هذا الفحص يربط تعديل بنية البكتيريا وظيفة إلى الخلايا المناعية القائمة على النشاط المضاد للبكتيريا. وعلى هذا النحو، يمكن تقييم علاج مناعي رئيسي للعلاج المحتمل في تحديد احتمال تحسين إزالة البكتيريا. يستخدم مقايسة القتل Opsonophagocytic تقليديا كمعيار ذهبي لتقييم الوظائف الفعالة للأجسام المضادة التي يتم رفعها ضد البكتيريا باعتبارها مُعَدَّة.
هذا البروتوكول يوفر البساطة وبراعة أكثر من القائمة عالية الإنتاجية موحدة المقايسة. في هذا البروتوكول ، نتحقق من آثار العلاج من المخدرات على الالتهاب الرئوي العقدي وكيف تترجم هذه الآثار إلى تحسين البلعميات من البكتيريا. هنا، ونحن تطبيق OPKA على الخلايا الالتهاب الرئوي العقدية.
ومع ذلك يمكن اعتماد هذا البروتوكول لتقييم القتل البلعومي لمسببات الأمراض الأخرى من قبل الخلايا المناعية. خصص الوقت لتحسين المخزونات البكتيرية وضمان أن تكون وحدات CFUs النهائية التي سيتم عدها تقع ضمن النطاق الأمثل. نوصي بشدة باستخدام عملية استئصال الخلايا التدفق لضمان خلايا HL60 قابلة للحياة ونشطة وتحاول ظروف ثقافة مختلفة لضمان الخلايا النشطة وظيفيا.
سوف تعطي مظاهرة بصرية فهم أفضل لكيفية العينة ينبغي أن تكون مطلية وكيفية تحقيق عينات يمكن عدها. للبدء، وإعداد HL60 وسائل الإعلام ثقافة الخلية تتألف من 500 ملليلتر RPMI تكملها L-الجلوتامين و 15 ملليلتر الحرارة تنشيط مصل البقرة الجنين. لنشر وصيانة خلايا HL60، ثقافة خمسة ملايين خلية في 10 ملليلتر من وسائل الإعلام ثقافة الخلايا HL60 في 75 سنتيمترا مربعا تنفيس قارورة في 37 درجة مئوية وخمسة في المئة ثاني أكسيد الكربون.
لتوليد مخزون العمل من الخلايا HL60، إضافة ما يقرب من مليون خلية لكل ملليلتر في وسائل الإعلام ثقافة HL60 تكملها 10٪ ثنائي الفينيل السلفيد في أنابيب مبردة ملليلتر واحد. للتمييز بين خلايا HL60، الثقافة 1.5 مرات 10 إلى الخلايا السبع في 15 ملليلتر من وسائل الإعلام ثقافة الخلايا HL60 تكملها 0.6٪ DMF في مرشح معقم توج 75 قارورة سنتيمتر مربع في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاثة أيام قبل OPKA. لإعداد عينات الأرصدة البكتيرية، قم بزراعة سلالة WU2 البكتيرية في مرق مناسب لمدة ساعتين إلى أربع ساعات تقريبًا عند 37 درجة مئوية.
بعد ذلك ، بيليه البكتيريا عن طريق الطرد المركزي في ستة آلاف مرة G لمدة دقيقتين وإعادة تعليق الخلايا في 10 إلى 30 ملليلتر من 15 ٪ الجلسرين في مرق المناسبة. Aliquot ثقافة البكتيريا في أنابيب أجهزة الطرد المركزي 1.5 ملليلتر العقيمة وتخزينها في 80 درجة مئوية. بعد ذلك، ذوبان قارورة واحدة من المخزون البكتيري في حمام الماء 37 درجة مئوية.
بيليه الخلايا البكتيرية و resuspend في 500 ميكرولترات من OBB في ظروف معقمة. يخفف لوحة من المخزون البكتيري غير المعالجة على لوحات أجار الدم وثقافة لوحات بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية. بعد خطوة الحضانة، عد المستعمرات لكل تخفيف من الأسهم البكتيرية غير المعالجة المشتركة مع خلايا HL60.
سجل الذي تخفيف البكتيريا ينتج العدد الأمثل من المستعمرات القابلة للعد لOPKAs المستقبلية مع هذا المخزون البكتيري. ذوبان أنبوب واحد من المخزون البكتيري. بيليه البكتيريا في ستة آلاف مرة G لمدة دقيقتين وإعادة تعليق بيليه الخلية في OBB في التخفيف الأمثل التي تم الحصول عليها في الخطوة السابقة.
