يوفر بروتوكول لدينا على حد سواء في الجسم الحي والتدابير السابقة vivo لتصور وتتميز الأوعية الدموية الهيالويد داخل العين كنموذج تجريبي مفيد لدراسة تراجع الأوعية الدموية. هذه التقنية يجمع بين كل من في الرصد الطولي الجسم الحي من الأوعية الهيالويد في الفئران الحية والتصور السابقين vivo والكمية دقيقة من الأوعية الهيالويد كاملة تشريح. توفر تقنيتنا طريقة عملية ومجدية لدراسة التسبب والآليات الأساسية لأوعية الجنين المستمرة.
توفر هذه الطريقة أيضًا نظرة ثاقبة على الآليات الخلوية والجزيئية المشاركة في تنظيم تراجع الأوعية الدموية العينية التي قد تكون ذات صلة بالأبحاث المتعلقة بتولد الأوعية في أجهزة أخرى. قد تكون خطوات العزل الهيالويد صعبة من الناحية الفنية للمبتدئين. الكثير من الممارسة والصبر سوف تساعد على ضمان تشريح ناجحة.
وسيتيح تصور هذه الطريقة معلومات عملية مفصلة ونصائح حول هذه التقنية التي قد تساعد المشاهدين في إتقان المهارات بشكل أكثر كفاءة. بالنسبة للتصوير المقطعي للتماسك البصري أو تصوير OCT، اضبط الماوس والمسبار بحيث يكون رأس العصب البصري في مركز المجال البصري في صورة القاع وضبط التركيز وزاوية الخط المشار إليه في برنامج التصوير في OCT للكشف عن أوعية الهيالويد الثابتة قبل الحصول على الصور. بالنسبة لتصوير الأوعية الدموية في الفلوروس الأوعية الهيالويد، اضبط المحاذاة قليلاً لوضع رأس العصب البصري في وسط مجال الرؤية وتغيير فلتر المجهر إلى قناة فلورية خضراء.
ثم التركيز على أوعية الهيالويد المستمرة والحصول على صور متعددة في واحد وثلاثة وخمسة و10 دقائق بعد الحقن لتحديد أفضل نقطة زمنية لنسبة الإشارة إلى الخلفية لمراقبة السفن. لتشريح الأوعية الفيفو السابق والتصور استخدام ملقط الجراحة المجهرية لفتح الجفون من الفأرة بعد الولادة اليوم الثامن ووضع ملقط الجراحة المجهرية المنحنية تحت الكرة الأرضية في مدار عين واحدة لفهم العصب البصري دون الضغط على مقلة العين. سحب بلطف وإزالة مقلة العين مع ملقط وإصلاح العين في 4٪ شبهformaldehyde في درجة حرارة الغرفة.
بعد 30 دقيقة نقل مقل العيون الثابتة إلى الجليد الباردة PBS تحت مجهر تشريح وحقن 50 ميكرولترات من محلول الجيلاتين في الجسم الزجاجي من مقلة العين في أربعة مواقع مختلفة متباعدة بالتساوي حول limbus. ثم احتضان مقلة العين على الجليد لمدة 30 دقيقة لترسيخ الجيلاتين المحقون داخل الفضاء الزجاجي. عندما شفي الجيلاتين نقل مقلة العين إلى طبق بيتري من برنامج تلفزيوني تحت المجهر تشريح واستخدام مقص الجراحة المجهرية لجعل شق في limbus لإزالة القرنية.
قص وإزالة العصب البصري تحت المجهر تشريح. باستخدام اثنين من أزواج من ملقط قشر قبالة والتخلص من طبقات ظهارة الصباغ تصلب، المشيمية وشبكية، تليها إزالة القزحية. مع جانب العصب البصري من شبكية العين التي تواجه صعودا والعدسات التي تواجهها إلى أسفل، وحقن 50 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني فقط تحت كأس شبكية العين للسماح تراكم برنامج تلفزيوني بين الجسم الزجاجي الجيلاتي والشبكية.
استخدام ملقط microsurgery لتقشير بلطف كأس شبكية العين والجسم ciliary من الجسم الزجاجي. باستخدام نقل الأنابيب نقل كأس الجيلاتين التي تحتوي على أنسجة الهيالويد مغمورة في برنامج تلفزيوني إلى شريحة المجهر. وتحويل الأنسجة المتبقية على بحيث تواجه العدسة.
