خنفساء الخشب سطح الجسم دائما من الصعب في SEM. يتم إضافة Tween-20 إلى حل التثبيت والغسيل. سطح الجسم من خنفساء الخشب في TEM، و Tween-20 يمكن أن تعزز الاختراق المثبت في جدار الجسم وتحسين إصلاح الأنسجة والجهاز في الجسم.
المجهر الفلوريسنس مفيد لتحسين دقة التقطيع. هذه التقنية مفيدة لغسل سطح الجسم والتغلغل في جدار الجسم في خنفساء الخشب. وهكذا ، فإنه واضح SEM ورؤية TEM.
المجهر Fluorescence مفيد لتحسين دقة التقطيع في TEM. وسوف يكون الإجراء هو تشانغ يانرو، وهو طالب دراسات عليا من مختبرنا. في منطقة حيث يعيش Chlorophorus caragana، وضع الفخاخ الحقل الطعم معبات النباتات مثل إيسوبوروني على فخ القمع.
جذب الخنفساء الحطب البالغين في الفخاخ. الحفاظ على الهيئات النظيفة من Chlorophorus caragana الكبار في 0.1 الخلد لكل لتر برنامج تلفزيوني في 7.2، 2.5٪ الوزن من قبل جلولالدهيد حجم، و 0.06٪ حجم من قبل حجم Tween-20. إصلاح العينة في أربع درجات مئوية لمدة ثلاثة أيام.
إزالة الهيئات من السائل الحفاظ وشطف في برنامج تلفزيوني. تحت مجهر ستيريو، واستخدام ملقط لإزالة الزوائد وتنظيفها بالموجات فوق الصوتية في 40 كيلوهيرتز في PBST. بعد التنظيف لمدة 100 ثانية، قم بنقل العينة إلى المجهر للتحقق مما إذا كانت نظيفة.
لا تنظف أكثر من 400 ثانية لتجنب الضرر. ثم تزج العينات في الإيثانول في سلسلة من التركيزات لمدة 20 دقيقة لكل من إجراء الجفاف. بعد الجفاف، تحت مجهر ستيريو، واستخدام الكربون على الوجهين شريط لاصق لإصلاح منفصل ثلاثة أسطح المراقبة، الظهرية، البطنية، والجانبية، على كعب.
تأكد من أن جميع أسطح المشاهدة نظيفة وخالية من التلوث. ضع مرحلة العينة في طبق بيتري يحتوي على هلام السيليكا للديوكيانت لمدة 48 ساعة. المقبل، على أداة بصق الأيون، تدوير الصمام الرئيسي إلى موقف مفتوح، وإزالة غطاء غرفة عينة ووضع العينة في الغرفة.
قم بتشغيل مفتاح الطاقة وتأكد من تشغيل الضوء الجاهز. تعيين الوقت sputtering 45 ثانية وسمك الطلاء كما 70.875 angstrom. مرة واحدة في مضخة الميكانيكية فراغ مؤشر الطلب ينخفض إلى أقل من سبعة، والتفريغ الصحافة والبدء في رش البلاتين.
في نهاية الإجراء، إيقاف التيار الكهربائي وأخذ العينة من الغرفة. حساب سمك فيلم رذاذ D في angstrom يساوي K مرات أنا مرات V مرات T.K هو ثابت يحدده المعدن والغاز sputtered. أنا تدفق البلازما في milliamps في حين V هو الجهد المطبقة في كيلوفولت و T هو الوقت في ثوان.
إدراج كعب الروتين الذي يحتوي على العينة على المرحلة من SEM. تأكد من أن مرحلة العينة مع كعب العينة لديها ارتفاع كاف للسماح صورة جيدة. افتح برنامج SEM وحدد الجهد التشغيلي المطلوب ابتداء من 20 كيلوفولت.
بعد الحصول على الزوائد من Chlorophorus caragana الكبار، وغسل العينات في PBST في حمام بالموجات فوق الصوتية لمدة ثلاث ساعات ومن ثم بعد إصلاح لهم في 1٪ الوزن من قبل حجم أوسميوم تتروكسيد في برنامج تلفزيوني لمدة ساعة واحدة في 25 درجة مئوية. تجفيف العينات باستخدام العلاجات المتعاقبة لمدة 20 دقيقة في 50٪60٪70٪80٪85٪90٪95٪100٪و100٪ حجم من قبل الإيثانول الحجمي في درجة حرارة الغرفة. مع ملقط، وتطبيق الراتنج ساخنة في قالب التضمين شقة وتضمين العينات في الراتنج.
