Siderophores هي الوزن الجزيئي المنخفض، والمعادن chelating الجزيئات الحيوية المشاركة في ركوب الدراجات الحديد في البيئة. ويسمح هذا البروتوكول بإجراء تقييم سريع للإنتاجية العالية لنشاط الروبا في عينات التربة والنبات. وقد قضت الطرق السابقة للكشف عن siderophore البيئة الحاسمة للمجتمع الميكروبي.
يسمح أسلوبنا بالكشف داخل المجتمع الميكروبي السليم نسبيًا والموئل الذي شارك فيه. ونظراً لأن توافر الحديد أمر حاسم بالنسبة للإنتاجية الزراعية، يمكن استخدام هذا البروتوكول في دراسة دور الميكروبات في تعديل توافر الحديد للنباتات. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذه الطريقة لتقييم أثر ممارسات إدارة المزارع على صحة التربة والمجتمعات المنتجة للتربة الجانبية وكذلك تنمية هذه المجتمعات على مر الزمن.
للبدء، وحمض غسل جميع الأواني الزجاجية في 100 ملليمولور هيدروكلوريك 100 ملليمولار حمض النيتريك لمدة لا تقل عن ساعتين قبل استخدامها في CAS مقايسة. إعداد مقلاة الخبز الألومنيوم مليئة الرمال المختبرية الصف وتغطية ذلك مع رقائق الألومنيوم. أوتوكلاف عند درجة حرارة 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة وتوضع جانباً.
إعداد HDTMA بإضافة 0365 غراما إلى 20 ملليلتر من المياه ذات الأيونات المزدوجة، ووضع الحل في حمام مائي في 37 درجة مئوية لتعزيز solubilization. أضف 0302 جرام من CAS إلى 25 ملليلتر من الماء المزدوج المُتأَدّد مع التحريك بلطف مع بار مُعقّم مُقلّد مغناطيسي. ثم إضافة خمسة ملليلترات من كلوريد الحديد المولر واحد الهكساهيد إلى 25 ملليلتر من حل CAS مع الاستمرار في تحريك بلطف.
الآن، ببطء إضافة 20 ملليلتر من حل HDTMA في الحل الحديد CAS المعقدة مع اثارة بلطف. إعداد حل العازلة عن طريق حل 15.12 غرام من PIPES في 375 ملليلتر من المياه المزدوجة deionized مع اثارة بلطف. ضبط درجة اله pH إلى 6.8 مع خمسة هيدروكسيد الصوديوم الضرس.
ثم يضاف الماء إلى رفع مستوى الصوت إلى 450 ملليلتر. الآن أضف خمسة غرامات من (أغادروز) إلى المحلّل. اركب محلول العازلة PIPES وحل مركب CAS الحديد في 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
إضافة بعناية لكامل من الحديد CAS حل مركب لكامل المخزن المؤقت PIPES في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية بعد كل واحد منهم قد تم autoclaved. وضع حل مختلط في حمام مائي في 50 درجة مئوية. الآن ضع قارب كاشف معقمة في الرمال العقيمة داخل مجلس الوزراء السلامة الحيوية والحرارة إلى 50 درجة مئوية.
نقل الحديد CAS مجمع agar إلى القارب، ثم بسرعة aliquot 100 ميكرولترات إلى كل بئر من واضحة مسطحة القاع معقم 96 جيدا. إعداد 800 pyoverdine micromolar القياسية في المعدة سابقا M9 المتوسطة المعدلة. تخفيف الحل إلى حلول 400 و 200 و 100 و 50 و 25 و 12.5 و 6.25 من حلول ميكرومولار.
أضف EDTA إلى 500 ملليلتر من متوسط M9 المعدل المعد مسبقًا لإعداد معيار EDTA 3.2 ملليمولار. تخفيف هذا الحل في 1600، 800، 400، 200، 100، 50، 25، 12.5، و 6.25 حلول ميكرومولار. لتوليد منحنى قياسي، إضافة 100 ميكرولترات من كل تركيز من pyoverdine وEDTA لفصل آبار من 96 بئرا صغيرة تحتوي على 100 ميكرولترات من الحديد CAS مجمع Agar المتوسطة.
