هذا البروتوكول مهم لأنه يسمح للمستخدم بإنشاء نظام التعبير الجينومي الذي يمكن أن يخضع للصق بديل وفي هذه الحالة شكل RNAs التعميم التي يمكن اختبارها لوظيفتها ورابطة المرض. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها ستمهد الطريق للآخرين لاستخدام هذا البروتوكول في البيولوجيا الجزيئية والاستنساخ عند دراسة الربط البديل في تشكيل الحمض النووي الريبي (RNA) ووظيفته. نصيحتي لشخص يحاول هذه التقنية للمرة الأولى سيكون لتحسين شروط PCR.
تشغيل التدرجات أو تنفيذ هبوط PCR مع درجات حرارة مختلفة التلاهم وأوقات التمديد. عادةً أطول شظايا أكثر من ستة كيلو بايت سوف تمتد كيلو بايت واحد لكل دورة ودرجات حرارة مختلفة الوَرَد ستحتاج إلى اختبار للحصول على أفضل تضخيم. إن عرض هذا الأسلوب أمر بالغ الأهمية لأنه سيعطي المستخدمين تمثيلًا بصريًا أفضل للجوانب الأكثر صعوبة في الإجراء خاصةً توليد ال أوليات.
لبدء هذا الإجراء، قم بتحميل متصفح الجينوم UCSC واستخدامه لتحديد العناصر المتكررة اللازمة لتشكيل الحمض النووي الريبي الدائري ودمجها في الانشاءات. الأهم من ذلك، يجب أن تكون ال التمهيدية للتضخيم خارج العناصر المتكررة. لصق تسلسل الجيش الملكي النيبالي الدائري في البحث BLAT الإنسان واختيار الكائن الصحيح.
إرسال التسلسل، انتقل إلى طريقة عرض المستعرض، وتصغير أجهزة ضبط الوقت 1.5 أو حسب الاقتضاء. بعد ذلك، قم بالماوس فوق العناصر المتكررة لتحديد نوعها الفرعي في نافذة عائمة. عناصر Alu في خط جيب.
استخدم الزر المسارات الافتراضية أسفل الإطار لإعادة تعيين المستعرض إذا تم الحصول على صورة غير صحيحة. أولا الذهاب إلى عرض، والحمض النووي على الخط العلوي من متصفح الجينوم USCS لتحميل تسلسل الحمض النووي هو مبين في النافذة. في خيار تنسيق التسلسل، حدد خيارات الحالة/اللون الموسعة.
حدد الحالة الافتراضية كأدنى وحدد حالة تبديل لـ NCBI RefSeq. حدد التسطير والغامق والماتيكي لـ RepeatMasker. انقر فوق إرسال.
سيكون هناك exons كأحرف كبيرة وsontrons كأحرف صغيرة. تحقق من حدود exon/intron. إذا كان المستعرض يظهر عكس تكملة، والعودة وحدد عكس مربع تكملة حتى يتم عرض حدود exon /intron الصحيح.
بعد ذلك، نسخ الملف مع الاتجاه الصحيح إلى مستند معالجة النصوص وتسليط الضوء على exons. حدد الأجزاء التي سيتم تضخيمها مع التأكد من أن intron لا يبدأ أو ينتهي في منطقة متكررة حيث أن ال التمهيديات في هذه المناطق لن تضخم تسلسلات محددة. للبدء، استخدم أداة ويب لتصميم ال أوليات للاستنساخ.
بالنسبة للتسلسل المتجهي، أضف موقع الإدراج كناوكليوتيد أخير ثم قم بإضافة الشظايا لاحقاً. منذ ترقيم المتجهات لا يبدأ مع موقع الإدراج معطى موقع الإدراج في المتجه يتم وضع الجزء المتلقين للانطلاق أمام تسلسل المنبع. ضبط التمهيدي إذا كانت نقاط الانصهار الخاصة بهم أكثر من أربع درجات مئوية وبصرف النظر لا تعمل في التضخيم.
