القلب يحتوي على سكان غير متجانسة من الخلايا المناعية التي تلعب أدوارا حاسمة في التهاب القلب، فضلا عن إصلاح. من أجل فهم عدم تجانس الخلايا المناعية واكتساب المزيد من التبصر في وظيفتها ، من المهم أن يكون لديك طريقة تسمح باسترداد هذه الخلايا من القلب. يمكن أن تساعد هذه التقنية في الكشف عن تنوع الخلايا المناعية وغير المُمَنية التي توجد في القلب الصحي أو المريض.
هناك ثلاث مزايا رئيسية لهذه التقنية. أولا ، انها سير عمل واحد بسيط يؤدي إلى توليد تعليق خلية واحدة من أنواع الخلايا المختلفة في غضون ثلاث ساعات من الوقت. ثانيا، أنه يؤدي إلى انتعاش عالية من السكان الخلايا المناعية وغير المناعة قابلة للحياة.
وثالثا، انها طريقة متعددة جدا ويمكن تطبيقها على أنسجة القلب في الأنواع الأخرى كذلك. من المهم الانتباه إلى كمية الأنسجة المستخدمة في رد فعل الهضم الواحد. استخدام مقص معقمة، تشريح عينة الأنسجة من جدار apical أو الجانبي من البطين الأيسر في المالحة الباردة أو HBSS.
تشريح بعناية من الدهون epicardial وتريال tendineae من العينة. مع مساعدة من شفرة معقم أو مقص، تشريح قطع الأنسجة إلى قطع تزن حوالي 200 ملليغرام. بعد القتل الرحيم الماوس، وفتح تجويف الصدر بمساعدة مقص حاد.
استخدام الهيموستات حادة لرفع القلب صعودا. اثقب القلب بـ PBS البارد باستخدام إبرة قياس 25 متصلة بحقنة خمسة ملليلتر. perfuse حتى يظهر القلب مبيض في اللون.
إزالة القلب ووضعها في طبق بيتري العقيمة على الجليد. ضع 200 ملليغرام من قطع الأنسجة القلبية البشرية أو قلب المورين في طبق بيتري معقمة. ناعما min الأنسجة باستخدام شفرة معقمة أو مقص.
لإعداد الهضم، في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر، إعداد حجم الهضم النهائي من ثلاثة ملليلتر لكل قطعة الأنسجة القلبية البشرية أو قلب مورين واحد مع الإنزيمات collagenase الأول، DNase الأول، وهيالورونيداز بتركيزات من 450، 60، و 60 وحدة لكل ملليلتر. إضافة 2.5 ملليلتر من DMEM في الأنبوب. مع مساعدة من ملقط نظيفة، ووضع الأنسجة المفروم ناعما في كل أنبوب رد فعل.
تخلط جيدا من قبل دوامة لطيف. اجست لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية في حاضنة اهتزاز تعيين إلى سرعة التحريض منخفضة إلى متوسطة. بعد ساعة واحدة من الهضم، أخرج الأنابيب من الحاضنة ووضعها على الجليد.
قم بإعداد 50 ملليلتر أنابيب مخروطية مع مصفاة 40 ميكرون خلية على القمة. الرطب المرشحات مع مليلتر اثنين من الإنزيم تعطيل العازلة. المقبل، إلغاء تنشيط الانزيمات الهضم عن طريق إضافة ثمانية ملليلتر من الإنزيم تعطيل العازلة لكل أنبوب الهضم.
ثم صب الناتج 13 ملليلتر من مجموع خليط من خلال 40 ميكرون مصفاة الخلية في أنابيب مخروطية 50 ملليلتر. نقل العينات المصفاة مرة أخرى في أنابيب مخروطية 15 ملليلتر جديدة. تدور العينات في 400 مرات ز لمدة ست دقائق في أربع درجات مئوية.
تجاهل supernatant ترك 0.5 ملليلتر من وسائل الإعلام. Resuspend بيليه الخلية عن طريق pipetting لطيف وإضافة ملليلتر واحد من ACK تحلل العازلة. دوامة لطيف الأنبوب واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق لأداء خلايا الدم الحمراء.
بعد خمس دقائق في المخزن المؤقت ACK، إضافة تسعة ملليلتر DMEM إلى العينة. وضع الغطاء مرة أخرى على الأنابيب وعكس بلطف الأنابيب لخلط. تصفية من خلال مصفاة 40 ميكرون خلية وجمع الترشيح في أنابيب مخروطية 15 ملليلتر.
الطرد المركزي الأنابيب في 400 مرات ز لمدة ست دقائق والتخلص من الفائق. إضافة ملليلتر واحد من العازلة FACS وإعادة تعليق بيليه. ثم نقله إلى أنبوب microcentuge 1.5 ملليلتر.
مرة أخرى في جهاز طرد مركزي 400 مرة ز لمدة خمس دقائق. تجاهل الماوسين و resuspend بيليه في 100 ميكرولترات من العازلة FACS. تعليق خلية واحدة الآن على استعداد لتلوين الأجسام المضادة.
أضف لوحة الأجسام المضادة البشرية النموذجية إلى عينات القلب عند تخفيف واحد إلى 50. استخدام الأجسام المضادة المختلفة للخلايا الوماضة و الضامة القلب مورين. احتضان لمدة 30 إلى 40 دقيقة في أربع درجات مئوية في الظلام.
يضاف ملليلتر واحد من حاجز FACS ودوامة وبرفق والطرد المركزي بمعدل 400 مرة ز لمدة خمس دقائق. كرر هذه الخطوة الغسيل للمرة الثانية. ثم إعادة تعليق العينة في 350 ميكرولترات من المخزن المؤقت FACS وإضافة DAPI للوصول إلى تركيز نهائي من ميكرومولار واحد.
وقد أصبحت العينات جاهزة الآن لتحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية. في هذا البروتوكول، تم تحقيق عزل الضامة من الماوس و عضلة القلب البشرية. هذا الرقم يبين غير المجهزة والمعالجة الإنسان LVAD الأساسية.
وقدم مخطط الغسور لتدفق الفرز من CCR2 السلبية وCR2 الضامة البشرية الإيجابية من عضلة القلب البشرية وكذلك لD45 الخلايا القوية السلبية من اعتلال عضلة القلب الإقفي الإنسان. صور رايت الملون FACS فرز CD45 إيجابية وCD45 تظهر الخلايا السلبية سليمة غشاء الخلية مما يدل على صلاحية. كما نجح مخطط البوابات لفرز الضامة من قلب الماوس.
وزن الأنسجة المستخدمة للتفاعل الأنزيمي أمر بالغ الأهمية للهضم الفعال. لا تستخدم أكثر من 200 ملليغرام من الأنسجة لتركيزات انزيم المشار إليها في البروتوكول. بعد هذه الطريقة، يمكن أن تكون الخلايا مثقفا لتشيز في المختبر المقايسات.
يمكن فرز الخلايا لتسلسل RNA المجمع أو تسلسل الخلايا المفردة. وقد خدم هذا الأسلوب كتقنية لا تقدر بثمن في اكتشاف التغايرية الضامة التي لم يتم التعرف عليها من قبل التي هي موجودة في قلب الإنسان صحي أو المريض. باستخدام هذه الطريقة متبوعة بتسلسل الخلايا المفردة، تجري دراسات للكشف عن كيفية اختلاف مختلف الخلايا المناعية وغير المناعية بين القلب المريض مقابل القلب السليم.