Pipette 10 ميكرولترات من التخفيف البكتيرية resuspended في البئر في أسفل جولة 96 جيدا لوحة الخلية الثقافة. ثم، إضافة 20 ميكرولترات من جسم مضاد مناسب أو علاج المخدرات إلى كل بئر تجريبية في مكررة. بالنسبة لآبار التحكم، استخدم 1XPBS أو OBB حسب المخزن المؤقت المستخدم لآبار المعالجة.
هز لوحة العينة عند حوالي 90 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. لحصاد الخلايا المتمايزة HL60 التي يتم التعامل مع DMF قبل ثلاثة أيام، بيليه الخلايا في 500 مرات G لمدة ثلاث دقائق. تجاهل عظمى وغسل بيليه مع ما لا يقل عن 10 ملليلتر من 1XPBS.
بيليه الخلايا المغسولة في 500 مرة G لمدة ثلاث دقائق. تجاهل افرا و resuspend الخلايا في OBB. إضافة معقمة غير مخففة مصل أرنب الطفل في حجم واحد إلى خمسة النهائي.
بعد استزراع بكتيري لمدة ساعة، قم بتقسيم كل عينة إلى آبار مكررة لمجموعتين. بعد ذلك، إضافة 50 ميكرولترات من خليط HL60 تكملة لكل مجموعة تجريبية من الآبار و 50 ميكرولتر من OBB إلى آبار البكتيريا فقط. يهز 96 لوحة البئر في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
إلى عينات لوحة، تمييع كل بئر مع OBB في حجم واحد إلى خمسة النهائي بحيث كل عينة لديها حجم لا يقل عن 50 ميكرولترات. بعد ذلك، الماصات 50 ميكرولترات من كل عينة مباشرة على منطقة معينة من لوحة ثقافة بكتيرية، وضمان المباعدة الكافية بين العينات. يُغطّى المزيج ويُغطّى ليُجفف لمدة 15 دقيقة تقريباً في درجة حرارة الغرفة.
عكس لوحات والثقافة بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية. بدلا من ذلك، لوحات الاستزراع في الجرار اللاهوائية لاختبار ما إذا كانت الظروف الأنوكسي تؤثر على النمو البكتيري أو للتحكم في مورفولوجيا. بعد الاستزراع بين عشية وضحاها، عد المستعمرات في كل منطقة عينة معينة ثم انتقل إلى تحليل البيانات بمقارنة عدد الخلايا الحية في كل مجموعة إلى عناصر التحكم المقابلة.
من المرجح أن تكون الجوانب الأكثر صعوبة في إنشاء هذه التقنية لأول مرة هي تحسين وحدات CFUs الأولية للمخزون البكتيري ، بالإضافة إلى ضمان تمييز خلايا HL60 بشكل فعال. قبل البدء في OPKA، تم التحقق من صحة HL60 التفريق باستخدام عملية استئصال الخلايا تدفق مع يوديد بروبدييوم كعلامة البقاء. بعد أن تم علاجها مع DMF لمدة ثلاثة أيام، زاد التعبير عن CD35 وانخفض التعبير عن CD71.
تم استخدام متوسط النسب المئوية للبكتيريا CFUs في المجموعات المعالجة HL60 مقارنة مع المجموعات المعالجة غير HL60 المناظرة لمقارنة بقاء الخلايا البكتيرية في العلاجات المختلفة. وأظهرت النتائج أنه مع العلاج الفعال، كانت أعداد المستعمرات مختلفة بين HL60 المشتركة في الثقافة والخلايا HL60، مما يدل على أكثر كفاءة البلعميات. وأظهرت النتائج أنه عندما لم يتم تحسين التخفيف البكتيري أو لم يتم ملاحظة نمو المستعمرة بعناية بعد الطلاء ، يمكن أن يمنع فرط نمو المستعمرات من العد الدقيق للمستعمرات.
أهم شيء يجب تذكره عند محاولة هذا الإجراء هو مراقبة حضانة البكتيريا بعناية وذلك لتجنب فرط نمو وحدات CFUs. في مقايسات الجسم الحي يمكن استخدامها لقنين إزالة البكتيريا الفعالة داخل المضيف. ويمكن استخدام هذه الأقوال لتأكيد فعالية المناعة لوحظت مع OPKA قابلة للترجمة إلى نماذج الإنسان أو الحيوان.
وقد استخدمت عملية القتل opsonophagocytic لـ تأثير كبير في الدراسات البحثية الهامة السابقة لربط العلاجات المضادة للبكتيريا بالاستجابات المناعية الفاتنة. يمكن أن يكون العمل مع مسببات الأمراض البكتيرية خطرًا. يرجى ارتداء معدات شخصية واقية في جميع الأوقات خلال هذه الحسبة.
