يسمح هذا البروتوكول بالتحوير المتزامن للعديد من الرنا الرنا في الخلايا الكئية ويستند إلى طريقة بسيطة ومرنة للغاية تقلل خطوات الاستنساخ الجزيئي. هذه التقنية لها آثار على دراسة التفاعلات الوظيفية الحمض النووي الريبي الصغرى في المختبر، ولكن الأهم من ذلك أنه يوفر منصة للاستخدام أكثر فعالية من الحمض النووي الريبي الصغير في العلاج. لقد طورنا بشكل رئيسي واستخدمناه في سياق سرطان الدماغ ، لكنه ينطبق على أي أمراض حيث تنطوي على تغييرات متعددة في التعبير الجيني.
لقد اختبرنا جيناتنا المتحولة الاصطناعية في نماذج أخرى مثل خطوط سرطان الثدي والغدة الدرقية التي تظهر قابلية تكرار هذه التقنية. المعرفة الأساسية للمعلوماتية الحيوية وبيولوجيا الحمض النووي الريبي الصغير مفيدة لهذا البروتوكول ، ولكن ليس من الضروري. نهج المعلوماتية الحيوية مهم لتحديد تركيبات الحمض النووي الريبي الصغرى ذات الصلة و TRK-11، في حين أن الإلمام بمعالجة الحمض النووي الريبي الصغرى مهم بشكل كبير لفهم كيفية تجميع هذه الحمض النووي الصغير المختلفة في مجموعات الحمض النووي الاصطناعية التي يمكن معالجتها بنجاح مرة واحدة مستقرة إلى خلايا محددة.
لطبق المعطف ، قم أولاً بحل بولي -D-ليسين في الماء بتركيز 100 ميكروغرام لكل ملليلتر. صب الحل في الطبق في كمية من ميليلتر واحد من الحل لكل 25 سم مربع سطح. دوامة الطبق للتأكد من تغطية الطبق كله.
بعد ست ساعات التعرق حل بولي-D-ليسين وشطف مرتين مع برنامج تلفزيوني. الخلايا الجذعية العصبية العصبية في طبق من 100،000 خلية لكل خمسة ملليلتر من المتوسطة، إما في الخلايا الجذعية المتوسطة، التمايز الفلكي المتوسط أو وسط التمايز العصبي. بعد طلاء الخلايا، ضع الطبق في حاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية و5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون لمدة أسبوع واحد، ثم قم بإجراء تحليل تعبير الحمض النووي الريبي الجزئي وفقًا للمخطوطة.
لثقافة GBM-34 الخلايا الجذعية الشبيهة بالورم الدبقي، ابدأ بـ 10 مرات إلى الخلايا الخامسة وخمس ملليلتر من المتوسطة العصبية في قارورة مرفق منخفضة تبلغ 25 سنتيمترًا مربعًا. ضع القارورة في حاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية و5 في المئة من ثاني أكسيد الكربون. بعد 48 ساعة من الطلاء، إضافة تركيزات مضاعفة من الحمض النووي alkylating عامل تيموزولوميد كل سبعة أيام.
تبدأ مع إضافة خمسة TMZ micromolar تكملها في خمسة ملليلتر المتوسطة لمدة خمسة أيام. بعد خمسة أيام، وإزالة المتوسطة واستبدالها بوسيلة جديدة دون temozolomide للسماح للخلايا على قيد الحياة لاسترداد. بعد 48 ساعة، إضافة 10 ميكرومولار تيموزولوميد واحتضان لمدة خمسة أيام أخرى.
كرر علاج تيموزولوميد المضاعفة حتى يتم الوصول إلى تركيز 100 ميكرومولار على الأقل وتصبح الخلايا مقاومة للدواء. بعد تحريض المقاومة ، تكمن الخلايا باستخدام 1 ملليلتر من كاشف Lysis. استخراج مجموع RNA وتحليل التعبير عن RNAs الصغيرة المحددة وفقا للمخطوطة.
للحصول على الهدف المتوقع لكل RNA الصغرى التي تم تعريفها سابقا، واستخدام أدوات التنبؤ استهداف الحمض النووي الريبي الصغير. من الصفحة الأولى من TargetScan، حدد الحمض النووي الريبي الصغير من الفائدة من القائمة المنسدلة التي تم ملؤها مسبقًا. انقر فوق الزر إرسال.
قم بتنزيل قائمة الأهداف الناتجة كجداول بيانات باستخدام رابط جدول التنزيل. لتقليل فرص التنبؤات الإيجابية الخاطئة، لا تشمل سوى الأهداف ضمن عمود المواقع المحفوظة وتحليل المصب. برامج تنبؤ RNA الصغرى إضافية الحصول على مزيد من الصرامة وتشمل فقط الأهداف التي هي مشتركة بين جميع الخوارزميات.
ثم، افتح جناح ToppGene 20. لتقييم لإثراء المسارات المشتركة بين كل RNA الصغير، لصق قائمة الأهداف التي تم الحصول عليها في إطار مجموعات الجينات التدريب. انقر على رمز HGNC كنوع الدخول.
انقر فوق إرسال وابدأ. يوفر البرنامج جدول إخراج يوضح أهم فئات GO لقائمة الجينات المدخلة. لتحديد مساهمة كل RNA الصغرى في تنظيم مسار مشترك أو عملية الخلوية، وفتح وظيفة مخطط فين المقدمة في المعلوماتية الحيوية والتطورية علم الجينوم الموقع.
