وستسهم دراسة آليات المقاومة المكتسبة الجديدة في تطوير استراتيجيات علاجية أكثر فعالية وأماناً في المرضى الذين يعانون من السرطان المقاوم لعامل السرطان والسرطان القابل للاستئصال. ولسوء الحظ، لا يتم الإبلاغ عموما عن الحالات التي فشلت فيها مقاومة للأدوية. ويعتبر هذا الأسلوب تصعيد الجرعة خطوة الأسلوب الأكثر موثوقية للحصول على خلايا المقاومة المكتسبة.
لتحديد التركيز المناسب afatinib المقاومة، والخلايا PC-9 الثقافة في متوسطة النمو في طبق 10 سم خلية المعالجة ثقافة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. Resuspend خلايا PC-9 في أربع مرات-10-إلى-4 خلايا لكل ملليلتر من النمو التركيز المتوسط, ومقعد الخلايا في 50 ميكرولترات من تعليق الخلية في بئر في 96-جيدا microplate. بعد حضانة بين عشية وضحاها في حاضنة ثقافة الخلية ، وعلاج الخلايا مع 50 ميكرولترات من محلول afatinib في البئر ، في ستة تكرارات من التركيزات المشار إليها ، وبعد حضانة 96 ساعة في حاضنة ثقافة القتل ، إضافة 15 ميكرولترات من صبغة MTT إلى كل بئر.
بعد أربع ساعات في حاضنة ثقافة الخلية، إضافة 100 ميكرولترات من solubilization / وقف حل لكل بئر، والعودة لوحة إلى الحاضنة بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي، قياس الكثافة البصرية في 570 نانومتر على قارئ microplate. للتعرض المستمر afatinib، ثقافة PC-9 الخلايا في أطباق P-100 تحتوي على 10 ملليلتر من متوسط النمو حتى الخلايا تصل إلى عدم التوافق.
نقل الثقافات دون التوافق في ثلاثة أطباق P-100 جديدة من تسعة ملليلتر من متوسط النمو لكل طبق ثقافة أولية، وإعادة الخلايا إلى حاضنة ثقافة الخلية. في صباح اليوم التالي، إضافة 0.1 نانوموللار، أو 1/10 من تركيز مثبط نصف القصوى من afatinib، إلى كل مجموعة من ثلاثة أطباق الثقافة. عندما تصبح الخلايا المعالجة بالخلايا غير ذاتية الفلورة، استخدم ماصة من ملليلتر واحدة لخلط الثقافات تمامًا، ونقل ملليلتر واحد من الخلايا من كل طبق إلى تسعة ملليلترات من متوسط النمو الطازج في أطباق P-100 الجديدة.
إضافة 10٪ إلى 20٪ أعلى تركيزات من afatinib إلى الثقافات الجديدة، وزيادة تركيز afatinib عن طريق تصعيد الجرعة خطوة في كل مرة الثقافات تصل إلى دون الثقاة على مدى فترة 10-12 شهرا. عندما يتم الوصول إلى تركيز afatinib من ميكرومولار واحد، وإجراء اختبار MTT كما ثبت للتأكد من أن الخلايا قد وضعت afatinib-المقاومة. لتحديد منحنى النمو لخطوط الخلية، ثقافة الأم PC-9 وثلاثة خطوط الخلايا مقاومة afatinib في متوسط النمو في الحاضنة ثقافة الخلية لمدة 24 ساعة.
Resuspend الخلايا من كل ثقافة في خمس مرات 10-إلى الثلث الخلايا لكل ملليلتر من النمو التركيز المتوسط, والمقعد 12 100 ميكرولتر يكرر من كل مجموعة الخلايا في بئر في 96 جيدا microplate. ثم قم بإجراء اختبار MTT في الأيام صفر، واحد، اثنين، ثلاثة، خمسة، وسبعة من الثقافة كما هو موضح، ومؤامرة النتائج باستخدام برنامج تحليل إحصائي مناسب. لتحديد التعديلات في مستقبلات عامل النمو البشرة، أو تعبير الحمض النووي الجينومي EGFR، عن طريق عكس تحليل سلسلة البوليميراز transcriptase، عزل الحمض النووي الجينومي من ثقافة الخلية ذات الاهتمام باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
قياس تركيز تركيز 25 نانوغرام ميكرولتر من الحمض النووي الجينوم معزولة على مقياس الطيف. ثم تضخيم 50 نانوغرام من الحمض النووي الجينومي باستخدام مزيج سيد أخضر SYBR، وتحليل النتائج باستخدام نظام اكتشاف تفاعل البوليميراز المتسلسل القائم على الفلورسينس. لتحديد التعديلات في تعبير الحمض النووي الجينومي EGFR عن طريق التسلسل، تضخيم الحمض النووي الجينوم باستخدام التمهيديات محددة لEGFR exons 19 إلى 21.
