هذه الطريقة سوف تساعد على فهم وتنفيذ تقنيات المختبر اللازمة لتحديد نشاط اثنين من ميكرورنا في خلايا سرطان الرئة في المختبر. سرطان الرئة هو السبب الرئيسي للوفاة المرتبطة بالسرطان في جميع أنحاء العالم. هنا، نقدم تقنيات تمتد من منهجيات المختبرات الأساسية إلى بروتوكولات أكثر تعقيدا، مثل تحليل التعبير الجيني وmicroRNA بروتينات الأجسام المضادة، وتستخدم خصيصا لتحديد تأثير الإجراءات microRNA.
الأساليب التالية سوف تساعدنا على الإجابة على الأسئلة الرئيسية المتعلقة بتأثير اثنين microRNAs، ميكرورنا 143 وmicroRNA 506، على تنظيم دورة الخلايا في خلايا سرطان الرئة. نقدم تقنيات مختبر مختلفة، مثل نقل الخلايا، واستخراج الحمض النووي الريبي، وكمية في الوقت الحقيقي PCR وتحليل ميكرورنا. ونأمل أن يسهم عرضنا في استكمال هذه التحليلات بنجاح.
أولاً، مقعد الخلايا المستزرعة في قارورة مناسبة كافية لاستخراج الحمض النووي الريبي والبروتين، لأداء التعبير الجيني باستخدام تحليل qPCR أو مجموعة صغيرة. ثم احتضان بين عشية وضحاها مع وسائل الإعلام تستكمل مع 10 في المئة FBS و 1 في المئة ستريبتوميسين البنسلين في المئة. في اليوم التالي، إعداد عينة ميكرورنا لtransfection عن طريق تمييع ميكرورنا 143 وmicroRNA 506 في وسائل الإعلام بتركيز 100 نانوموللار لكل منهما.
أخرج القارورة من الحاضنة وأزل الوسائط. غسل مع 1X برنامج تلفزيوني. جميع الضوابط غير المعالجة سوف تحتوي على وسائل الإعلام غير مكتملة فقط مع الخلايا.
احتضان الخلايا مع وسائل الإعلام transfection لمدة ست ساعات في حاضنة. بعد ست ساعات، قم بإزالة الوسائط واستبدلها بأربعة ملليلترات من الوسائط الجديدة والكاملة. حصاد الخلايا بعد 24 ساعة و 48 ساعة عن طريق التربسينسيس.
المقبل، وغسل مرتين مع 1X برنامج تلفزيوني في كل أنبوب وإزالة افر. من أجل إجراء استخراج الحمض النووي الريبي في وقت لاحق، وتجميد الخلايا في ناقص 80 درجة مئوية. تم إجراء استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام عدة RNA، بعد تعليمات الشركة المصنعة.
أولا، إزالة الأنابيب من ناقص 80 درجة مئوية والسماح للذوبان. إضافة 300 ميكرولترات من عازلة التحلل والماصات صعودا وهبوطا لكسر غشاء الخلية. إضافة حجم متساو من 100 في المئة الإيثانول فائقة النقاء.
ثم اخلط جيدا ووضعها في عمود منفصل. الطرد المركزي وإزالة تدفق من خلال. إضافة 400 ميكرولترات من الغسيل والمخزن المؤقت والطرد المركزي لإزالة العازلة.
إضافة 5 ميكرولترات من DNAse 1 مع 75 microliters VNA العازلة الهضم في كل عينة، واحتضان لمدة 15 دقيقة. ثم غسل العينة مع 400 microliter RNA الإعدادية العازلة. المقبل، وغسل مرتين مع العازلة غسل RNA.
الآن، إضافة المياه خالية من النوى إلى العمود، والطرد المركزي ومن ثم جمع الجيش الملكي النيبالي. قياس تركيز الحمض النووي الريبي. في هذه المرحلة، يمكن إرسال اثنين من ميكروغرام عينة RNA لتسلسل الحمض النووي الريبي.
إعداد cDNA وفقا للبروتوكول الموصوف في قسم النص، وذلك باستخدام ثيرموسيكلير. إعداد حلول التمهيدي إلى الأمام وعكس مع DNAse RNAse خالية من المياه إلى تركيز 10 ميكرومولار. إعداد مزيج رئيسي لكل جين ليتم اكتشافه وفقًا لعدد العينات.
بالنسبة لكل عينة من عينات cDNA، تكون كمية التفاعل وفقًا للجدول الموضح في النص. ضع كل عينة في آبارها. بالنسبة لـ qPCR ، من الجيد دائمًا إعداد مستند Excel مع تخطيط لوحة 96 جيدًا ، من أجل تتبع العينات.