تأكد من أن العينة في الجزء السفلي من لوحة ووضعها في أقرب وقت ممكن إلى حافة الأخدود راحة. تسمية ثم احتضان لوحة تحتوي على عينة في 60 درجة مئوية لمدة 72 ساعة. بعد الحضانة، وإزالة لوحة من الحاضنة والتحقق من أن الراتنج قد بلمرة.
بمجرد أن تتوطد العينة، ضع كل كتلة راتنج تحت مجهر الفلوريسنس، حرك مصدر الضوء الفلوري للمجهر لتشعيع العينة بالضوء الأزرق من الأعلى وتصويرها. تأكد من أن سينسيلا في كتلة الراتنج واضحة للعيان. قياس المسافة بين حافة كتلة الراتنج وأجهزة الاستشعار الهدف لاستهداف sensilla.
الرجوع إلى صورة SEM من ابال وقطع تقريبا كتلة الراتنج مع شفرة حلاقة قريبة من مستقبلات الهدف. بعد ذلك، تحت المجهر الفلوري الضوء الأزرق، وضبط مصدر الضوء من فوق بحيث يتم رصد sensilla بوضوح. إضافة ميكرومتر الهدف إلى مرحلة المجهر الفلوريسين.
تصوير كتلة الراتنج قطع تقريبا ثم باستخدام ImageJ قياس المسافة بين الهدف وحافة الراتنج. ضع عينة الراتنج على استئصال فائق الانبعاثات وقطع 50 إلى 60 جزءًا من نانومتر سميكًا حتى يتم الوصول إلى الموضع المستهدف. جبل المقاطع على formvar المغلفة 100 شبكات النحاس شبكة في أطباق بيتري.
وصمة عار الشبكات مع محلول مشبّه من خلات أورانيل في درجة حرارة الغرفة. تغطية المقاطع أثناء تلطيخ لمنع الترسبات الناجمة عن الضوء. وصمة لمدة 10 دقائق.
في غطاء الدخان، شطف مرتين في 50٪ الميثانول، ثم مرتين في المياه المصفاة ديغاوس. مكان قطرات من الرصاص إعداد سيترات وصمة عار على الساحات من أطباق بيتري البلاستيكية والسماح لهم الجلوس لمدة ثماني دقائق. شطف في المياه المصفاة دي الغاز وجافة.
قم بتركيب الشبكات على مرحلة عينة داخل جهاز TEM. تعيين الجهد إلى 80 كيلو فولت ودراسة المقاطع. في هذا البروتوكول ، وذلك باستخدام التنظيف والحل المثبت مع Tween - 20 ، لوحظ صورة واضحة SEM من ذلك دون Tween - 20.
مع حل إصلاح Tween-20 السماح لحل تحديد الجلوتارالدهيد لاختراق الأنسجة، وشوهدت هياكل ميكروتوبول بوضوح في الصورة TEM في حين أن الهيكل الداخلي للعينة أعدت دون Tween-20 كان ضبابية. أظهرت وجهات النظر المقطعية المستمرة للر بيغ من النوع واحد سينسيلا غصن basiconica على عابس maxillary أن غمد التشعب تحيط شرائح dendritic الخارجي وامتدت إلى مسام تلميح. سبعة أجزاء dendritic الخارجي غير متشعب موجودة داخل تجويف اللمفية مستقبلات الداخلية التي كانت محاطة تجويف الخارجي.
تم فصل الجسم الأنبوبي بواسطة اغمد متشعب من أجزاء التشعب الخارجية الأخرى في كل قاعدة مقبس سنسيلار. في المنطقة الهدّية، تم تحديد ثمانية تشعبات من أقطار مختلفة تشير إلى وجود ثمانية خلايا عصبية ثنائية القطب. ويمكن استخدام هذه التقنية لمواصلة دراسة وظيفة الأعصاب مثل تسجيل خلية واحدة أو التهجين في الموقع.
