في هذا الفيديو، نتصف مجموعة من الإجراءات المصممة لاستجواب تأثير العدوى الفيروسية والاستجابة المناعية الناتجة عن ذلك باستخدام نموذج مورين لعدوى زيكا. هذا البروتوكول مهم لأنه يسمح لنا بتطوير فهم ميكانيكي للعدوى والمناعة من خلال تحديد مدى انتشار الفيروس في جميع أنحاء الجسم ، والوصول إلى الحواجز المادية والوصول إلى الأنسجة. وتتيح هذه التقنيات فهماً مفصلاً للأمراض الفيروسية وتوفر القدرة على تشريح آلية الحماية التي توفرها اللقاحات أو العلاجات.
هنا نبرهن على هذه الطريقة باستخدام فيروس زيكا عدوى الفئران، ولكن يمكن تطبيق هذه الطريقة على مجموعة من العدوى الفيروسية بما في ذلك الفيروسات الفلافية الأخرى مثل فيروس حمى الضنك وفيروس ألفا مثل فيروس شيكونغونيا. حصاد أعضاء الجهاز العصبي المركزي يمكن أن يكون تحديا، لذلك من المهم للشخص أن يخطط لتجربة صغيرة، وتكون على استعداد لممارسة التقنيات مسبقا. يسمح هذا البروتوكول بالتشريح السريع للانتشار الفيروسي داخل نماذج الحيوانات الصغيرة مع القدرة على تصور البيانات التجريبية والتقاطها وتخزينها.
من المهم أن تظهر بصريا هذه الطريقة للسماح للمجرب لفهم كيفية حصاد أجهزة الجهاز العصبي المركزي. من المهم أيضًا رؤية مستوى التقاء الخلايا وشدة البؤر الفيروسية. للبدء، استخدم ملقط لإزالة قذف الماوس المصاب.
قطع رأس الماوس مع مقص، تليها إزالة الذراعين والساقين. لحصاد الدماغ، استخدم مقص لا غرانج المسننة لقطع الجمجمة من خلال ماغنوم الهدّان. قشر قبالة الجمجمة مع ملقط، مغرفة من الدماغ مع ملعقة.
باستخدام مقص حاد قوي، وإزالة العظام المحيطة العمود الفقري، ثم قطع عبر عظم الحوض لفضح الفقارية في مستوى القطنية. ثم، إزالة أكبر قدر ممكن من العضلات المحيطة العمود الفقري. بعناية، ضع طرف مشط من الإبرة داخل التجويف الفقري، وتجنب الضغط المفرط لمنع إبرة التعدي على الجسم الفقري.
عقد بقوة لممارسة الضغط على الجسم الفقري والإبرة، واضغط على المكبس حقنة لطرد الحبل في طبق بتري. قم بنقل الحبل الشوكي في الأنبوب المسمى على الفور، ثم ضعه في حمام الثلج الجاف لمزيد من التجانس. من أجل التجانس، إضافة ملليلتر واحد من DMEM وتجانس العينة في BeadBeater.
بعد التأكد من أن الأجهزة متجانسة، وأجهزة الطرد المركزي وعينات aliquot على الجليد وتخزينها في ناقص 80 درجة مئوية حتى الحاجة. في يوم الفحص ، قم بإزالة العينات المتجانسة من الفريزر ناقص 80 درجة مئوية ، والسماح لهم بالذوبان. مع العينات على الجليد، وتمييع فيروس زيكا عشرة أضعاف في البئر الأولى من لوحة التخفيف واستخدام ماصة متعددة القنوات للقيام بتخفيفات المسلسل عشرة أضعاف أسفل لوحة، وتغيير النصائح في كل مرة.
عن طريق إضافة 20 ميكرولترات من عينة إلى 180 ميكرولترات من وسائل الإعلام النمو، وتغيير نصائح ماصة بين كل تخفيف. إعداد لوحة تشكيل التركيز عن طريق إزالة وسائل الإعلام من أسفل مسطحة أعدت 96-جيدا لوحة تغطي فيروسيلس. لمنع monolayer من الجفاف ، على الفور إضافة 100 ميكرولترات من الفيروس تخفيف إلى كل بئر في viroplate.
استخدم نفس مجموعة النصائح التي تضيفها من أدنى مستوى إلى أعلى تركيز. صخرة لوحة جانب إلى جانب مرتين إلى أربع مرات واحتضان في 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة إلى ساعتين. الاحماء 2٪ methylcellulose إلى درجة حرارة الغرفة.
ثم، تمييع حل 2٪ ميثيلسيللوز في وسائل الإعلام النمو بنسبة 2 إلى واحد تقريبا. بعد الحضانة، إضافة 125 ميكرولترات من وسائط النمو ميثيل سيلولوز إلى كل بئر من لوحات 96-آبار. احتضان مرة أخرى في 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 32 إلى 40 ساعة.
لإصلاح فيروسيلس، في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية إضافة 50 ميكرولترات من 5٪ شبهformaldehyde على الجزء العلوي من طبقة ميثيلسيلولوزي في كل بئر من لوحات 96-جيدا. احتضان لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بدلا من ذلك، تغطية لوحات مع بارا فيلم ووضعها في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.
