وقد سبق للباحثين أن ولّد فيروسات الأنفلونزا المؤتلفة التي تعبر عن مراسلي البروتين الفلوري أو الإنارة الحيوية. جزء من تعبيرنا الوحيد عن جينات المراسلين في فيروس الأنفلونزا يحد بشدة من استخدامه في التجارب. يصف بروتوكولنا استخدام فيروس الأنفلونزا ثنائي التقارير الذي يعبر عن كل من جينات المراسل الفلورية والإنارة الحيوية ، وبالتالي يتغلب على قيده.
والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي استخدام فيروس واحد من فيروسات الأنفلونزا المؤتلفة في المختبر وفي دراسات في الجسم الحي. عند تنفيذ هذه التقنية ، فإن الحقن السريع لركيزة لوسيفيراز والتخطيط السليم للتعامل مع الفئران أمر مهم ، لأنه يتم استقلاب الركيزة بسرعة. أيضا، ينصح حلق الفئران لتحسين الكشف عن إشارة الإضاءة الحيوية.
لتصيب الفئران، تبدأ من خلال إعداد BIRFLU في 1X PBS. الحفاظ على الفيروس على الجليد حتى التطعيم. تحقق من عدم وجود رد فعل قرصة إصبع القدم للتأكد من أن الماوس هو تخدير، وتطعيم ذلك intranasally مع تخفيف بيرفلورو المعدة.
تأكد من أن جميع الفئران تتنفس بشكل صحيح قبل إعادتها إلى أقفاصها. افتح برنامج التصوير واضغط على تهيئة، ثم قم بتعيين المعلمات التي سيتم استخدامها للتصوير. لرصد الفئران المصابة مع بيرفلور ، حلق صدورهم لتحسين الكشف عن إشارة الإضاءة الحيوية.
مرة واحدة يتم تخدير الفئران، واستخدام إبرة قياس 22 لإدارة الرجعية المدارية 100 ميكرولترات من الركيزة Nluc لوسيفراز، المخفف واحد إلى 10 في برنامج تلفزيوني. مباشرة بعد الحقن، ووضع الحيوانات في غرفة العزل مع صدرهم تواجه. ثم ضع غرفة العزل في أداة التصوير، واغلق الباب، واستحوذ على الصور.
بعد التصوير، قم بإعادة الفئران إلى أقفاصها ومراقبتها حتى تتعافى تمامًا. استخدم أداة عائد الاستثمار لبرامج التصوير لتحليل بيانات الإضاءة الحيوية المكتسبة عن طريق تعيين منطقة ذات أهمية والنقر على القياس. لإجراء التصوير السابق لرئتي الماوس، قم بجمع الرئتين وفقًا لاتجاهات المخطوطة، وابدأ برنامج الحصول على الصور، وتعيين معلمات التصوير.
بمجرد تهيئة الجهاز، ضع الرئتين في علبة خلفية سوداء، وتأكد من أن الأنسجة منفصلة عن بعضها البعض. أدخل الدرج إلى المصوّر، واغلق الباب، والحصول على الصور. بعد التصوير، قم بإزالة الأنسجة على الفور وتخزينها على الجليد عند أربع درجات مئوية إذا تمت معالجة العينات في نفس اليوم.
إذا كانت ستتم معالجتها في وقت لاحق، تجميدها بسرعة في أنبوب على الجليد الجاف، وتخزينها في 80 درجة مئوية. لمعالجة الصور، حدد أداة ROI، وارسم مناطق الاهتمام حول كل من الرئتين الفردية، وانقر على قياس. وقد تم تميز بيرفلور في المختبر عن طريق تحديد مستويات فينوس، Nluc، وNP التعبير في الخلايا المصابة.
يتم الكشف عن التعبير الزهرة وNLuc فقط في الخلايا المصابة من قبل BIRFLU، في حين يتم التعبير عن NP في كل من PR8 البرية من النوع والخلايا المصابة بيرفلورو. لا يوجد تعبير يلاحظ في الخلايا المُصابة بالهوك. وعلاوة على ذلك، تم قياس نشاط Nluc في تربية الأنسجة في 24، 48، 72، و 96 ساعة بعد العدوى.
يتم الكشف عن ذلك في وقت مبكر من 24 ساعة بعد العدوى، وزيادة مستويات التعبير في 96 ساعة. ويمكن أيضا أن يثبت أن حركية التكرار من بيرفلورو مماثلة لفيروس PR8 من النوع البرية. تمتلك شركة بيرفلورو القدرة على التعبير عن كل من جينات المراسل الفلورسنت والإنارة الحيوية، ويمكن تقييم العلاقة بين الاثنين باستخدام التصوير في الجسم الحي والتصوير البدين لرئة الماوس.
أظهرت رئات الفئران المصابة بـ BIRFLU إضاءة حيوية عالية في الجسم الحي وفلوريسنس السابق. كما تم تحديد الثرات الفيروسية والاستقرار الوراثي لـ BIRFLU في الجسم الحي. وأظهرت اللوحات على الفيروسات من الرئتين الماوس أن الفيروس يمكن أن تشكل لويحات والتعبير عن كل من الجينات مراسل.
ويمكن أيضاً استخدام مادة بيرفلورفلور لتقييم فعالية مضادات الفيروسات ومضادات الفيروسات ضد الأنفلونزا. وكان الناتج من هذه المقايسات كلها مرتبطة مع بعضها البعض وسريعة وسهلة للقيام به.
