يوفر هذا البروتوكول تعليمات لبناء واستخدام نظام فقاعة العمود الضوئي الضوئي لتنمية الطحالب الدقيقة، وينبغي أن تكون ذات فائدة لأي شخص يدرس الوقود الحيوي algel، معالجة مياه الصرف الصحي، أو علم الأحياء algel. لقد وجدنا نظام المفاعل spire لتحقيق نتائج ذات سمعة عالية. كما أن نظام المفاعل قابل للتخصيص وفقاً لمجموعة واسعة من الطحالب ويكلف أقل بكثير من العديد من العروض التجارية.
إثبات الإجراء سيكون تشيتشن وانغ، وهو طالب دراسات عليا من مختبري. لبدء إعداد الفقاعات العمود Photobioreactors، وبناء مجموعة من الأغطية تنفيس من الأغطية البلاستيكية من الزجاجات لتر واحد وأنابيب التهجين كما هو موضح في بروتوكول النص. زلة 1/4 بوصة O حلقة على الدوس من لوحة 1/8th بوصة جبل إغراء المناسب, وانزلاق هذا في حفرة 1/4 بوصة حفرت في الغطاء.
زلة ثانية 1/4 بوصة على المواضيع بحيث تقع الغطاء بين حلقات O اثنين. ثم زلة الجوز قفل على المواضيع وتشديد عليه لإصلاح لوحة جبل إغراء في مكان. الآن المفاجئة لقفل الحلقات على إغراء الذكور المكشوفة، وإسقاط من الغطاء.
كرر هذا الإجراء لكل ثقب في الغطاء. للأغطية التي سيتم استخدامها على فقاعة العمود وزجاجة المفاعلات، نعلق 1/8 بوصة أنثى إغراء إلى تركيبات بارب إلى 1 1/2 قطعة بوصة من 1/8 بوصة معرف أنابيب PVC. إرفاق هذه إلى كل من تجهيزات إغراء الذكور المكشوفة على الغطاء.
قم بتوصيل صمام فحص إلى النهاية المجانية لواحدة من قطع البوصة 1/8th. ثم ربط إغراء الذكور لتركيب بارب إلى القطعة الثانية من أنابيب بوصة 1/8th إسقاط من الغطاء. انقر فوق حلقة القفل الدوارة في مكانها وربط فلتر هواء 0.2 ميكرون بهذا.
Compleat تجميع من الهواء تسليم النظام ، وأحواض الأسماك ، لوحات اثارة ، وأضواء كما descried عليه بروتوكول النص. تركيز الأسهم الطحالب الصغيرة المستقرة عن طريق إزالة supernatent باستخدام مضخة فراغ. ترك أقل من 100 ملليلتر من المتوسط في كل زجاجة، ولكن تجنب إزالة الطحالب المستقرة.
تعليق ونقل الطين الطحالب إلى أنابيب أجهزة الطرد المركزي 50 ملليلتر معقمة. جهاز طرد مركزي 1، 000 مرة G لمدة خمس دقائق لزيادة تركيز الطحالب. في مجلس الوزراء السلامة الأحيائية، وإزالة ما يكفي من الفائقة لتحقيق حجم إجمالي حوالي 80 ملليلتر من مركزات الطحالب ل12 الضوئية.
تجنب كنس خارج بيليه. نقل الطحالب التركيز إلى وعاء معقمة. الآن، إضافة ستة ملليلتر من الطين الطحالب في كل photobioreactor مع ماص serological 10 ملليلتر معقمة.
دوامة المفاعلات الحيوية لخلط الطحالب في الوسط. رسم عينة مليلتر اثنين من كل مُنْقِر حيوي باستخدام ماصات مصلي ونقلها إلى أنبوب مليلتر. جمع عينة ملليلتر كل 24 ساعة لمراقبة التقدم في الثقافة.
تحقق من عينة PH باستخدام شرائط الاختبار وضبط المفاعل حسب الحاجة. تشديد أغطية مفاعل حيوي ووضع جميع المفاعلات الحيوية في حوض السمك حوض استحمام المياه خزان. ضبط التهيّم، ثاني أكسيد الكربون، والإضاءة إلى المستويات المناسبة للأنواع.
تدوير موضع مفاعل حيوي كل يوم بعد أخذ العينات. تطبيق 200 ميكرولتردات من كل عينة الثقافة في ثلاث ية على آبار من 96 جيدا microplate. ثم قياس الكثافة البصرية في 550 نانومتر و 680 نانومتر.
قياس حجم ثابت من الطحالب الثقافة من كل مفاعل بيولوجي مع اسطوانة الدراسات العليا ونقل في زجاجات الطرد المركزي. الطرد المركزي ثقافة 4، 696 مرات G لمدة خمس دقائق. تجاهل supernatent عن طريق كنس بعناية بها.
نقل الكريات إلى أنابيب 50 ملليلتر المسمى. شطف قوارير الطرد المركزي بالماء المقطر ونقل المحتويات إلى أنابيب 50 ملليلتر. ضمان حجم إجمالي لا يتجاوز 45 ملليلتر.
بعد غسل الكريات الطحالب كما هو موضح في بروتوكول النص، والتخلص من supernatent. ثم، إضافة 7.5 ملليلتر من الماء المقطر إلى كل أنبوب 50 ملليلتر. الآن، دوامة أنابيب 50 ملليلتر ونقل الطين الطحالب إلى أنابيب وزنها قبل 15 ملليلتر.