لكل عينة وتحليل الجينات، أداء رد فعلهم في ثلاث نسخ، أو على الأقل مكررة. ختم لوحة من البلاستيك مع شفافة، وتسرب البلاستيك واضحة بصريا. تجنب لمس طبقة رقيقة من البلاستيك مع الأصابع، وهذا يمكن أن تنتج إشارة كاذبة.
تدور بسرعة لوحة لخلط كل من الكواشف إلى الجزء السفلي من آبارها. المقبل، تشغيل لوحة عينة باستخدام كمية، في الوقت الحقيقي PCR الجهاز. احصل على قيم CT التي تم إنشاؤها بواسطة جهاز qPCR، ثم قم بتحليل التعبير الجيني النسبي.
نقل الخلايا كما هو موضح في القسم السابق من هذا الفيديو. حصاد الخلايا من كل عينة في منفصلة، 15 ملليلتر أنابيب معقم ل تريبسينسيس. بعد ذلك ، قم بغسل الخلايا مرتين مع PBS 1x ، عن طريق الطرد المركزي في 751G لمدة خمس دقائق ، ثم قم بإزالة المابير.
إعادة تعليق وكسر لوحة عن طريق إضافة 200 ميكرولتر الجليد الباردة 1X برنامج تلفزيوني من خلال ماصة. إضافة ملليلترين من 70 في المئة الإيثانول الجليد الباردة، قطرة الحكمة إلى الأنبوب، في حين دوامة الأنبوب بلطف لإصلاح الخلايا. احتضن أنابيب لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ووضعها في أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة.
إزالة الأنابيب من أربع درجات مئوية والطرد المركزي. إضافة 2ml الجليد البارد برنامج تلفزيوني ودوامة، ومن ثم إزالة supernatant عن طريق الطرد المركزي. إضافة 500 ميكرولتردات من 1x برنامج تلفزيوني تحتوي على يوديد بروبيد وريبونوكleaز A مع تركيز 50 و 200 ميكروغرام لكل ملليلتر، على التوالي، في كل عينة، وتحضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
نقل العينات إلى أنابيب مناسبة، وحماية من الضوء، وتشغيلها على تدفق مقياس المقاييس. هذه التجربة هي لتحديد جميع دورات الخلايا proteins'expression تغيرت من قبل العلاج ميكرورنا. جمع عينات البروتين وفقا للإجراءات المذكورة في قسم transfection، وقياس مع BCA المقايسة.
إزالة الشرائح من ناقص أربع درجات مئوية قبل ساعة واحدة من التجربة لجلب إلى درجة حرارة الغرفة وإزالة الرطوبة. خذ 70 ميكروغرام من عينات البروتين واحضر شرائح العينة وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة ، والتي يتم وصفها أيضًا خطوة بخطوة في قسم النص. هنا أن نلاحظ، غسل السليم من الشرائح مع المياه ديوند نقية جدا خطوة أخرى هامة، وهذا سوف يساعد على الحد من خلفية الشرائح.
بالإضافة إلى ذلك، من الأهمية بمكان في هذه التجربة عدم تجفيف الشرائح عينة حتى الخطوة النهائية. وأخيرا، مسح الشريحة باستخدام جهاز الصفيف الصغير وتحليل البيانات. وقد تم تحليل qPCR للعينات المعالجة بالمجهر النووي الريبي الريبي لتحديد التعبير الجيني لل CDK1 و CDK4 و CDK6.
هذه الجينات تنظيم دورة الخلية من الخلايا الطبيعية والسرطانية، وقد استهدفت كوسيلة لتثبيط تطور الورم. وأظهرت البيانات تأثير الهادوري لهذه الجينات بسبب العلاج مع ميكرورنا 143 و 506. وأظهرت بيانات توزيع دورة الخلية من قياس التدفق زيادة سكانية في مرحلة G0 وG1، وانخفاضاً سكانياً في المرحلة S بسبب تأثير المعالجة الدمجية للميكروبرنا 143 و506.
كشف تحليل مجموعة صغيرة محددة دورة الخلية تغيرات تعبير البروتين من ما يقرب من 60 الجينات. خريطة الحرارة الممثلة المشار إليها downregulation على مستوى البروتين من الجينات المتعددة اللازمة لتطور دورة الخلية والانتشار، مثل CDK2، هيلين 1 و 3، RE2F1. وعلى النقيض من ذلك، فإن البروتينات المعترف بها عادة من قبل تأثيرها المثبط نمت كانت upregulated.
وعلى الرغم من أن النتائج شبه كمية، وأن هناك حاجة إلى مزيد من التحليل، فإن تحليل المصفوفة الدقيقة يقدم لمحة سريعة عن نشاط المسار. نعتقد، بعد مشاهدة هذا الفيديو، سوف تكون قادرة على إجراء التجارب الأساسية، ومعقدة جيدا، مختبر التي سوف تساعدك على تحديد نشاط ميكرورنا في الخلايا.
