زرع العظام من خلايا سرطان الرئة الماوس في المتلقين الكسب غير المشروع syngeneic يسمح لدراسة ورمريجنيسيس في وجود نظام المناعة النشطة تماما في ظل الظروف الفسيولوجية. وبطبيعة الحال، تتطور الأورام إلى الفئران عدم الكفاءة المناعية وهذا هو أكثر من ذلك بكثير الفسيولوجية التي إذا قمت بإجراء عملية زرع في الفئران المناعية. يجعل تحرير الجينات للخلايا السرطانية قبل زرع هذا النموذج نهجًا مباشرًا وموفرًا للوقت لدراسة تأثير العوامل الوراثية على نمو الورم وملامح التعبير الجيني.
بالمقارنة مع نماذج ورم الرئة autochthonous غير قابل للتكون، هذه الطريقة تتجنب تكاثر واسع النطاق من الفئران، وبالتالي يمثل صقلاً لنماذج الماوس سرطان الرئة السابقة. قبل البدء في الإجراء، استخدم المقص لإزالة نهاية إبرة القسطرة ودفع القسطرة تمامًا فوق نهاية الإبرة. بعد التأكد من عدم وجود استجابة لقرصة إصبع القدم ، ضع مرهمًا على عيون فأر مخدر ، مكنّب من العمر من ثمانية إلى 12 أسبوعًا وربط الفواصل العلوية عبر سلسلة خياطة عبر منصة الاحتضان مع عمودي الصدر على الغرز.
ضع كابل ألياف بصرية بين الأطراف الأمامية لإلقاء الضوء على الصدر وفتح الفم بعناية باستخدام ملقط مسطحة مطهرة لاستخراج اللسان. ابحث عن انبعاث الضوء الأبيض لتحديد موقع الحنجرة، epiglottis، والغضاريف الارتدائي. بمجرد أن يكون فتح القصبة الهوائية مرئيًا بوضوح ، حرك القسطرة بلطف إلى القصبة الهوائية ، حتى لا يتجاوز التشعب ، لضمان توزيع زوجي لخلايا سرطان الرئة داخل الرئتين.
الحرص على أن إدراج القسطرة على نحو سلس جدا. إذا كنت تشعر بأي مقاومة، قم بإزالة القسطرة وفضح القصبة الهوائية مرة أخرى لتجنب إصابة الماوس. قم بإزالة الإبرة بسرعة من القسطرة وتحقق مما إذا كان الضوء الأبيض يمكن ملاحظته ساطعًا من خلال القسطرة.
لتأكيد وضع القسطرة بشكل سليم داخل القصبة الهوائية، قم بتوصيل حقنة من الماء بالميليلتر إلى القسطرة. يجب أن تتحرك المياه في الحقنة بسرعة صعودا وهبوطا في الوقت المناسب مع التنفس. قبل تسليم تعليق الخلية، تدفئة الخلايا باليد وتحميل 50 ميكرولترات من الخلايا في القسطرة.
بمجرد أن يستنشق التعليق ، قم بإرفاق حقنة فارغة من المليلتر بالقسطرة وصرف 300 ميكرولترات من الهواء إلى القسطرة لضمان التوزيع الكامل للخلايا السرطانية داخل الرئتين. ثم قم بإزالة القسطرة بلطف ووضع الماوس على وسادة الحرارة مع المراقبة حتى إعادة شغل الوظائف بالكامل. بعد نقطة النهاية التجريبية المناسبة، نقع الذبيحة في الإيثانول 70٪ وتأمين الحيوان إلى لوحة تشريح.
جعل شق منتصف البطن وعكس بلطف الجلد لفضح عضلات جدار الصدر والأعضاء البطنية. استخدام مقص لثقب الحجاب الحاجز وقطع الأضلاع، وفضح تجويف الصدر. قطع فتحة صغيرة في البطين الأيسر واستخدام إبرة قياس 27 لضخ الرئة ثلاث مرات من خلال البطين الأيمن مع ستة إلى ثمانية ملليلتر من الجليد البارد PVS لكل ضخ.
بعد التسريب الأخير، يجب أن تكون الرئتين واضحة تماما من الدم وتظهر بيضاء. بعد الحصاد، واستخدام مقص ل mince أنسجة الرئة إلى قطع صغيرة. نقل شظايا الرئة في أنبوب microcentuge ملليلتر اثنين تحتوي على 1.5 ملليلتر من عازلة هضم الرئة لاحتضان 30 إلى 60 دقيقة في 37 درجة مئوية، مع اهتزاز.
في نهاية عملية الهضم، نقل تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرون في أنبوب 50 ملليلتر واستخدام نهاية معقمة 10 ملليلتر المكبس حقنة للضغط على أي شظايا الأنسجة المتبقية من خلال مرشح. شطف المصفاة مع 15 ملليلتر من PVS، تستكمل مع 2٪ FCS. وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي.
إعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من كلوريد الأمونيوم تحلل البوتاسيوم العازلة لمدة خمس دقائق حضانة في درجة حرارة الغرفة والطرد المركزي الخلايا مرة أخرى. ثم إعادة تعليق بيليه خلايا الدم البيضاء في ملليلتر واحد من PVS تستكمل مع 2٪ FCS وصمة عار الخلايا لتحليل تدفق الخلايا وفقا للبروتوكول التجريبي. كما هو متوقع، يرتبط بقاء الفئران المتلقية بعدد الخلايا المُنقّتة.
والرئتين التي تم حصادها في وقت الوفاة تظهر توزيعاً متكافئاً للعقيدات السرطانية في جميع الفصوص. عند مقارنة أقسام من الرئتين التي تأوي أورامًا تلقائية ، مع الأورام التالية لخلايا ورم الرئة المزروعة بشكل متعازمي ، لا تلاحظ أي اختلافات مورفولوجية. تحليل تدفق الخلايا من التعبير PD-L1 من خلايا الرئة معزولة بعد ثلاثة أسابيع من زرع الخلايا السرطانية التقويمية في الفئران ذات المناعة, كما ثبت للتو, يكشف عن ما يصل التنظيم في PD-L1 تعبير علامة سطح الخلية, بالمقارنة مع الخلايا السرطانية في المختبرية زرع الرئة.
بعد زرع العظام، يمكن تطبيق أساليب تحليلية أخرى، بما في ذلك التحليل المناعي الكيميائي، وتحديد الحمض النووي الريبي (MRNA) لمعالجة أسئلة تجريبية إضافية.