بعد ذلك، استخدم ماصة لإزالة تراكب والوسائط قبالة الخلايا في حاوية المتاح داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية. غسل بلطف مع 150 ميكرولترس من برنامج تلفزيوني في البئر. إزالة برنامج تلفزيوني من لوحات وإزالة لوحة من مجلس الوزراء السلامة البيولوجية.
كرر غسل PBS مرتين، ثم إضافة 150 ميكرولترات في بئر مرة واحدة غسل FFA العازلة وترك في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس إلى 10 دقائق ل Permeabilize الخلايا الثابتة. بعد ذلك، استخدم الأجسام المضادة الأولية لزيكا للكشف عن العدوى. إعداد الأجسام المضادة الأولية 4G2 بتركيز من ميكروغرام واحد لكل ملليلتر في FFA تلطيخ العازلة.
فليك FFA غسل العازلة من لوحات، وإضافة 50 ميكرولترات من الأجسام المضادة الأولية في FFA تلطيخ العازلة إلى كل بئر. ثم ختم لوحات مع Parafilm، أو فيلم من البلاستيك، واحتضان بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. إعداد الثانوية الذهاب المضادة للماوس HRP المسمى الأجسام المضادة بتركيز من واحد إلى 5،000 في FFA تلطيخ العازلة.
بعد إزالة حل الأجسام المضادة، وغسل الخلايا ثلاث مرات مع 150 microliters FFA غسل العازلة في بئر. إزالة المخزن المؤقت غسل عن طريق الخفقان في بالوعة في كل مرة. وصمة عار الخلايا مع الأجسام المضادة الثانوية في FFA تلطيخ العازلة في 50 ميكرولترات في البئر واحتضان ساعة إلى ساعتين في درجة حرارة الغرفة.
بعد ذلك، وغسل الخلايا ثلاث مرات مع تخزين مؤقت غسل FFA، مرة أخرى، وإزالة المخزن المؤقت غسل عن طريق الخفق في الحوض في كل مرة. إضافة 50 ميكرولترات من الركيزة تروبلو في كل بئر. انتظر دقيقتين إلى 15 دقيقة حتى يتم تعريف البقع بشكل كامل مع الحد الأدنى من الخلفية.
بعد البقع مرئية، وغسل بلطف بالماء باستخدام يد لحماية monolayer من قوة المياه الجارية. انقر فوق الجافة على المناشف الورقية. بعد فترة وجيزة، استخدم نطاق تشريح لحساب يدويا البقع في كل بئر، أو استخدام عداد بقعة الآلي.
في برنامج "مناعي كابتور"، حدد تخفيف مع بؤر مميزة بسهولة بين 20 إلى 200 لكل بئر لكل عينة وحساب تيتر في وحدات تشكيل التركيز لكل ملليمتر باستخدام متوسط الآبار المكررة. في هذه التجربة، تم عرض العبء الفيروسي في أنسجة الجهاز العصبي المحيطي والمركزي بعد أن أعطيت فئران إيفنار فيروس زيكا تحت الجلد. وكان حد الكشف بين 100 إلى 500 FFU لكل غرام، على أساس الجهاز.
عند إجراء فحص التركيز على تشكيل، يمكن أن تؤدي الأخطاء الفنية إلى نتائج دون المستوى الأمثل. سمية الأعضاء، مدفوعة بتركيز عال من الكبد، غيرت حساسية الفحص. عندما كان titer الفيروسية في الجهاز أقل من السمية، وFFA لا يمكن أن تسجل بدقة titers الفيروسية.
أظهرت خلايا الكلى السمية مع تركيز عال للأعضاء ولكن تم التغلب عليها من قبل titer الفيروسية في تركيزات الأعضاء المنخفضة. يمكن أن يؤدي الخفقان القوي أو الغسيل إلى إزالة الطبقة الأحادية ، مما يؤدي إلى فقدان البيانات غير الدقيقة في الإبلاغ عن نتائج titer. الألياف أو الشعر الموجودة في ورقة ماصة مقاعد البدلاء المختبر، يمكن أن تلوث الآبار الفردية وتسبب أخطاء كبيرة إذا باستخدام برنامج العد الآلي.
كثافة الخلية هي قضية أخرى ، والتي يمكن أن تؤثر بشكل كبير على نجاح فحص التركيز على تشكيل. وأظهرت الخلايا في ما يقرب من 60٪ التقاء في بداية الفحص، مقارنة بالخلايا مطلية في 90٪، فرق كبير يؤثر على فحص التركيز تشكيل. تخطيط حجم ونطاق التجربة بحيث يتم الانتهاء من حصاد الأعضاء بكفاءة، هو الجزء الأكثر أهمية من الإجراء، يليها بدء اختبار التركيز مع خلايا ذات جودة عالية.
وقد استخدم هذا الإجراء لتحديد كمية الفيروس للأسر الفيروسية المتعددة. ويمكن أيضا أن تتكيف مع هذا البروتوكول لفحص المركبات العلاجية وتحديد الإبطال الأجسام المضادة. وتستخدم هذه التقنيات في كميات الفيروس الحي وينبغي اتخاذ خطوات السلامة المناسبة وفقا للمبادئ التوجيهية المنصوص عليها في BMBL.
