تتطلب تقنيات المجهر الجديدة تطوير أدوات كافية للفهم الصحيح للعمليات البيولوجية التي يتم دراستها. يصف هذا البروتوكول خطوات معالجة الصور المطلوبة لتتبع الجزيء الواحد، بما في ذلك تقدير معلمات الانتشار الجانبي والتدين الكمي لحجم البقعة على مسارها بأكمله في غشاء الخلية. يجمع هذا البروتوكول بين استخدام العديد من قطع البرامج ، بما في ذلك ImageJ و MATLAB و uTrack ، بالإضافة إلى بعض البروتينات التي تم تطويرها خصيصًا لهذا البروتوكول.
ويتضح هذا الأسلوب مع تتبع مستقبلات الأغشية تحت المجهر الخفيف، ولكن يمكن تطبيقها على أي هيكل يشبه الجسيمات التي يمكن تتبع مساراتها مع مرور الوقت في تسلسل الفيديو. هذه التقنية تتعلق بالبحوث الأساسية وليس لها تطبيق مباشر في بيئة سريرية. ومع ذلك، يمكن استخدامه للمساعدة في توصيف الأحداث البيولوجية في كل من الأمراض المختلفة، وبالتالي في تحديد أهداف علاجية جديدة.
هذا البروتوكول هو ذات الصلة لتتبع الجسيمات في الأغشية الخلوية، كما هو مبين في هذا الفيديو، ولكن يمكن أيضا أن تطبق لتتبع الخلايا الكاملة، والبكتيريا، والجسيمات النانوية في السوائل، أو أي كائن آخر يمكن تحديد مركزه بشكل جيد. هذا البروتوكول سهل الاستخدام ويتطلب فقط معرفة ثقافة الخلية وتقنيات الفحص المجهري. قد تروع التقنيات المختلفة وأدوات المعلوماتية المستخدمة في هذا البروتوكول مستخدم جديد.
مظاهرة بصرية يساعد المرء على استخدام هذه التقنية مع الثقة. للبدء، تنمو خلايا جوركات، transfect لهم مع أحادية هجم GFP المسمى chemokine مستقبلات ناقلات، وحدد الخلايا مع مستويات التعبير المنخفضة من ناقلات المسمى، كما هو موضح في بروتوكول النص المرافق. إضافة وسائل الإعلام التي تحتوي على CXCL12 ليغاند أو وسائل الإعلام التحكم في كل الليفية المغلفة 35 ملليمتر الزجاج القاع أطباق المايكويل التي تم المغلفة مع fibronectin، واحتضان لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية.
بعد ذلك، أضف الخلايا المفرزة إلى كل طبق، وحضن لمدة 20 دقيقة قبل تصوير الخلايا. بعد الحضانة، نقل الطبق الأول من الخلايا إلى مرحلة المجهر TIRF وتتحول إلى هدف غمر النفط 100x. تحديد موقع والتركيز على الخلايا باستخدام حقل مشرق لتقليل تأثيرات التحسس الضوئي.
ثم قم بالتبديل إلى وضع TIRF وقم بإجراء تعديل التركيز الدقيق باستخدام كثافة الليزر المنخفضة. الحصول على أفلام بطول 50 ثانية تقريبًا، مما يقلل من الفاصل الزمني بين الإطارات. لكل ملف فيديو حالة تجريبية، قم بإنشاء مجلد جديد باتباع توجيهات بنية الملف الموضحة في بروتوكول نص هذا الفيديو.
افتح الفيديو مع فيجي أو ImageJ عن طريق سحب وإسقاط الملف على شريط قوائم فيجي، وانقر على موافق لاستيراد الملف LIF باستخدام الفورم الحيوي. من أجل تصميم قناع، وأيضا استيراد المقابلة متعددة القنوات صورة. بعد ذلك، قم بإنشاء قناع عن طريق إنشاء صورة واحدة أولاً مع القنوات المفيدة لتصميم القناع.
