أهمية هذا البروتوكول هو استخدام رواية الفلورسنت سومو محاصرة بروتين UTAG للكشف عن المعدل البروتين سومو في مختلف الخلايا eukaryotic. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي بروتوكول مباشر للكشف عن الأجسام المضادة خالية من سومو في مجموعة متنوعة من الخلايا، بما في ذلك زراعة الأنسجة الثدييات والنياتودا الخيطية. يلعب SUMO أدوارًا مهمة في السرطان والاضطرابات العصبية ، وهذا يؤكد الحاجة إلى أدوات قوية وموثوقة للكشف عن البروتينات المعدلة من سومو وتحليلها وظيفيًا.
لأن سومو هو الحفاظ على درجة عالية، يمكن استخدام البروتين الفلوري سومو محاصرة UTAG لتسمية سومو مترافق في العديد من الكائنات الحية المختلفة. يوضح هذا الفيديو استخدامه في خلايا الثدييات. بالإضافة إلى ذلك، يصف النص الكامل استخدامه في البويضات الخيطية.
العرض المرئي لهذه التقنية يوفر تلميحات هامة لعلاج الخلايا قبل التلطيخ والكشف SUMO. للبدء، تنمو خلايا زراعة الأنسجة في الاختيار على 22 ملليمتر غطاء جولة زلات في لوحات TC ستة جيدا حتى 70 إلى 80٪التقاء. اغسل الخلايا لفترة وجيزة مع ملليلتر واحد من DPBS.
لإصلاح الخلايا، إضافة ملليلتر من 4٪ PFA الطازجة وDPBS إلى كل بئر. احتضان الخلايا لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الخلايا الثابتة ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في ملليلتر واحد من DPBS أثناء تناول اللوحة.
ل Permeabilize الخلايا، احتضان لمدة 15 دقيقة مع 1٪ تريتون X-100 في DPBS. غسل الخلايا مرة أخرى، كما كان من قبل. احتضان الخلايا مع 500 ميكرولترات من 1 المولى الجليسين HCL 2 pH لمدة 10 ثانية.
ثم تحييد الحموضة على الفور مع 500 ميكرولترers من 10X سومو Protease العازلة، أو SPB. بعد غسل الخلايا كما كان من قبل، وإزالة زلات الغطاء من البئر ووضعها في غرفة الرطوبة. لUTAG-FL تلطيخ فقط، مزيج ميكروغرام واحد من UTAG-FL مع 100 ميكرولترات من 1X SPB تحتوي على خمسة متر TCEP في أنبوب.
ثم، ماصة المزيج على الخلايا على زلة الغطاء واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة في غرفة الرطوبة. لغسل قسائم الغطاء، الماصات 200 ميكرولترات من DPBS على كل زلة الغطاء وترك في مكان لمدة 10 دقائق. كرر الغسيل مرتين اُكرَان.
إزالة زلات الغطاء من الغسيل الماضي وعكس على شريحة المجهرية تنظيفها مسبقا مع قطرة من المتوسط المتصاعد. تخزين العينات بين عشية وضحاها في 20 درجة مئوية الفريزر قبل عرض تحت المجهر. تصور الخلايا باستخدام مجموعات التصفية المناسبة لـ DAPI وتكساس ريد.
الرجاء مراجعة النص الكامل لبروتوكول حول كيفية تسمية سومو والرنا الثابتة الخيطية الخيطية. في حين أن وضع العلامات على خلايا الثدييات هو واضح جدا، ووضع العلامات البويضات الخيطية يتطلب التدريب المسبق في تشريح الشناء. وأظهرت KmUTAG-FL المحتضنة مع خلايا PMT2 ثابتة تلطيخ نووي متميز.
وكان كل من التلطيخ النووي المنتشر و البؤر النووية المتميزة مرئيين. تم تأكيد التوطين النووي باستخدام التلطيخ المشترك مع DAPI. واتساقا مع نشاط التراكب SUMO في KmUTAG-FL، كان نمط التوطين النووي يذكرنا بتلوين SUMO23.
أكد التلطيخ المشترك مع الأجسام المضادة لـ SUMO23 8A2 التعريب المشترك لـ KmUTAG-FL مع إشارة SUMO23. وهذا يؤكد فعالية KmUTAG-FL للكشف عن SUMO23 في خلايا الثدييات. السناد المعزولة من البويضات المنتجة للبالغين hermaphrodite ج.
تم تصنيف اليغانز الديدان الخيطية مع الأجسام المضادة سومو. بما يتفق مع التقارير السابقة، الأجسام المضادة لسومو المترجمة في البداية إلى plasm النووية من البويضات الطورية في وقت متأخر من myotic. ثم أعيد توزيعها على مجمع الحلقة المركزي للرموز الثنائية حيث انهار المغلف النووي واتّيبت الكروموسومات نحو لوحة metaphase.
في الاستعدادات الموازية، كشفت الغنودات المسماة بـ KmUTAG-FL عن أنماط مماثلة. تحولت KmUTAG-FL من وضع العلامات على النوكللوبلازم إلى التركيز على مجمع الحلقة حيث بدأت البويضات وأكملت عملية انهيار المغلف النووي. هذه النتائج التحقق من صحة KmUTAG-FL كأداة مفيدة لتحليل myosis والعمليات ذات الصلة SUMO في ج.
elegans وربما غيرها من الديدان الخيطية. أثناء إجراء التثبيت ، من المهم استخدام ما قبل الفورمالدهيد الطازج ووقت التثبيت القصير للحفاظ على سومو مطوية أصليًا بحيث يمكن التعرف عليها من قبل KmUTAG. وبما أن هيكل سومو الثالثي محافظ بدرجة عالية، فمن المرجح جداً أن متغيرات سومو من أنظمة النماذج الإضافية وغير النموذجية يمكن تحليلها باستخدام كاشف KmUTAG-FL.
حاليا، ونحن نستخدم هذا الفلورسنت سومو المحاصرة بروتين UTAG لدراسة وظيفة سومو خلال الإجهاد الخلوي. وأخيراً، يرجى ملاحظة أنه ينبغي تنفيذ جميع الخطوات باستخدام شبه شكلي المثبت في غطاء أمان المختبر ويجب التخلص من هذا الكاشف بشكل صحيح.