جعل تكرار النسخ المتماثلة التقنية من كل تركيز. إضافة أيضا آبار فارغة مع M9 فقط. باستخدام قارئ microplate، قياس امتصاص بعد واحد، ست، و 24 ساعة الحضانة في 22 درجة مئوية، واستخدام قياسات الامتصاص لتوليد منحنيات القياسية. غسل معدات أخذ العينات مع 22 ميكرون تصفية مزدوجة المياه deionized تليها 70٪ الإيثانول ومسح مع المناشف الورقية.
قم بإجراء الغسيل قبل أخذ العينات وبين العينات للحفاظ على تقنية معقم والحد من التلوث المتبادل. بعد استئصال الأنسجة النباتية والتنقيب عن كرة جذر صغيرة من النباتات في الحقل ، ضع كرة الجذر في كيس بلاستيكي منفصل يحمل علامة لفصل العينة في بيئة المختبر. ضع جميع العينات مباشرة على الجليد والاحتفاظ بها عند أربع درجات مئوية حتى تتم معالجة العينات لمحسبة إنتاج siderophore.
فصل عينات التربة المرتبطة الجذر إلى الجزء الأكبر، وتربة ريزوسفير مقيدة بشكل فضفاض وتربة ريزوسفير مقيدة بإحكام. للقيام بذلك، واتخاذ الكرات الجذر من الحقائب وتهز بلطف قبالة التربة من الكرة الجذر. يهز قبالة التربة، جنبا إلى جنب مع التربة التي تركت في الحقيبة، تشكل التربة السائبة.
هذه هي التربة ريزوسفير مربوطة فضفاضة. توليد التربة rhizopshere مقيدة بإحكام عن طريق اتخاذ الجذور مع العينة مقيدة بإحكام ووضعها في أنبوب الطرد المركزي. إضافة 30 ملليلتر من المياه المزدوجة ودوة الدوامة لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق.
إزالة الجذور للحصول على تخفيف التربة rhizosphere ملزمة بإحكام. التجانس كل عينة التربة داخل كيس العينة عن طريق خلط وتحويل التربة قدر الإمكان دون فتح الحقيبة. بعد أن تم خلط كل عينة بشكل دقيق، aliquot وتعليق غرامين من كل عينة التربة في 20 ملليلتر من M9 المتوسطة المعدلة داخل أنبوب معقمة 50 ملليلتر الطرد المركزي.
تخفيف العينة ثم ختم الأنبوب مع سد رغوة معقمة للسماح بالتهيّم. وبالنسبة لعينات ريزوسفير المقيدة بإحكام، يضاف مللتين من ملاط التربة ريزوسفير إلى 20 ملليلتراً من متوسط M9 المعدل داخل أنبوب معقّم من أجهزة الطرد المركزي سعة 50 ملليلتر. تخفيف العينة ثم ختم الأنبوب مع سد رغوة معقمة للسماح بالتهيّم.
لإعداد عينة الأنسجة، سطح تعقيم الجذر، واطلاق النار، والحبوب مع 70٪الإيثانول. Macerate غرامين من الأنسجة الطازجة في 20 ملليلتر من M9 المتوسطة المعدلة باستخدام خلاط على ارتفاع لمدة 30 ثانية. ثم، نقل العينة إلى أنبوب جهاز طرد مركزي 50 ملليلتر معقمة، وتمييع، وختم الأنبوب مع قابس رغوة معقمة.
لإثراء إنتاج siderophore من خلال الحد من الحديد احتضان أنابيب الطرد المركزي 50 ملليلتر في درجة حرارة الغرفة ويهتز في 160 دورة في الدقيقة. في 24 و 48 و 72 ساعة بعد بدء زراعة التخصيب، إزالة 1 ملليلتر من أنابيب التخصيب باستخدام تقنية معقمة. الطرد المركزي في subsamples في 10،000 مرات G لمدة دقيقة واحدة في اثنين من أنابيب أجهزة الطرد المركزي ملليلتر لتكوير الخلايا.