حدد صورة في قائمة الشريط، وانقر على اللون متبوعاً بـ Split Channels لعرض القنوات المختلفة كصور منفصلة. دمج القنوات الثلاث مرة أخرى في صورة واحدة عن طريق تحديد صورة في قائمة الشريط، والذهاب إلى اللون، وتحديد قنوات الدمج. تأكد من تحديد القنوات المناسبة ثم اضغط موافق لإنشاء صورة جديدة غير مكدسة.
مزامنة الإطارين عن طريق الانتقال إلى قائمة الشريط، وتحديد تحليل، ثم الانتقال إلى أدوات وتحديد مزامنة Windows. ستظهر نافذة جديدة مع إمكانيات الصورة المتزامنة. الآن، مع مزامنة الإطارين، يمكن اقتصاص نفس المنطقة في كلا الإطارين.
انتقل إلى صورة في قائمة الشريط وحدد اقتصاص. مع أداة اختيار مستطيلة، رسم المنطقة من الفائدة. سيتم عرض الصورتين المقتصتين بشكل فردي.
بعد ذلك، عدم مزامنة كلا الإطارين. إذا لم يتم إنشاء قناع، ارسم المنطقة التي تهمك باستخدام أداة التحديد والمحاصيل. بعد ذلك، حفظ الفيديو كتسلسل صورة في دليل Videosec.
ثم حدد الصورة متعددة القنوات، انتقل إلى الإضافات في القائمة، وحدد محرر التجزئة لفتح البرنامج المساعد محرر التجزئة. اختر أداة التحديد اليدوي، واستخدمها لتحديد تسمية خضراء وتصميم القناع الخارجي. بمجرد تصميمها، اضغط على زر Plus في خيار التحديد من النافذة المركبة، وسيتم عرض القناع المحدد على العارض.
كرر هذه الخطوة لكافة التسميات. بمجرد تصميم جميع الأقنعة، احفظ القناع بنفس اسم الملف مثل الفيديو، مع الاسم: قناع.tif. افتح MATLAB وأضف دليل uTrack إلى المسار من خلال الانتقال إلى تعيين المسار ، وتحديد إضافة مع.
ثم قم بتغيير "دليل العمل" إلى الدليل الذي يحتوي على سلسلة لتحليل. استدعاء uTrack عن طريق كتابة الفيلم محدد GUI في وحدة التحكم والضغط على أدخل. سيؤدي هذا إلى فتح إطار تحديد الفيلم.
اضغط على زر فيلم جديد، وانتظر حتى تظهر نافذة "إضافة الفيلم". اضغط على إضافة قناة لاختيار الدليل مع الفيديو وملء المعلمات معلومات الفيلم. تعيين الدليل الإخراج لنتائج uTrack إلى النتائج، ثم، اضغط على إعدادات القناة المتقدمة، وملء المعلمات المتعلقة بالاستحواذ، وحفظ.
بعد إنشاء الفيلم، اضغط على متابعة في إطار تحديد الفيلم. هنا، سوف uTrack يسأل عن نوع الكائن ليتم تحليلها. اختر الجسيمات المفردة، ثم ستظهر نافذة لوحة التحكم.
بعد ذلك، حدد الخطوة الأولى، الخطوة 1: الكشف عن، وانقر على الإعداد. سوف تظهر إطار تركيب الخليط الغاوسي الإعداد. أدخل الإعدادات كما هو موضح هنا، ثم اضغط على تطبيق.
في لوحة التحكم، انقر على تشغيل لتشغيل خطوة الكشف. بعد بضع دقائق، تحقق من النتائج عن طريق الضغط على زر النتيجة. يُظهر الفيلم دوائر حمراء على الجسيمات المكتشفة.
إذا لم يتم عرض دائرة حمراء، فإن هذه الخطوة لم تعمل بشكل صحيح ويجب عليك المحاولة مرة أخرى. الآن، دمج الجسيمات التي تم الكشف عنها للتو في المسارات التي تمتد إطارات متعددة عن طريق إعداد المعلمات أولا كما هو مبين هنا. ثم اضغط على تشغيل في لوحة التحكم.