ثم تنقية منتجات PCR تضخيم باستخدام مجموعة تنقية PCR وفقا لتعليمات الشركة المصنعة، وتسلسل amplicons. لتحديد التعديلات في البشرة عامل النمو مستقبلات البروتين التعبير عن طريق تحليل البقعة الغربية، علاج الخلايا مع afatinib لمدة 24 ساعة. بعد 24 ساعة، وغسل الثقافات الخلية مرتين مع خمسة ملليلتر من الجليد البارد PBS لكل ثقافة في غسل.
Lyse الخلايا في العازلة فحص المناعة الشعاعية، تستكمل مع 1٪ protease المانع كوكتيل ومثبطات الفوسفاتاز كوكتيل اثنين وثلاثة لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية. في نهاية الحضانة، وجمع lysates عن طريق الطرد المركزي. استخدام مقايسة حمض bicinchoninic لتحديد تركيز البروتين من عينات lysate.
ضبط عينات البروتين إلى 0.5، أو ميكروغرام واحد لكل تركيزات ميكرولتر، في 4-X عينة العازلة، ويغلي العينات في 96 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. لتحليل لطخة الغربية من العينات، وتجميع الألواح الزجاجية تنظيف الإيثانول والفواصل، وتحميل القالب مع هلام بوليكريلاميد 8٪ مع المكملات التجريبية المناسبة. في حين أن هلام هو البلمرة، إضافة محلول هلام التراص إلى قالب مناسب، إدراج المشط، والسماح للجل التراص البلمرة لمدة 20 إلى 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
عندما يكون كل من المواد الهلامية بالمبلمرة، ووضعها في الجهاز الكهربائي وملء خزان مع تشغيل العازلة. ثم قم بتحميل حجم واحد من 20 إلى 30 ميكرولتر لكل عينة بروتين في كل بئر ، وتشغيل الجل بسرعة 180 فولت. وقف الكهرباء بعد حوالي 60 دقيقة، مرة واحدة في الجبهة صبغ يتدفق من هلام، وغسل هلام مع محلول ملحي tris المخزنة، وتستكمل مع توين، لمدة دقيقة إلى دقيقتين.
نقل البروتينات على غشاء فلوريد بولي فينيلايدين عن طريق النشاف شبه الجافة لمدة ساعة واحدة و 1/2 في تيار ثابت من 300 مللي amp. كتلة الغشاء مع 5٪ الحليب الجاف غير الدهنية المخفف مع محلول ملحي tris-buffered بالإضافة إلى محلول توين لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، تحقق في الغشاء مع الأجسام المضادة المناسبة ذات الاهتمام عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.
في صباح اليوم التالي، اغسل الأغشية بثلاثة غسلات لمدة 10 دقائق من محلول ملحي جديد مخزن بالتريز في كل غسل قبل تعريض الغشاء للأجسام المضادة الثانوية المناسبة لمدة ساعة إلى واحدة وساعة ونصف في درجة حرارة الغرفة. ثم غسل الغشاء خمس مرات مع الملح الطازج tris المخزنة في غسل وفضح الغشاء إلى حل chemiluminescence المحسنة لتصور إشارة باستخدام الأفلام. هنا، يتضح الانخفاض الملاحظ في انتشار الخلايا من الخلايا PC-9 الأبوية استجابة لتركيزات متزايدة من afatinib، مما يؤكد أن خلايا PC-9 حساسة للتعرض afatinib.
ومع ذلك، لا يظهر أي من خطوط الخلايا الثلاثة المقاومة لـ afatinib قمع انتشار الخلايا تحت التعرض لـ afatinib. خطوط الخلايا المقاومة لـ Afatinib تعرض منحنيات نمو أبطأ بكثير من خلايا PC-9 الأبوية. الخلايا المقاومة لـ Afatinib تعبر عن مستويات أعلى بكثير من الحمض النووي الجينومي EGFR وتعبير بروتين EGFR من الخلايا PC-9 الأبوية.
تسلسل EGFR يوضح أن PC-9 خلايا معرض 15 حذف زوج قاعدة في EGFR exon 19، والبرية نوع EGFR في exon 20. Afatinib مقاومة واحد واثنين من الخلايا الخلية الخلية الخلايا، ومع ذلك، يحمل تضخيم من نوع البرية EGFR exon 19. Afatinib مقاومة الخلية خط ثلاث خلايا تحتوي على نفس 15 حذف زوج قاعدة في EXON EGFR 19 كما هو الحال في خلايا PC-9، ولكن لوحظ طفرة نقطة في T790M في EXON EGFR 20.
نمو الخلايا يمكن أن تصبح بطيئة جدا عندما يكون تركيز المانع قريبة من IC-50 قيمة. لا تناقش الثقافة، حيث أن الخلية ستستمر في الانتشار تدريجياً. وقد تم تطوير هذه الاستراتيجيات لمحاكاة الظروف التي يتطور فيها مرضى السرطان مقاومة ذات صلة سريريا لتقييم آليات المقاومة المكتسبة ووضع استراتيجيات علاجية آمنة وفعالة.
