هذا البروتوكول يتيح للمحقق لتحديد حجم القناة الصفراوية التنمية في نماذج الماوس من أمراض الكبد. كما أنه يسمح لتقييم آثار المعدلات الوراثية على تطوير القناة الصفراوية. وميزة هذه التقنية هي أنها طريقة واضحة وحساسة وكمية للتقييم المباشر لتطور القناة الصفراوية.
للبدء ، مع الجلد المشدود من قبل ملقط ، واستخدام مقص صغير لجعل شق عرضية ما يقرب من شبر واحد تحت القفص الصدري من الماوس القتل الرحيم. كشف كامل سطح البطن من الكبد. استخدم مقص صغير لقطع بعناية من خلال الأربطة التي تربط الكبد بالأعضاء الأخرى في البطن.
ثم، قطع من خلال القناة الصفراوية المشتركة لفصل الكبد من الأمعاء. التمسك المرارة وإزالة الكبد بعناية. ضعه على الفور في أنبوب 50 ملليلتر ملأ ثلاثة أرباع مع 4٪ شبهformaldehyde.
لإصلاح أنسجة الكبد، احتضانه في 4٪ PFA في أربع درجات مئوية لمدة 48 ساعة. بعد سلسلة من الإيثانول يغسل، وغسل الكبد مع وكيل المقاصة ثلاث مرات لمدة 30 دقيقة لكل درجة حرارة الغرفة. للبدء في التضمين ، قم بغسل كاسيت الأنسجة في قالب من الأنسجة ثلاث مرات لمدة 30 دقيقة في شمع البارافين المُحمّى مسبقًا إلى 60 درجة مئوية.
ثم، ملء قالب الأنسجة مع الشمع البارافين إلى ارتفاع ثلاثة أرباع والاحتفاظ بها على كتلة التدفئة في 60 درجة مئوية. وضع الكبد في القالب مع الجانب البطني التي تواجه. بعد إزالة بعناية القالب من كتلة التدفئة، ووضع الجزء العلوي من كاسيت على القالب.
أعلى قبالة مع البارافين السائل الساخن والسماح لها لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها. بعد إزالة كتلة الكبد من القالب ، استخدم ميكروتوم لبدء التقسيم من خلال الجانب الظهري السطحي للكبد ، مما يجعل خمسة أقسام ميكرومتر. تحقق من الأقسام السطحية تحت مجهر تشريح لضمان عدم القص أو طي المقاطع.
لمعالجة الشرائح للكيمياء المناعية، حدد شريحة واحدة لكل نمط جيني لتحليلها وغسلها لمدة 15 دقيقة في إكسيلين، 100٪ الإيثانول، 95٪ الإيثانول وأخيرا، 70٪ الإيثانول. بعد غسل الشريحة في الماء المتأين، غمرها في محلول استرجاع مستضد عالي درجة الانسداد قائم على تريس. ثم، تسخينه تحت الضغط في طنجرة الضغط لمدة ثلاث دقائق في 10 جنيه لكل بوصة مربعة.
بعد السماح للشريحة باردة لدرجة حرارة الغرفة، استخدم القلم PAP لتحديد المقاطع على الشريحة. بعد الغسيل مع برنامج تلفزيوني توين، كتلة أقسام الأنسجة عن طريق إضافة 100 ميكرولترات من محلول حجب لكل قسم واحتضان مغطاة في أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة. تطبيق 100 ميكرولترات من محلول الأجسام المضادة المخففة التي تحتوي على جميع الأجسام المضادة الأساسية الثلاثة إلى كل قسم واحتضانها عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.
بعد غسل الشرائح، إضافة 100 ميكرولترات من حل الأجسام المضادة الثانوية التي تحتوي على كل من الأجسام المضادة الثانوية واحتضان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. وأخيراً، تطبيق متوسطة التركيب و coverlip على الشرائح. استخدم مجهر الفلورسنت لالتقاط صور 20x في 1x تقريبًا لكل قسم.
تأكد من أن كل الوريد المدخل عبر الكبد هو صورة. إنشاء جدول بيانات مع الأعمدة التالية: رقم الحيوان/العينة، رقم الصورة، عدد من عروق المدخل وعدد القنوات الصفراوية. تحديد وتسجيل عدد الأوردة المدخلية لكل صورة لكل صورة.
ثم، تحديد القنوات الصفراوية براءات الاختراع في كل صورة، من خلال وجود cholangiocytes المحيطة التجويف تعريف. وينبغي أن تكون هذه الهياكل متميزة وفصلها من قبل mesenchyme من الخلايا الأخرى واسعة الطيف السيتوكيراتين إيجابية. أحد التحديات الرئيسية لهذه التقنية هو في تحديد القنوات الصفراوية براءات الاختراع.
تحديد ما هو قناة براءات الاختراع يتطلب تحليلا لشكل القناة والخلايا المحيطة تجويف. عد كل قناة براءة اختراع القناة الصفراوية ومكان في نفس العمود كرقم الصورة وكرر لكل صورة الوريد المدخل. وأخيراً، حساب مجموع جميع الأوردة المدخلة وجميع القنوات الصفراوية في عينة الكبد وحساب القناة الصفراوية إلى نسبة الوريد المدخل لعينة الكبد.
تم تقسيم كبد الماوس P30 وشارك في تلطيخ لCK8 و CK19 جنبا إلى جنب مع علامة الأوعية الدموية، ألفا-SMA، لتحديد نسبة BD إلى PV. عندما يتم تصوير جميع الأوردة المدخلة في كل فص كبد ، تم تعريف الأوردة المدخلية بأنها الأوعية الملطخة ألفا -SMA التي تحتوي على تلطيخ السيتوكيراتين الواسع النطاق المجاور. وكانت هياكل وصمة ألفا SMA دون السيتوكيراتين واسعة الطيف الأوردة المركزية التي تم استبعادها من التحليل.
قنوات براءات الاختراع لديها لومن واضح المعالم التي تحيط بها واسعة الطيف السيتوكيراتين إيجابية cholangioctyes وعادة ما تكون منفصلة عن القنوات القريبة أو cholangiocytes بواسطة mesenchyme. لا تحسب الخلايا الإيجابية السيتوكيراتين واسعة الطيف التي ليس لها لومن محددة، نحو العدد الإجمالي للقناة الصفراوية. قسم الكبد من من النوع البري يظهر الوريد بوابة المرتبطة قناة براءات الاختراع بالكامل جنبا إلى جنب مع العديد من الخلايا غير المدمجة.
قسم الكبد التمثيلي من غير هتروزيجوس JAG1 يظهر لا توجد قنوات الصفراوية براءات الاختراع موجودة حول الأوردة المدخلة الثلاثة. جميع الخلايا السيتوكيراتين إيجابية واسعة الطيف هنا غير مدمجة، وبالتالي، لا ينبغي أن تحسب. تحليل نسبة BD إلى PV لثلاثة من نوع البرية وثلاثة الحيوانات غير متغايرة JAG1 يبين كيف يمكن تمييزها بسهولة بين النوعين الجينيين على أساس عدد القنوات الصفراوية.
من المهم تقييم جميع الأوعية المدخلة لالقنوات الصفراوية. انها حاسمة خاصة لتحديد كثافة القناة الصفراوية إذا كان هناك تقلب فينوتيبيك عبر الكبد. وقد استخدمت هذه التقنية لتحديد القامع الجيني للنمط الظاهري الصفراوية في نموذج الماوس من هيلغاسون.
ولذلك، قد يكون من المفيد في تقييم طرق العلاج من النماذج الحيوانية من مرض الصفراوية.