بعد ذلك، قم بإجراء تحليل المسار. تعريف الإعدادات، كما هو موضح هنا، ثم اضغط على تطبيق وتشغيل. تحقق من النتائج عن طريق الضغط أولاً على زر النتيجة ، ثم ، انقر على إظهار رقم المسار من نافذة خيارات الفيلم وتحقق من الإطار حسب الإطار الذي تم تحديده بشكل صحيح كل مسار ، ووضع علامات على الجسيمات التي ليست حقيقية يدويًا.
في MATLAB، أدخل الأمر كما هو موضح هنا. هذا الأمر سوف يسبب البرنامج لقراءة جميع المسارات وحساب معاملات الانتشار. بعد ذلك، استبعاد المسارات المقابلة للبقع أو المسارات التي تم تحديدها بشكل غير صحيح من خلال إعطاء قائمة البقع لاستبعادها.
حساب معاملات الانتشار الفوري لكل واحد من مسارات هذه الخلية باتباعها في بروتوكول النص المصاحب. في هذه الحالة، حساب معامل الانتشار للتخلف الزمني يساوي 4 يسمى D1 إلى 4. عند الانتهاء، تتحلل المسارات إلى مسارات قصيرة وطويلة.
لتحليل المسارات الطويلة، اكتب الأمر كما هو موضح هنا لتصنيف نوع الحركة من خلال طيف قياس اللحظات. تحليل كثافة كل جسيم على طول مسارها. تكوين هذا السلوك الأساسي بطرق مختلفة متعددة باتباعها في بروتوكول النص المصاحب.
ثم، جمع معلومات الانتشار وكثافة لجميع المسارات. جمع فقط معلومات الانتشار وكثافة للمسارات القصيرة. وأخيراً، قم بجمع قياس الطيف في اللحظة ومعلومات الكثافة عن طريق كتابة ما يلي، حيث تكون فترة طويلة هي اللاحقة المستخدمة سابقاً.
ويتيح استخدام التقنيات الموصوفة في هذا البروتوكول إمكانية التتبع الآلي للجسيمات المكتشفة في أفلام المجهر المفلورية وتحليل خصائصها الدينامية. من هذا التحليل، يمكن للمرء الحصول على خصائص مختلفة على أساس الاختلافات في المحفزات. وهذا يشمل، النسبة المئوية للبقع غير المُتحركة استناداً إلى أربعة محفزات مختلفة، والنسبة المئوية للمسارات الطويلة التي تزيد على 50 إطارًا، وأنواع الحركة على طول المسارات على النحو الذي تم تقسيمه بواسطة حركات موجهة أو حرة أو محصورة.
وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تحديد معامل الانتشار، وتكثّل البقعة المتوسط، وعدد المستقبلات لكل جسيم. وهذا يبين توزيع قيم معامل الانتشار القصير لكل بقعة استجابة للمحفزات المختلفة. يمثل الخط الأحمر القيمة الوسيطة، وهذا الرسم البياني المماثل يظهر متوسط كثافة البقعة لكل بقعة على طول إطاراتها العشرين الأولى استجابة لنفس المحفزات.
مرة أخرى، يمثل الخط الأحمر قيمة متوسط الكثافة. كما ترتبط كثافة بقعة تصحيح متوسط مع عدد من البروتينات الفلورية الموجودة في هذه البقعة، يمكن للمرء أن يحسب مباشرة عدد المستقبلات لكل جسيم، كما هو مبين هنا. MATLAB هي لغة برمجة حساسة لحالة الأحرف.
قد تختلف أسماء المتغيرات فيما يتعلق بتلك الموضحة في هذا البروتوكول، ولكن تأكد من أن تكون متناسقة في التسمية. لا يمكن تغيير أسماء الدالات، والفواصل، والقطّر، والفواصل من النقطتين مهمة لبناء جملة صحيح. يسمح المجهر أحادي الجزيء بالتصور للبروتينات الغشاء الفردية مع دقة ملعقة زمنية غير مسبوقة ويوفر فرصًا فريدة للكشف عن الجوانب غير المتوقعة لبيولوجيا الخلايا.
هذه البروتوكولات تفتح أبوابا جديدة للتحليل الكمي لأشرطة الفيديو المجهرية في الخلايا والبيولوجيا الجزيئية.