باستخدام تقنية معقمة، إضافة 100 ميكرولترات من السوبر إلى حل 100 ميكرولتر من الحديد CAS agar مجمع في مكررة أو ثلاثية في داخل microplate. إضافة أيضا 100 ميكرولترات من M9 المتوسطة العقيمة كما الفراغات. ثم احتضان لوحة في 28 درجة مئوية.
يجب أن تكون كل لوحة مختومة ومغطاة مع احباط قبل وضع في الحاضنة. تعليق ما تبقى من افرط و بيليه لكل عينة في أنبوب الطرد المركزي الخاص بها معقمة اثنين ملليلتر. إضافة 400 ميكرولتررس من الجلسرين العقيمة في كل أنبوب عظمى عينة وإعادة تعليق بيليه لخلق الأسهم الجلسرين.
تجميد المخزون في ناقص 80 درجة مئوية لتحليلها في وقت لاحق. قياس امتصاص في ست، 24، 48، و 72 ساعة في الطول الموجي من 420 نانومتر. وقد استخدم خليط البيوفردين البيولوجي من قبل فلوريس Pseudomonas كمعيار لتفسير وقياس امتصاص العينات في عينات من معادلة البيوفردين في micromolar.
تظهر هنا العلاقة بين الامتصاص عند 420 نانومتر وتركيز الـ pyoverdine. تم تقييم نشاط Siderophore للإثراء لمدة 72 ساعة في 48 ساعة حضانة لتحديد تأثير النمط الجيني ونوع العينة على عزل siderophore. وكان نشاط Siderophore في عينات التربة السائبة منخفضا نسبيا ولم تظهر فروق بين النمط الوراثي للقمح الذي أخذت منه عينات التربة السائبة.
ومع ذلك، أظهرت عمليات إثراء التربة المربوطة بشكل فضفاض المعزولة عن النمط الجيني 725 إنتاجًا أكبر من جانبية مقارنة بالتربة المربوطة بشكل فضفاض من مادسن و727 ولكن ليس من ليوجين. وعلى العكس من ذلك، لم يتأثر إنتاج الهروب في الإثراءات من التربة المقيدة بإحكام تأثراً شديداً بالنمط الجيني. الثقافات الإثراء من أنسجة الحبوب أسفرت عن انخفاض الإنتاج siderophore نسبيا بغض النظر عن النمط الجيني.
وكان الإثراء من أنسجة تبادل لاطلاق النار Lewjain أقل بكثير من إنتاج siderophore من الأنماط الجينية الأخرى، و 725 تبادل لاطلاق النار الثقافات الأنسجة أسفرت عن إنتاج siderophore أكثر متغيرة. ولوحظ أكبر فرق في نشاط siderophore في الثقافات إثراء الأنسجة الجذرية حيث كان 725 أكثر من 200٪ نشاط جانبية أكبر من جميع الأنماط الجينية الأخرى. واحدة من أكثر الجوانب الضريبية لتنفيذ البروتوكول هو الحفاظ على الظروف العقيمة مع استكمال العديد من الخطوات لتوليد الحديد Agar لوحة CAS واختبار عينات لنشاط siderophore.
ويمكن تطبيق مجموعة واسعة من الأساليب القائمة على ثقافة الكروماتوغرافية أو الحمض النووي إما على الميكروبات الفعلية جيدا أو الجلسرين الحفاظ على الثقافة لمزيد من الاختبارات الكيميائية الحيوية أو التوصيف الجيني والنمذجة الأيضية. باستخدام هذا البروتوكول نشاط siderophore يمكن ربطها لاحقا مع كائنات محددة مسؤولة عن ذلك النشاط أو المستهدفة لاحقا كآلية للآثار الإيكولوجية أكبر. ويمكن تعديل هذا البروتوكول بسهولة لتقييم إنتاج الإثراء الجانبي في الثقافات الإثراءية التي يتم الحصول عليها من العينات التي تم جمعها من مقصورات بيئية أخرى بما في ذلك الهواء والماء والرواسب.
