لقد طورنا طريقة سهلة لاختبار عينات الطعام لمختلف أنواع السموم C perfringens. ونحن مهتمون بشكل خاص في انتشار السموم B و D التي تنتج السم ابسيلون. يسمح بروتوكولنا بسهولة الإثراء والكشف عن مختلف أنواع السموم C perfringens دون استخدام غرف اللاهوائية أو الحاضنات مع زراعة فرعية محدودة.
ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة لاختبار التربة, المياه, عينات البراز, وأكثر من ذلك. ومن خلال العملية سيكون زوها أنور وسامانثا ريغان، فنيان من المختبر. تبدأ من خلال إعداد تعديل perfringens السريع المتوسط، أو دورة في الدقيقة.
الجمع بين المكونات وفقا لاتجاهات المخطوطات، وautoave الخليط في 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. السماح للوسط لتبرد إلى ما يقرب من 40 درجة مئوية، ثم إضافة D-cycloserine إلى تركيز النهائي من 440 ملليغرام للتر الواحد. نقل Aseptically دورة في الدقيقة إلى 15 ملليلتر أنابيب المخروطية، وتخزينها في أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
قبل استخدام، وسخّن المتوسطة إلى 37 درجة مئوية. عند جمع العينات التي سيتم اختبارها، قم بنقل الطعام إلى المختبر وفقاً لتوجيهات المخطوطات. إذا لم يتم اختبار فورا، يمكن تخزين المواد الغذائية في ناقص 20 درجة مئوية.
يرجى ملاحظة نوع الغذاء وبلد المنشأ، وكذلك أي معلومات أخرى ذات صلة. لاختبار الطعام، نقل ما يقرب من غرام واحد إلى اثنين إلى طبق بيتري العقيمة، و mince ناعما مع شفرة الحلاقة العقيمة أو مشرط. تلقيح في 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر، وخلط جيدا.
حدد للخلايا الخضرية عن طريق نقل خمسة ملليلترات من خليط الغذاء برنامج تلفزيوني إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر مع 10 ملليلتر من دورة في الدقيقة وإغلاق الغطاء بإحكام. حدد للغائط عن طريق تسخين المليلترات الخمس المتبقية من الخليط إلى 85 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. ومن ثم نقله إلى أنبوب مع دورة في الدقيقة وإغلاق الغطاء بإحكام.
لضمان الاختلاط الكامل، دوامة وعكس الثقافات دورة في الدقيقة الغذاء. ثم، ختم بإحكام الأنابيب المخروطية ولف الأغطية مع فيلم البارافين لخلق بيئة اللاهوائية. احتضان الأنابيب بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية ونلاحظ أي عكر أو تخمير في صباح اليوم التالي.
إعداد التربتوز Sulfite Cycloserine أو TSC أجار وفقا لتوجيه الشركة المصنعة، ومن ثم استخدام تقنية شطيرة لتطعيم ذلك مع الثقافات دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها. إعداد الطبقة الأساسية من لوحات عن طريق نقل 10 ملليلتر من أجار المنصهرة لأطباق بيتري العقيمة والسماح لها لترسيخ. الحفاظ على ما تبقى من TSC أغار في 40 درجة مئوية ل الطبقة العليا، ونقل بعناية 100 ميكرولترات من ثقافة دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها إلى قاعدة أجار.
قد تكون بعض الثقافات تحت الضغط بسبب التخمير، لذا تأكد من ارتداء جميع معدات الحماية الشخصية المناسبة. انشر الـ inoculine مع حبات زجاجية معقمة أو موزع خلايا، واسمحوا أن يتم امتصاص دورة في الدقيقة في Agar لمدة خمس إلى 10 دقائق. ثم، استخدم ماصة مصلية لنقل بعناية 20 ملليلتر من TSC أجار المنصهرة إلى لوحة.
استبدال غطاء طبق بيتري والسماح TSC أغار لترسيخ تماما في درجة حرارة الغرفة، ثم عكس الطبق واحتضانه في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. إذا لزم الأمر، قم بإجراء عمليات تخفيف تسلسلية لثقافة RPM قبل التلقيح في TSC Agar. بعد الحضانة، وفحص لوحات لنمو البكتيريا.