في هذه الدراسة، يتم استنساخ جينات المراسل التي تولد RNAs دائرية وتحليلها. يتم فصل منتجات PCR الأمثل على جل agarose 1٪ يحتوي على 1X هلام الأخضر. وتمثل الشرائط الفردية منتجات PCR التي ستستخدم في تجميع الحمض النووي الأنزيمي.
ثم يتم قطع هذه العصابات من هلام وتنقية. لا يتم تشغيل المنتج PCR المنقى صحيح إلى الحجم المتوقع مع الأخضر هلام حتى يتم فصل المنتجات أيضا على 1٪ agarose هلام التي هي في وقت لاحق ملطخة بروميد الإتيهيديوم لضمان المنتجات هي الحجم الصحيح. للبدء، حدد مجموعة تجميع الحمض النووي الأنزيمية.
الجمع بين المتجه وإدراج في نسبة الولي من واحد إلى اثنين. المقبل، إضافة 10 ميكرولترات من الحمض النووي الجمع ماجستير المزيج. احتضان العينات لمدة 60 دقيقة في 50 درجة.
ذوبان الخلايا المختصة على الجليد أثناء الحضانة. يجب أن تكون الخلايا في حجم 50 ميكرولترات. بعد ذلك ، تحويل الخلايا المختصة مع رد فعل الجمعية الكلية.
إضافة اثنين microliters من المنتج المبردة تجميعها إلى الخلايا المختصة. مزيج عن طريق نفض الغبار بلطف الأنبوب أربع إلى خمس مرات. لا دوامة.
وضع الخليط على الجليد لمدة 30 دقيقة. سخني الخليط عند درجة حرارة 42 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. ثم ضعه مرة أخرى على الجليد لمدة دقيقتين.
بعد ذلك، إضافة 950 ميكرولترات من درجة حرارة الغرفة SOC وسائل الإعلام إلى الأنبوب. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة بينما تهتز في 300 دورة في الدقيقة. خلال هذا الحضانة، دافئة اثنين من لوحات الاختيار التي تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة.
بعد الحضانة، الطرد المركزي أنبوب التفاعل في 10، 000 ز لمدة 30 ثانية ل بيليه الخلايا وطبقة من أصل 25٪ من الخلايا على لوحة اختيار واحد و 75٪ على الآخر. احتضان هذه اللوحات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. قبل أن تبدأ في عملية نقل الرضّع، تحقق من الحمض النووي الخاص بك عن طريق خلاصة التقييد.
هنا، يتم قطع minigene ممثل يحتوي على exons 9 من خلال 12 مع إنزيمات تقييد المشار إليها لاستبعاد إعادة الكومبينيشنات الرئيسية. بالنسبة إلى التحلل، قم أولاً بحل هيدروكلوريد البولي إيثيلين الخطي في الماء بتركيز مليغرام واحد لكل ملليلتر عند درجة هيدروكلورية 2. استخدام هيدروكسيد الصوديوم لتحقيق درجة الحرارة تصل إلى سبعة ومعقم تصفية الحل مع مرشح ميكرومتر 0.22.
تخزين الحل في أربع درجات مئوية حتى جاهزة للاستخدام. ثم تقسيم الخلايا إلى آبار من لوحة ستة جيدا والسماح لهم تنمو بين عشية وضحاها في وسائل الإعلام DMEM التي تحتوي على 10٪ FBS. في اليوم التالي، aliquot ميكروغرام واحد من الجين المبلغ عنها في أنبوب معقمة وإضافة 200 ميكرولترات من كلوريد الصوديوم معقم 150 ملليمولار.
مزيج من دوامة. بعد ذلك، إضافة حل البولي إيثيلينيمين إلى هذا الخليط بنسبة ثلاثة ميكرولترات من البولي إيثيلينمينيمين لكل ميكروغرام واحد من الحمض النووي. جهاز طرد مركزي لفترة وجيزة لجمع العينات في الجزء السفلي من الأنبوب.
احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. ثم إضافته مباشرة إلى خلايا HEK293. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
في اليوم التالي، استخدم RNA عزل عدة لعزل الجيش الملكي النيبالي لRT-PCR. يتم تضخيم cDNA من عينتين مشتقتين من أنسجة الدماغ البشرية مع التمهيديات RNA دائرية تدور حول تاو إكسون 1210 عكس وظرفي تاو إكسون 1211 إلى الأمام. في حين أن الفرقة المتوقعة المقابلة لـ TAU RNA الدائرية وينظر ، والفرق القوية الأخرى هي القطع الأثرية التي لا تتطابق مع الجينوم البشري.
وتُكرَّر هذه التجربة مع ظروف PCR متطابقة، ولكن تم إجراء النسخ العكسي فقط مع التمهيدي العكسي لـ tau exon 1210. يتم تضخيم النطاق المتوقع فقط والتحقق من صحته من خلال التسلسل. ثم يتم التعامل مع الجيش الملكي النيبالي RNASE الذي يزيل RNA خطي.
الجيش الملكي الريبي الدائري هو الكشف بعد العلاج في حين أن الجيش الملكي النيبالي الخطي يعطي لم يعد إشارة يمكن الكشف عنها. يتم عزل الحمض النووي الريبي 24 ساعة بعد transfection وتحليلها من قبل RT-PCR. التضخيم من mRNA تاو خطي يظهر اثنين من العصابات بسبب الربط البديل من exon 10.
تتغير نسبتهم إلى التعبير المفرط عن عوامل الربط. التضخيم من التعميم 1210 تاو الجيش الملكي النيبالي يظهر الاعتماد على تاو CIRC RNA التعبير على التعبير عن بعض عوامل الربط وخاصة CDC2 مثل كيناز CLK2 و بروتين ريال 9G8. أهم شيء أن نتذكر عند محاولة هذا الإجراء هو تصميم وموقع التمهيدي عند بناء minigene.
التمهيدي لا ينبغي أن تكمن في العناصر المتكررة، وسوف تحتاج إلى أن تكون الأمثل في ظل ظروف مختلفة اعتمادا على جزء يجري تضخيمها. بعد هذا الإجراء، سيتم اختبار الأساليب الأخرى التي يمكن تنفيذها وظيفة RNAs التعميم. يمكن للمستخدمين اختبار الترجمة أو عزل البروتينات لتحديد وظيفة لرنا دائري محدد يهتم المستخدم.
مهدت هذه التقنية الطريق لاستخدام شظايا الجينوم في نظام minigene التي يمكن أن تعبر أكثر عن RNAs التعميم مما يسمح للمستخدم لاختبار وتحديد وظيفتها وفي بعض الجوانب ارتباطهم بالأمراض. الآثار المترتبة على هذه التقنية يمتد نحو العلاجات المحتملة والتشخيص لمرض معين، على سبيل المثال tauopathies، الأمراض العصبية المرتبطة بأمراض تاو. لقد اكتشفنا أن بروتين تاو المرتبط بالميكروتوب، والمعروف باسم MAPT، يولد RNAs دائرية التي نعتقد أنها تساهم في أمراض المرض وهذه الطريقة تسمح لنا بدراسة كاملة هذه RNAs التعميم وتحديد وظيفتها وعلاقتها بالمرض.
ويمكن لهذه الطريقة أن توفر نظرة ثاقبة لفهم أفضل للرنا رنا دائرية، ما هي وظائفها، والدور الذي قد تلعبه في بعض الأمراض. ويمكن تطبيق هذه الطريقة في استنساخ genes الأخرى التي تعبر عن RNAs دائرية عبر الأنواع حيث يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في وظيفتها. تضخيم منتجات PCR يثبت أن يكون الأكثر صعوبة مع شظايا طويلة تضخيمها من الحمض النووي الجينومي، جنبا إلى جنب مع وجود عناصر متكررة متعددة داخل جزء.
