوسط الكثافة. قم بتشغيل الليزر إلى ملليواط واحدة، ثم قم بتعيين وقت تعرض الكاميرا إلى 30 مللي ثانية.
ضبط التباين والتركيز. زيادة قوة الليزر حتى يتم ملاحظة الوميض. تكبير منطقة صغيرة من العينة.
ضبط التباين. التقط بعض الصور لمعرفة ما إذا كانت الوميض منفصلة بشكل جيد. ضبط وقت تعرض الكاميرا للوميض الأمثل.
بدوره على مرحلة بيزو حلقات. تسجيل كومة صور لا تقل عن 30000 إطار، وذلك حسب كثافة الوميض. افتح فيجي، ثم قم بتحميل مكدس dSTORM كصور افتراضية.
اضبط التباين إذا لزم الأمر. استخدم أداة المستطيل لتحديد المساحة التي تريد إعادة بنائها. فتح تحليل تشغيل في البرنامج المساعد ThunderSTORM في فيجي.
ضبط إعدادات الكاميرا الأساسية في ThunderSTORM، المقابلة لجهازك. المعلمات الافتراضية المتبقية عادة ما تكون مرضية. ابدأي إعادة الإعمار
تتم تصفية قائمة التعريب التي توفرها برامج إعادة البناء لإزالة التعريبات غير اِنّت. يتم تطبيق تصحيح انجراف إضافية إذا لزم الأمر. والفرق الرئيسي بين التصوير القائم على الرقاقة والتصوير التقليدي هو في الأجهزة وحيازة البيانات.
ولذلك يمكن تقييم جودة الصور المعاد بناؤها بنفس الطريقة التي يتم بها تقييم صورة من مجهر تجاري فائق الدقة. وبما أن هناك عدة مؤشرات موجية تستخدم في وضعية متعددة، فإن الصورة الناتجة قد تظهر مع ذلك استثارة غير متجانسة إذا تم جمع عدد قليل جداً من الصور. ويظهر ذلك في اللوحة a.
وينبغي أن تؤدي زيادة مقدار أنماط الإثارة إلى إثارة غير متجانسة، كما هو مبين في الفريق ب. هنا لدينا صورة الكبد الخلوية خلية البطانية، مع غشاء البلازما المسمى الفلورسنت. اللوحات a و b هي صور محدودة الانعراج.
يُظهر اللوحة c صورة محدودة الانعراج للانكسار في اللوحة b. لوحة d يظهر صورة dSTORM من نفس المنطقة. خلايا البطانية الجيوب الأنفية في الكبد لها مناظير نانو الحجم في غشاء البلازما، والتي هي واضحة للعيان في صورة فائقة الدقة في لوحة د.
واحدة من المزايا الرئيسية للتصوير فائق الدقة القائم على الرقاقة هو مجال الرؤية الكبير الذي يمكن تحقيقه. لوحة يظهر 500 ميكرون من قبل 500 ميكرون كبيرة dSTORM صورة للخلايا البطانية في الجيوب الأنفية في الكبد مع ميكروتوبولين المسمى الفلورسنت. يُظهر اللوحة b الزبن الأرجواني من اللوحة a، مع كل من الصور المحدودة للانعراج والوضوح الفائق للمقارنة.
يُظهر اللوحة c اللون الأخضر من اللوحة a. دقة الصورة الملتقطة هي 77 نانومتر. في هذا الفيديو، قمنا بتنفيذ حقل كبير من عرض TIRF وتصوير dSTORM للخلايا البطانية الجيوب الأنفية في الكبد باستخدام رقاقة ضوئية للإضاءة.
أسلوبنا هو أقل تعقيدا وأكثر إحكاما وأكثر مرونة من الطريقة التقليدية لأداء TIRF باستخدام هدف المجهر من الفتحة العددية المحددة سلفا وانخفاض مجال الرؤية. المجهر المحلي ، مثل dSTORM ، هو واحد من العديد من تقنية التصوير فائقة الدقة التي استكشفناها باستخدام رقاقة ضوئية. على سبيل المثال، يمكن أن يكون الضوء محصورًا بإحكام داخل مادة دليل الموجات الضوئية ذات المؤشر العالي الانكسار أكثر مما هو ممكن باستخدام عدسة التصوير الموضوعية.
وقد وجدت هذه الخاصية من الإضاءة رقاقة تطبيق في زيادة قرار من أسلوب المجهر البصرية القائمة على كثافة التقلبات والمجهر الإضاءة المنظم. بالإضافة إلى ذلك ، فوائد رقائق الضوئية أيضا من التصغير ، وفعالية التكلفة ، والإعداد البصرية بسيطة. كونها تقنية متكاملة يجعلها متوافقة مع غيرها من الوظائف البصرية على رقاقة.
تماما, هذا يجعل هو يمكن ل إعادة تجهيز داخل تقليديّة حيود-مجاهر محدودة, يسمح ل فائقة -قرار في منخفضة حساب.