قد تكون البكتيريا الهوائية موجودة على سطح أغار ، في حين سيتم تضمين البكتيريا اللاهوائية في Agar. سوف الكبريتيت الحد من البكتيريا تحويل أغار المحيطة السوداء، ومستعمرات C perfringens ممكن سيكون أسود وجزءا لا يتجزأ من أغار. إذا كان هناك كمية كثيفة من النمو البكتيري الهوائية على سطح اللوحة، استخدم مكشطة الخلايا لإزالة المستعمرات من المناطق المحددة.
استخدام معقمة العين استخدام واحد القطارة لنتف مستعمرات C perfringens يشتبه من أغار، مع التأكد من طرد الهواء قبل ثقب أغار. نقل المستعمرات إلى 10 ملليلتر من دورة في الدقيقة الطازجة في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. يمكن أخذ عينات من مستعمرات متعددة من نفس اللوحة إلى ثقافات دورة في الدقيقة منفصلة.
تأمين بإحكام أغطية أنبوب مخروطي، والتفاف عليها في فيلم البارافين، واحتضان لهم بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. C perfringens هو BSL كائنين. من المهم استخدام احتياطات السلامة المناسبة في جميع الأوقات، خاصة عند فتح الثقافات دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها وإزالة التلوث بعناية والتخلص من وسائل الإعلام المستخدمة.
في اليوم التالي، وإزالة الثقافات بين عشية وضحاها وفحصها لعكر والتخمير، ثم المضي قدما مع استخراج الحمض النووي. عكس بلطف ثقافة دورة في الدقيقة لتفريق أي البكتيريا استقر وفتح الأنبوب بعناية. نقل ملليلتر واحد إلى أنبوب microcentrifuge بيليه البكتيريا عن طريق الطرد المركزي.
غسل بيليه مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني عقيم. إذا استقر الجيلاتين غير المهضوم على أعلى البكتيريا ، زغب تشغيله عن طريق التحريض مع برنامج تلفزيوني. التعرق بلطف الجيلاتين وبرنامج تلفزيوني وإعادة تعليق بيليه البكتيريا المتبقية مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني جديد.
من المهم إزالة أي الجيلاتين بيليه مع اضطراب محدود من بيليه الخلية. قد يؤدي الفشل في إزالة الجيلاتين إلى تثبيط استخراج الحمض النووي والـ PCR. الطرد المركزي البكتيريا لمدة 10 دقائق وpirate بعناية طارد.
ثم قم بإجراء استخراج الحمض النووي باستخدام مجموعة مصممة خصيصًا للبكتيريا الإيجابية الغرامية. استخدم الحمض النووي على الفور أو قم بتخزينه عند درجة حرارة 20 درجة مئوية. إجراء PCR على الحمض النووي المستخرج لتحديد ما إذا كانت الثقافات إيجابية لC perfringens السموم.
استخدام C perfringens الحمض النووي كتحكم إيجابي لضمان أن جميع الكواشف PCR تعمل. تشغيل PCR وفقا لاتجاهات المخطوطات وتحليل المنتجات مع agarose هلام electrophoresis. وقد استخدم هذا البروتوكول لاختبار ما مجموعه 216 عينة من الأغذية تم شراؤها من متاجر البيع بالتجزئة في نيويورك.
وشملت العينات عينات مختلفة من اللحوم، وعينات من الدواجن، وعينات من المأكولات البحرية. C perfringens نوع B تم استخدامه كتحكم إيجابي. ووجد أن 15 إلى 20٪ من الأطعمة العينة اختبار إيجابي ل perfringens C.
ومن بين العينات الإيجابية البالغ عددها 34 عينة، احتوت 31 عينة على السم ألفا، وكانت عينة واحدة تحتوي على سم ألفا وبيتا وإبسيلون. واثنين من العينات تحتوي على ألفا والسمو ابسيلون. لقد طورنا طريقة سهلة لاختبار عينات الطعام لمختلف أنواع السموم C perfringens.
ونحن مهتمون بشكل خاص في انتشار السموم B و D التي تنتج السم ابسيلون.
