إن استخدام الفيروسات المؤتلفة هو تقنية قوية لفك رموز آليات النسخ الفيروسي ولتوفير منصات تطوير للقاحات. وبالمثل، فإن توليد مخزون فيروسي جيد النوعية أمر بالغ الأهمية لكل دراسة فيروسية من أهم البحوث الأساسية إلى الدراسات التطبيقية. إن إنقاذ الفيروسات المؤتلفة والحصاد الأمثل والتجميد والتكفير من مخزونات RSV هي طرق حاسمة لجميع الدراسات الفيروسية.
ويمكن اعتبارها تقليدية ولكنها تظل حساسة وتتطلب خبرة محددة. في اليوم السابق لتحول، قم بتعليق خلايا BSR-T7/5 في وسط كامل عند تركيز 0.5 مليون خلية لكل ملليلتر. توزيع مليلترين من تعليق الخلية في بئر في لوحة ستة جيدا.
احتضان لوحة في 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون حتى تصل إلى 80-90٪ التقاء في اليوم التالي. لإنقاذ كل فيروس، مزيج أولا ذاب ناقلات الجينات العكسية في أنبوب، ثم المضي قدما في transfection، بعد بروتوكول الشركة المصنعة transfection كاشف. يضاف التالي 250 ميكرولترات من متوسطة المصل المخفضة إلى النواقل المختلطة.
في أنبوب آخر، تمييع 10 ميكرولترات من هذا كاشف transfection في 250 ميكرولترات من متوسطة المصل المخفضة. دوامة بلطف كلا الأنابيب وانتظر لمدة خمس دقائق. اخلطي محتويات كلا الأنبوبين وانتظري لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
وفي الوقت نفسه، شطف الخلايا BSR-T7/5 مع ملليلتر واحد من متوسطة المصل المنخفضة وتوزيع 1.5 ملليلتر من الحد الأدنى من المضادات الحيوية الأساسية وسائل الإعلام تكملة مجانية مع مصل عجل الجنين 10٪ في البئر. إذا لزم الأمر، احتضان في 37 درجة مئوية في بيئة ثاني أكسيد الكربون 5٪. بعد الحضانة لمدة 20 دقيقة، إضافة 500 ميكرولترات من مزيج transfection في كل بئر.
احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية في بيئة 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاثة أيام. لمراقبة كفاءة الإنقاذ، لاحظ في الفلوري GFP تحت مجهر الفلورانس المقلوب بمعدل 20X مرة واحدة في اليوم. في اليوم الثالث من transfection، خلايا خدش في كل بئر من BSR-T7/5 6-جيدا لوحة.
نقل الخلايا و supernatant من كل بئر في أنبوب معقم ميليمترية مركزية. لإطلاق الفيروس الذي تم إنقاذه من أغشية الخلايا ، دوامة كل أنبوب بقوة لمدة 30 ثانية على الأقل. لأول تضخيم للفيروسات التي تم إنقاذها ، قم أولا بإزالة الوسط الثقافي من لوحة HEp-2 المصنفة في اليوم السابق ، ثم إضافة بسرعة 500 ميكرولترتر لكل بئر من التعليق الفيروسي الطازج الممر صفر.
ضع لوحة HEp-2 في 37 درجة مئوية على الروك المناشار للهياج الناعم لمدة ساعتين. لإنتاج مرور الأول من الفيروسات التي تم إنقاذها، والتخلص من 500 ميكرولترات من inoculum وإضافة ملليلتر اثنين من MEM مع 2٪ FCS. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاثة أيام.
لرصد العدوى تحت مجهر الفلورانس المقلوب في التكبير 20X، لاحظ الفلورس GFP من الخلايا HEp-2 المصابة بتعليق مرور صفر مرة واحدة في اليوم. تحت المجهر brightfield، مراقبة مظهر تزامنية صغيرة ومفرزة الخلايا، والتي تعكس تأثير cytopathic RSV. لتضخيم الفيروسات التي تم إنقاذها ، أولاً تخفيف التعليق الفيروسي لـ MEM الخالية من FCS للحصول على تعليق ثلاثي المليلتر عند 50 ، 000 PFU لكل ملليلتر ، ثم إزالة الوسيط من قارورة HEp-2.
سرعان ما إضافة تعليق الفيروسية ثلاثة ملليلتر واحتضان القارورة في 37 درجة مئوية على الروك المنشار للتحريض لينة لمدة ساعتين. بعد إزالة والتخلص من inoculum وإضافة 15 ملليلتر من MEM مع 2٪ FCS. احتضان في 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة يومين إلى أربعة أيام.
لتقدير الوقت المناسب لحصاد الفيروسات، تحقق من مورفولوجيا الخلية وفلورية GFP تحت مجهر الفلورانس المقلوب في التكبير 20X. لاحظ أن هذا عادةً عندما 50٪ إلى 80٪ من طبقة الخلية HEp-2 يتم فصل بسبب تأثير RSV cytopathic الذي يحدث بين 48 و 72 ساعة بعد الإصابة. بعد ذلك كشط جميع الخلايا باستخدام مكشطة الخلية.
جمع كل من الخلايا والمازن معا ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي 50 ملليلتر. أضف 1/10 من حجم حل حفظ 10X RSV. دوامة الأنابيب بقوة لمدة خمس ثوان والطرد المركزي لمدة خمس دقائق في 200 مرة ز لتوضيح التعليق.
