في الدماغ، زوج من الخلايا العصبية غالبا ما تشكل اتصالات متشابكة متعددة، وهو ما يسمى تعدد متشابك. ومع ذلك، يتطلب الفحص الدقيق للتعدد المتشابك تجارب صعبة من الناحية الفنية. يصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة لتقدير إجمالي تعدد متشابك باستخدام الخلايا الكاملة التصحيح المشبك الكهربائية الفيزيولوجيا.
ويمكن تطبيق هذه الطريقة على أي نوع ومنطقة الدماغ للتحقيق في تعدد متشابك. هذه الطريقة تتطلب المهارات الأساسية في خلية كاملة التصحيح- المشبك الكهربائية الفيزيولوجيا. الحصول على تسجيلات عالية الجودة مع مقاومة وصول منخفضة ومستقرة أمر بالغ الأهمية للتفسير الدقيق للبيانات.
للحصول على تكوين الخلية الكاملة، ضع ماصة التسجيل فوق الشريحة وتيار الإزاحة في وضع المشبك الجهد. تطبيق ضغط إيجابي طفيف على ماصة، وقفل stopcock. بعد ذلك، حدد خلية سليمة مع غشاء سليم، والاقتراب من الأنسجة مع ماصة.
وينبغي أن يسبب الضغط الإيجابي اضطرابا طفيفا على الأنسجة. ببطء جعل ماصة أقرب إلى الخلية في حركة قطرية حتى يتم تشكيل غمل صغير على سطح الخلية. ثم، الافراج عن قفل الضغط الإيجابي.
ستبدأ الخلية في تشكيل ختم، وسوف تزيد المقاومة فوق غيغا و في المشبك الجهد، عقد الخلية في ناقص 68 millivolts. في وقت لاحق، سحب قليلا من الماصات بعيدا عن الخلية قطريا لإزالة الضغط الزائد.
تعويض عن السعة الماصة السريعة والبطيء. تطبيق شفط قصيرة من خلال أنبوب متصل إلى حامل ماصة لاختراق الخلية والحصول على تكوين الخلية الكاملة. ثم، التحول إلى وضع الخلية على نافذة اختبار الغشاء في الحصول على البيانات الكهربائية وتحليل البرمجيات.
الحفاظ على درجة حرارة حمام التسجيل عند 27 إلى 30 درجة مئوية ومعدل التدفق عند 1.5 إلى 2 ملليلتر في الدقيقة للتجارب اللاحقة. في المشبك المتعدد، عمل المحتملة مزامنة إطلاق الناقل العصبي ويولد أكبر ما بعد ينابتيك الحالية. منع العمل المحتملة والطلقات التي تعتمد على الكالسيوم مع TTX والكادميوم يمنع الجمع ما بعد المينابتية الحالية ويقلل من السعة.
عندما لا يكون هناك تعدد، حظر العمل المحتملة لن يغير السعة. في التجربة الأولى، لتقدير التعدد، اضغط على الخلية عند ناقص 68 ملليفولت بينما تضخها بـ aCSF منخفض الكالسيوم. سجل مراكز EPSCs التلقائية لمدة خمس دقائق على الأقل لضمان خط أساس مستقر.
بعد ذلك ، إضافة 30 micromolars 4-AP إلى ACSF لزيادة الأحداث التي تعتمد على العمل ، وتسجيل EPSCs التلقائية لمدة 10 دقائق على الأقل للحصول على تأثير الدواء الكامل. ثم، إضافة 0.5 micromolars TTX و 10 ميكرومولار الكادميوم إلى ACSF مع 4-AP، وتسجيل EPSCs مصغرة لمدة 10 دقائق على الأقل. للتحليل غير متصل، استخدم آخر دقيقة من خط الأساس مباشرة قبل تطبيق 4-AP، و10ث من تطبيق 4-AP، والدقيقة 10 من تطبيق TTX.
في هذه التجربة، يتم استبدال الكالسيوم خارج الخلية مع السترونتيوم لتم اإفخاض إطلاق من vesicles متشابك. لذلك، إذا كان التعدد موجوداً، فإن هذا ينبغي أن يقلل من سعة التيارات بعد التمثيل. في التجربة الثانية، سجل EPSCs عفوية لمدة خمس دقائق على الأقل في حين ضخ الخلية مع aCSF الكالسيوم العادي.
لdynchronize الافراج عن vesicle ، والبدء في ضخ الخلية مع aCSF السترونتيوم ، وتسجيل EPSCs عفوية. لتحليل دون اتصال، لتحديد ما إذا كانت الاتساع كبيرة EPSCs عفوية بسبب الإفراج المتزامن من الفويصلات، قارن الدقيقة الأخيرة من خط الأساس إلى الدقيقة 10 من تطبيق السترونتيوم ACSF. يمكن أن ينطوي على التعدد إطلاق متعددة الناحية، مما يؤدي إلى تركيز أعلى العصبي في الشق متشابك.
