يسمح هذا البروتوكول بتسمية خلايا ependymoglial الفردية في تيلينسيففالون سمك الحمار الوحشي لتمكين مراقبتها على المدى الطويل ، وكذلك التلاعب بمسارات محددة بطريقة مستقلة عن الخلايا. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بتسمية خلية واحدة بطريقة سريعة وفعالة ، بالإضافة إلى تحرير الجينات والتلاعب في مسار الإشارة بطريقة مستقلة عن الخلايا. هذه الطريقة تسمح للتحقيق في أسئلة بيولوجيا الخلية الأساسية، على سبيل المثال، حول delamination الخلية، والحفاظ على التوازن الظهاري، وتماثل انقسام الخلايا.
ابدأ باستخدام جهاز سحب الإبرة لإعداد الشعيرات الدموية الزجاجية. استخدام نصائح microloader لملء شعري الزجاج المعدة مع عشرة ميكرولترات من حل plasmid. ثم اضغط على القائمة تغيير الشعرية "على جهاز الحقن للسماح الإبرة ليتم تحميلها في حامل إبرة.
ثم قم بتبديل جهاز الحقن من تغيير الشعيرات الدموية إلى وضع الحقن. ثم، باستخدام منظار مجسم مع التكبير أربع مرات، والملقط Finden، قطع فقط غيض من شعري. ثم تطبيق الضغط على دواسة القدم للتأكد من أن حلول البلازميد يعمل بسهولة من الإبرة دون عوائق.
عندما تكون الإبرة جاهزة، قم بنقل سمكة حمار وحشي من خزان تربية الحمار إلى حاوية من محلول التخدير. وانتظر بضع دقائق حتى تهدأ حركة الخياشيم. اضغط على الجانب الظهري الأسماك مخدر حتى على اسفنجة ما قبل تربيت تحت stereomicroscope، واستخدام الفولاذ المقاوم للصدأ تشريح microknife مع حافة القطع 40 ملليمتر وسمك 0.5 ملليمتر لخلق بعناية ثقب صغير في الجمجمة السمك في الجانب الخلفي من تيلنففالون، بجوار حدود tectum البصرية.
إمالة الأسماك حسب الضرورة وتوجيه غيض من الشعرية الزجاجية نحو الجمجمة في الزاوية الصحيحة لتسهيل اختراق طرف شعري من خلال ثقب. ثم، بعناية فائقة إدراج غيض من شعري في حفرة من خلال طبقة الخلية الابينديم الظهرية، حتى تصل إلى البطين من الدماغ، وتطبيق الضغط على دواسة القدم لمدة 10 ثانية تقريبا لتقديم ما يقرب من 1 ميكرولتر من حل البلازميد. يمكن تأكيد نجاح التسليم من خلال مراقبة انتشار السائل الأخضر في جميع أنحاء البطين.
غطّي تيلينسيفالون السمك بكمية صغيرة من هلام الموجات فوق الصوتية. لكهربية من الحيوان حقن البلازميد، وإزالة الاسفنج من مجموعة حقن وغمر الجانب الداخلي من electrotips في هلام الموجات فوق الصوتية. ضع رأس السمك بين الأقطاب الكهربائية، مع القطب الموجب في الجانب البطني من الرأس والكترود السالب على الجانب الظهري.
ثم، في حين لا يزال عقد جسم السمكة في الاسفنج، اضغط على الأقطاب الكهربائية بلطف ودقة ضد التيلنفالون وإدارة التيار مع دواسة القدم، وعقد الأقطاب الكهربائية في مكانها حتى يتم الانتهاء من جميع البقول الخمسة. إذا كان الكهربائي ناجحا، يمكن ملاحظة بلازميد المسمى خلايا ependymoglial واحدة بين الخلايا ependymoglial غير plasmid المسمى. اعتمادا على كفاءة عملية الكهربة، قد يكون عدد أكبر أو أقل من خلايا ependymoglial المسمى.
ومع ذلك، ينتج البروتوكول المُثبت عددًا أكبر من الخلايا المسماة من البروتوكولات المنشورة سابقًا. لاحظ أن أعلى كثافة للخلايا المسماة تميل إلى الظهور في الغالب في الجانب البطيني الداخلي لكلا نصفي الكرة الأرضية بسبب الطريقة التي يتم بها توزيع السائل البلازمي المحقون بين نصفي الكرة الأرضية. في هذا الفيديو، يتم عرض نصف الكرة الأرضية واحد من تيلفينفلون سمك الحمار الوحشي في 3D، حيث خلايا ependymoglial مع العمليات الراديوية، هي في أرجواني عندما لوحظ من الجانب.
من خلال التكهرب المشترك مع آخر plasmid أن التسميات nuclei، ويمكن ملاحظة انقسام الخلية من الخلايا ependymoglial. ينتج عن الإكتروليت غير الناجح عدد منخفض جداً أو لا توجد خلايا ependymoglial المسماة. ومع ذلك، فإن الخلايا الـديندية الظهرية هي الأكثر احتمالاً أن تكون موسّاة.
سوما أكبر في التكعيب وأنها لا تمتلك عمليات ممدود الراديو كما هو واضح من وجهة نظر جانبية من طبقة الخلية ependymoglial. الخلايا المسماة tdTomato-mem هي على الأرجح خلايا ependymal، والتي تقع فوق طبقة من ependymoglia. في المقابل، فإن إدخال tdTomato-mem التعبير عن بلازميد إلى الخلايا ependmyoglial الفردية النتائج في التعبير tdTomato-mem بالإضافة إلى وضع العلامات الخلية الأولية.
أهم الأشياء التي يجب تذكرها هي قطع طرف الشعيرات الدموية واختراق الطبقة ependymal أثناء الحقن بحيث ينتشر السائل في جميع أنحاء البطين. هذه التقنية تمكن من رصد طويل الأجل من الخلايا ependymoglial واحد من خلال في التصوير في الجسم الحي، وبالتالي تأسيس دورها في تجديد الدماغ، فضلا عن واسعة في الارتباط الجيني في الجسم الحي.