نقل المُنطَر إلى أنبوب 50 ملليلتر. دوامة لفترة وجيزة و aliquot التعليق في أنابيب المبردة وصفت مع العلامات المقاومة للكحول. غمر الأنبوب في الكحول قبل التبريد ، ناقص 80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل وتخزينها عند ناقص 80 درجة مئوية.
لإجراء فحص البلاك، أولا جعل 2X الحد الأدنى المتوسطة الأساسية عن طريق تمييع التجارية 10X MEM مع الماء المعقم وإضافة L-الجلوتامين، 1، 000 وحدة لكل المليلتر البنسلين، وواحد ملليغرام لكل ملليلتر ستريبتوميسين. يهز تخفيف بقوة وتخزينها في أربع درجات مئوية، ثم إضافة 900 ميكرولترات من MEM خالية من FCS إلى ستة أنابيب. ذوبان aliquots الفيروس ودوامة لهم بقوة لمدة خمس ثوان.
لجعل التخفيفات التسلسلية، أولا إضافة 100 ميكرولترات من الفيروس إلى 900 ميكرولترات من المتوسطة في الأنبوب الأول. وضع الغطاء على الأنبوب وخلط محتوياته عن طريق دوامة لبضع ثوان، ثم إضافة 100 ميكرولترات من التخفيف الأول إلى 900 ميكرولترات من المتوسط في الأنبوب الثاني. ضع الغطاء على الأنبوب و الدوامة.
كرر هذا الإجراء حتى الأنبوب السادس. اكتب اسم الفيروس و التخفيفات الكاملة على لوحات HEp-2 12-well. أضف علامة لمطابقة اللوحة وغطائها لأنه قد يتم فصلها أثناء التلطيخ.
إزالة المتوسطة من لوحات وتوزيع 400 ميكرولترات من تخفيف واحد في البئر. احتضان لوحات في 37 درجة مئوية لمدة ساعتين لامصاصة الفيروس. أثناء امتزاز الفيروس، وإعداد تراكب السليلوز microcrystalline عن طريق ضبط أولاً الأسى من 2X MEM إلى حوالي 7.2 مع محلول بيكربونات الصوديوم العقيمة في 7.5٪ بعد مؤشر اللون.
للحصول على 100 ملليلتر من تراكب, إضافة 10 ملليلتر من 2X MEM, 10 ملليلتر من 2.4٪ تعليق السليلوز أحادي البلورات, و 80 ملليلتر من MEM تكمل مع 2٪ FCS ومزيج بقوة. في نهاية الحضانة لمدة ساعتين، إضافة 2-3 ملليلتر من تراكب إلى كل بئر من لوحات 12-آبار دون إزالة inoculum. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ستة أيام.
لطخة الخلايا مع حل البنفسج الكريستال، أولا يهز بلطف لوحات لخلع تراكب السليلوز microcrystalline. إزالة عظمى وغسل الخلايا مرتين مع 1X PBS، ثم إضافة ملليلتر واحد إلى اثنين من الحل البنفسجي الكريستال وانتظر 10 إلى 15 دقيقة. إزالة الحل، والتي يمكن إعادة استخدامها لتلوين لوحة اللاحقة.
وأخيراً تحسب فيروسات الهتر كجزء من عدد اللويحات المرئية في آبار الصفائح الجافة وحجم الترسبات المخففة. أداء فحص لوحة على السيطرة السلبية، transed مع بلازميدات التعبير فقط من N، P، L، و M2-1 كشفت لا لوحة في أدنى تخفيف. ومن المتوقع أن تكون النترات التي تم الحصول عليها من الخلايا المصابة بالعدوى أعلى من 100 وحدة في كل ملليلتر إذا كانت عملية الإنقاذ فعالة.
زاد الاترات على الممرات ليصل مليون إلى 10 مليون PFU لكل ملليلتر عند مرور واحد أو اثنين. بفضل هذه الفيروسات الفلورية، تثبيط التعبير RSV عن طريق سيرنا استهداف البروتين N والبروتين الخلوي IMPDH يمكن بسهولة أن يلاحظ ويقاس. في المقابل، لوحظ إشارة قوية GFP على خلايا التحكم المصابة غير المستهدفة سيرنا أو الخلايا التي تحتوي على الرنا ضد البروتين الخلوي GAPDH وتم قياسها.
وبالمثل، مكنت هذه الفيروسات من سهولة مراقبة تثبيط الضرب RSV بواسطة مركب مضاد للفيروسات. أظهر تتبع البروتين الفلوري M2-1 في الخلايا المصابة HEp-2 IBs والحبيبات المرتبطة بIB كهياكل ديناميكية للغاية. ولوحظ أن الهياكل المتحركة والخروية قادرة على الصمامات وتشكيل تدرجات كروية أكبر.
خضعت حبيبات مرتبطة بIB لدورات تفكيك تجميعية مستمرة مع تكوين حبيبات صغيرة مرتبطة بـ IB نمت ، وانصهرت في حبيبات كبيرة مرتبطة بـ IB ، ثم اختفت. بروتوكول المعايرة البلاك من RSV باستخدام تراكب السليلوز microcrystalline يمكن تكييفها بسهولة مع الخلايا الأخرى و / أو الفيروسات الأخرى. وسوف يتطلب تعديل تركيز السليلوز microcrystalline.