ثم رفع العدسة وتخفيف بلطف الاتصال بين عدسة عدسة vasculosa lentis و vasa hyaloidea propria قبل قطع الشريان الهيالويد مع مقص microsurgery لإزالة عدسة tunica vasculosa lentis. الحفاظ على منطقة فاسا hyaloidea بروبريا من كأس الهيالويد لجبل شقة. لتركيب شقة من عينات السفينة hyaloid بلطف شطف كأس الهيالويد مع برنامج تلفزيوني جديد لإزالة أي الحطام تشريح.
مع الأنسجة العائمة في برنامج تلفزيوني استخدام ملقط microsurgery لترتيب بلطف وضبط موقف الكأس الهيالويد الجيلاتيين بحيث حافة الكأس تواجه لأسفل. ضع الشريحة مع كأس الهيالويد المغمور في PBS على شريحة أكثر دفئًا عند 37 درجة مئوية. بعد يذوب الجيلاتين ويسطح الهيالويد إزالة الشريحة عندما يكون بالكاد الجافة وإضافة قطرة من مضادة للتلاشي تصاعد المتوسطة مع DAPI لطخة النوى في الأوعية الهيالويد.
ثم ضع برفق غطاء على الهيالويد لإكمال جبل شقة. لتصوير تلطيخ DAPI لأوعية الهيالويد نقل العينة المركبة على خشبة المجهر الفلورسنت والتأكد من أن الشريان الهيالويد المركزي مرئي. ثم تحديد فروع السفينة المستمدة مباشرة من الشريان الهيالويد وحص يدويا عدد فروع السفينة لتحديد كم.
هنا، تظهر وجهات النظر المقطعية العرضية لصور OCT للأنسجة الشبكية والهياويد في النوع البري الذي يبلغ من العمر ثلاثة أشهر والبروتين ذو الصلة بمستقبلات البروتين الدهني منخفض الكثافة خمسة أو فئران خروج المغلوب LRP5، وهو نموذج حيواني مع أوعية الهيالويد الثابتة. في هذه الصور الأوعية الفلورية من الأوعية الهيالويد المستمرة لوحظ ثمانية فروع من الأوعية الهيالويد في الجسم الزجاجي من الفئران خروج المغلوب ستة أسابيع القديمة في حين لا توجد بقايا من الأوعية هيالويد لوحظ في الحيوانات من النوع البرية من نفس العمر. في هذه السفينة مسطحة hyaloid يتصاعد خلايا الأوعية الدموية والضامة المرتبطة بها يمكن تحديدها من قبل تلطيخ DAPI النووية.
وكل خط من الخلايا المتفرعة من الشريان الهيالويد المركزي يمثل وعاء واحد من بروبريا الفاسة الهياويد. الفئران من النوع البري لديها في المتوسط 12 فرعا من الأوعية الهيالويد في اليوم التالي للولادة ثمانية، في حين أن العمر مطابقة LRP5 الجراء بالضربة القاضية المعرض حوالي 25 فرعا من الأوعية الهيالويد مما يدل على تراجع ضعف كبير من الأوعية الدموية الهيالويد. بالإضافة إلى ذلك ، لوحظ أيضًا تأخر نمو الأوعية الدموية في الشبكية وعدم اكتماله في الجراء خروجي LRP5.
في الواقع، لا يزال يمكن تحديد الأوعية الهيالويد في المقاطع العرضية من LRP5 أقسام أنسجة العين خروج المغلوب في اليوم بعد الولادة ثمانية. في حين أن عيون نوع البرية لم تعد تعرض هذه الأوعية. أهم شيء أن نتذكر أن يكون لطيف والمريض عند عزل نظام الهيالويد من شبكية العين وغيرها من الأنسجة العينية.
بعد عزل الأوعية الهيالويد المثبطة للمناعة مع علامات الخلية المختلفة يمكن تنفيذها للكشف عن التفاعلات الخلوية التي تنظم تراجع الهيالويد. هذه التقنية يستكشف الآليات الخلوية والجزيئية الكامنة من الأوعية الدموية الجنينية المستمرة في أبحاث الأوعية الدموية العينية. Paraformaldehyde، الكيتامين، والزيلازين خطرة.
يرجى إعداد هذه الكواشف في غطاء الدخان الكيميائية باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة.