إضافة غاما-DGG، وهو خصم مستقبلات AMPA منخفضة التقارب، يؤدي إلى تثبيط أقل فعالية من multiquantal أكبر مقارنة مع التيارات ما بعد أحادية أحادية أصغر. بدون إطلاق متعدد المستويات، سيكون gamma-DGG فعالًا بنفس القدر على التيارات التيارات التي تتم بعد السنوات. في التجربة الثالثة، لاختبار إطلاق متعدد القطاعات، سجل EPSCs التلقائي في aCSF منخفضة الكالسيوم لمدة خمس دقائق على الأقل.
إضافة 30 ميكروموللار 4-AP إلى ACSF من خلال نظام الضخ. سجل EPSCs عفوية لمدة 10 دقيقة على الأقل. ثم، إضافة 200 micromolars غاما-DGG إلى ACSF مع 4-AP، وتسجيل EPSCs عفوية لمدة 10 دقائق على الأقل.
كتجربة تحكم في خلية منفصلة، كرر الإجراءات، ولكن تطبيق تركيز منخفض من DNQX بدلاً من غاما-DGG. لتحليل دون اتصال، وتحليل اللحظة الأخيرة من كل تطبيق المخدرات. رشقات نارية من النشاط متشابك يمكن أن تزيد بشكل عابر من إطلاق العمل العفوي المحتملة واحتمال الإفراج عن afferents حفز.
إذا أظهرت الخلايا العصبية تعدد, زيادة في إمكانات العمل ينبغي أن يسبب زيادة عابرة في سعة التيارات بعد تينابتيك. في التجربة الرابعة، سجل EPSCs عفوية في الكالسيوم aCSF العادي. لزيادة إطلاق العمل المحتملة، وتحفيز afferents باستخدام القطب الزجاجي monopolar مليئة ACSF بمعدل 20 هرتز لمدة ثانيتين، وتكرار 10 مرات مع فاصل بين انفجار 20 ثانية.
للتحليل، استخدم 5000 مللي ثانية من وحدات EPSCs التلقائية قبل التحفيز الأول كخط أساس وقارنها بـ 10 إلى 300 مللي ثانية من EPSCs التلقائية بعد التحفيز النهائي. ثم، تأخذ السعة متوسط وتواتر التغيير أكثر من 10 التجارب. تحليل EPSCs التلقائية و EPSCs مصغرة باستخدام برنامج يكشف ويحلل التيارات متشابك.
استخدام المعلمات الكشف المقترحة ووظيفة التحليل دون توقف للكشف عن EPSCs مستقبلات AMPA بوساطة. تفحص يدويا كل تسجيل للتأكد من أن البرنامج هو الكشف بدقة كل حدث. تصدير بيانات الحدث عن طريق نسخها إلى الحافظة، ولصقها في برنامج إدارة بيانات.
بعد ذلك، حساب متوسط التردد والسعة لكل علاج المخدرات، وإجراء التحليلات الإحصائية ذات الصلة. في مثال هو مبين هنا، 4-AP يزيد من كل من السعة وتواتر من EPSCs عفوية. التطبيق اللاحق من TTX والكادميوم يقلل من كل من السعة والتردد.
هنا هو توزيع عفوية EPSC السعة من التسجيل. في الخلايا العصبية المهوّسة التي تم فحصها هنا، فإن سعة وتواتر شروط خط الأساس وTTX هي نفسها، مما يشير إلى أن مراكز EPSCs التلقائية الأساسية تحتوي على عدد قليل جدًا من مراكز EPSCs التي تعتمد على العمل. وبناء على ذلك، يمكن للتجارب اللاحقة أن تقارن الفرق بين خط الأساس و 4-ا ف ب لقياس التعدد.
قوة انتقال متشابك يمكن أن يزيد بشكل عابر من رشقات نارية من النشاط متشابك. للتحقيق في تعدد تحت ظروف أكثر فسيولوجية، يمكن استخدام التحفيز afferent لزيادة احتمال إطلاق النار واحتمال إطلاق. وفيما يلي ملخصات من التردد EPSC التلقائي والتغيرات السعة بعد التحفيز متشابك.
التسجيلات المستقرة ضرورية لتفسير دقيق للبيانات. وصف البيانات إذا تغيرت مقاومة الوصول بأكثر من 20٪ أثناء التسجيل، لأن هذا قد يربك التحليل. يقدم هذا البروتوكول طريقة بسيطة لتقدير التعدد متشابك، وهو محدد رئيسي للفعالية متشابك ولدونته في الظروف الفسيولوجية والفيزيولوجية المختلفة.