تحقق من كل هدف تم الحصول عليها مقابل القائمة الكاملة للجينات المشاركة في العملية الخلوية المحددة. إذا كان الهدف رسول RNAs لكل RNAs الصغيرة من الفائدة في النوافذ المعنية ، وتحميل نسخ لصق القائمة. اسم كل قائمة مع معرف فريد.
انقر فوق إرسال. يوفر البرنامج مخرجات مرئية من مخطط فين مع عدد من الجينات في كل قطاع بالإضافة إلى قائمة كاملة من RNAs رسول لكل مجموعة فرعية وتقاطع مجموعات. لتجميع الـ RNAs الصغير المختار في جينة وظيفية عبر، الحصول على سقالة محورة وراثيا على أساس موضع الكتلة miR-17-92.
الحصول على تسلسل النوكليوتيدات من متصفح الجينوم الفرقة. حدد ما يقرب من 800 قاعدة الزوج تسلسل الأساسية التي تشمل جميع دبابيس الشعر RNA RNA الصغيرة المشفرة الستة من موضع وما لا يقل عن 200 نوكليوتيد يحيط تسلسل كلا من المنبع والمصب من تسلسل الأساسية. قم بلصق التسلسل في أي برنامج لتحرير الكلمات.
تحديد تسلسل كل واحد من دبابيس الشعر الأصلية الستة من خلال استرجاعها في قاعدة miR. وضع علامة على كل واحد من هذه التسلسلات ضمن نطاق تسلسل أساسي تم تحديده مسبقًا. أي تسلسل بين كل دبوس الشعر تمثل تسلسلات الفواصل.
بعد ذلك ، الحصول على تسلسل دبوس الشعر من الحمض النووي الرنا الصغيرة التي تهدف إلى أن تكون أكثر من التعبير عنها في الجينات عبر من قاعدة miR. لاحظ بعناية النوكليوتيدات المحددة التي هي في مواقع شق المعالج الصغير. حذف تسلسل دبوس الشعر الأصلي من تسلسل الأساسية باستثناء ثلاثة إلى خمسة النيوكليوتيدات في كل من الخمسة وينتهيك من كل دبوس الشعر الذي سيكون بمثابة مقبول لدبابيس الشعر الجديدة.
لصق تسلسل دبوس الشعر من RNAs الصغيرة المطلوبة لتحل محل دبابيس الشعر المحذوفة سابقا. إضافة تسلسلات تقييد المطلوب في كلا المناطق المرافقة للجين عبر لتسهيل دون الاستنساخ في ناقلات التسليم من اختيار. تحقق من أن تسلسلات التقييد المختارة غير موجودة داخل التسلسل نفسه.
للتحقق من بنية ثنائي الأبعاد من الجين المتحول، نسخ تسلسل كامل المعدلة وراثيا في برنامج التنبؤ بنية RNA برنامج RNA Webfold. حدد إعدادات البرنامج القياسية وانقر فوق المتابعة. تحليل الناتج الرسومية، وخاصة لوجود دبابيس الشعر محددة جيدا في وجود هياكل الجذعية التي تقطعت بها السبل مزدوجة التي لا تقل عن 11 نواة قريبة إلى موقع شق المعالج الصغير.
أيضا، ابحث عن عدم وجود نقاط التفريع داخل تسلسل دبوس الشعر. عند هذه النقطة، الجين المتحول هو على استعداد لإنتاجها عن طريق تخليق الجينات ومستنسخة في ناقلات التسليم المطلوبة. سمحت هذه الطريقة توصيف وحدة من ثلاثة RNAs الصغيرة التي يتم باستمرار إلى أسفل ينظم في أورام الدماغ, التي هي شارك في التعبير عنها على وجه التحديد خلال التمايز العصبي.
وقد تأكدت أنماط التعبير المشترك لوحدات الحمض النووي الريبي الجزئي أثناء الإجهاد السمية الجينية، واقترحت وجود نشاط تآزري قوي بين هذه الرنا الثلاثة الصغيرة. يمكن للجين المتحول المصمم أن يلخي في وقت واحد التعبير عن الرنا الصغير الثلاثة في خلايا الورم الأرومي الدبقي ، سواء في المختبر أو في الجسم الحي ، مع تدخل كبير في بيولوجيا الورم وقابلية قابلية الترجمة الواعدة للتطبيق. بالإضافة إلى ذلك، كان التجمع المعدل وراثيا وظيفية أيضا في نموذج سرطان الثدي.
المتطلبات الحاسمة لهذا البروتوكول هي الحفاظ على الحجم الأصلي للشق المعالج في الجينات المتحولة. وتأكد من أن هيكل حلقة الجذعية من دبابيس الشعر RNA micro chimeric يتم الحفاظ عليها. مع هذه الطريقة، يمكننا تركيز جينات الحمض النووي الريبي الصغيرة متعددة نشطة بيولوجيا في تسلسلات الحمض النووي قصيرة جدا والتي يمكن حرفيا أن تكون تركيبها في vitroly أي ناقلات التسليم لاستخدام العلاج الجيني.
هذه الطريقة مثالية لدراسة التفاعل الوظيفي بين مختلف الحمض الرنا الصغير والتدخل في مسارات خلوية متعددة العوامل المعقدة التي تتطلب خلاف ذلك تركيبات متعددة من الأدوية.