شطف أنابيب 50 ملليلتر مع الماء المقطر إضافية، ونقل السائل إلى أنابيب 15 ملليلتر الحفاظ على الحجم الكلي في تلك الأنابيب إلى أقل من 12 ملليلتر. بعد الطرد المركزي أنابيب 15 ملليلتر والتخلص من supernatent كما كان من قبل، وتجميد الأنابيب مع الكريات في ناقص 80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل استعدادا لتجفيف التجميد. إضافة 1.5 ملليلتر من المذيبات فولش لكل اثنين من المليلتر أنبوب يحتوي على 20 ملليغرام من تجميد الطحالب المجففة.
صب ما يقرب من 0.5 ملليلتر من حبات السيليكا الزركونيا في كل أنبوب حتى يصل مستوى السائل إلى مليلترين. التجانس عينات الطحالب في طاحونة حبة لمدة 20 ثانية بسرعة 6.5 متر في الثانية الواحدة. نقل الأنابيب إلى الجليد لمدة 30 ثانية لتبريد العينات.
ثم، كرر خمس مرات أخرى لاستخراج الدهون بشكل كامل. تصفية التجانس من خلال حقنة خمسة ملليلتر تحتوي على قرص شبكة أسلاك الفولاذ المقاوم للصدأ لإجهاد الخرز، وجمع الترشيح في أنبوب 15 ملليلتر. غسل الخرز مع 1.5 ملليلتر من المذيبات فولش، ودفع السائل من خلال مع syring حسب الضرورة.
كرر هذا غسل 2 مرات أكثر وجمع كل الترشيحات في أنبوب 15 ملليلتر, تسفر عن حجم النهائي من حوالي ستة ملليلتر. إضافة 1.2 ملليلتر من 0.9٪ محلول كلوريد الصوديوم إلى استخراج فولش في أنبوب 15 ملليلتر، ودوامة لخلط جيدا. أجهزة الطرد المركزي أنابيب 15 ملليلتر في 6،000 مرة G لمدة خمس دقائق.
سجل حجم المرحلة الكلوروفورم السفلي إلى أقرب 0.1 ملليلتر باستخدام خطوط على جانب أنبوب 15 ملليلتر. ثم نقل المرحلة السفلية إلى الزجاج الخسيس باستخدام ماصة المراعي الزجاجية. لأداء فحص الدهون محايدة، وتمييع مستخلصات الدهون والزيوت النباتية القياسية ثلاثة أضعاف مع الميثانول.
لكل مخفف، عينة إضافة 80 ميكرولترات إلى 96 جيدا البولي بروبلين microplate في رباعية. بالنسبة للمذيبات الفارغة ، قم بتطبيق 80 ميكرولترات من المذيبات الفلاش في رباعية. للمعايير، إضافة 10، 30، 60، 90، و 120 ميكرولترات من معيار الزيوت النباتية المخفف أيضا في رباعية.
ضع اللوح الصغير في غطاء الدخان على سخان كتلة جافة محمّى عند 55 درجة مئوية لمدة 20 إلى 30 دقيقة حتى تتبخر جميع المذيبات. إزالة microplate من كتلة التدفئة والسماح لها تبرد إلى درجة حرارة الغرفة. ثم، إضافة 30 ميكرولترات من الكحول ايزوبروبيل إلى كل بئر ومزيج عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا.
ضمان جميع قنوات ماصة خلط الحل وإعادة تعليق الدهون، و تسفر عن السائل الأخضر متجانسة. الآن، إضافة 200 ميكرولتر من ميكروغرام واحد لكل ملليلتر حل أحمر النيل لكل بئر، وأنابيب لأعلى وإلى أسفل 10 مرات لخلط. بعد حضانة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، إضافة 20 ميكرولترات من 50٪ حل التبييض لكل بئر، وأنابيب عنه صعودا وهبوطا خمس مرات لخلط جيدا.
اتركي البلات لاحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد 30 دقيقة، وقراءة الفلوريس في العينات كل خمس إلى 10 دقائق في 530 نانومتر الإثارة، 575 نانومتر الانبعاثات، مع قطع السيارات تعيين إلى 570 نانومتر حتى تستقر إشارة من عينات الطحالب. ينتج هذا الإجراء مسارًا زمنيًا لبيانات الكثافة البصرية algel في وحدة قياس الأوزون 550.
نمت ثقافات التحكم على AH4 المتوسطة الطازجة. علاج واحد, هو الثقافات المشتركة auxenochlorella protothecoides و azospirillum brasiliense نمت على فطرية جديدة NH4 المتوسطة. العلاج الثاني، هو azinic A.Protothecoides نمت على NH4 المتوسطة الفطرية تكمل مع 50 ملليغرام لكل ملليلتر IAA، والتي منعت تماما نمو الطحالب.
العلاج الثالث، هو A.Protothecoides الأزينيك، نمت على المتوسطة المستهلكة من A.Brasilienes. تظهر منحنيات النمو ثقافات بروتوثيكويدات أوكسينوكلوريلا تدخل النمو اللوغاريتمي المتأخر في 120 ساعة. تظهر هنا منحنيات ال corelation بين الكثافة البصرية في 550 نانومتر وتركيز الوزن الجاف النهائي، وذلك باستخدام نوبة متعددة الحدود من أجل ثاني.
وأخيرا، يمكن تطبيق تلوين على الوقت دورة بيانات الكثافة البصرية للحصول على منحنى نمو الوزن الجاف. وتستخدم نفس العلاجات هنا، إلا أن يتم استزراع شلوريلا sorokiniana بدلا من بروتوثيوسيدات أوكسينوكلوريلا. نسبة الدهون المحايدة الوزن الجافة التي تم الحصول عليها في فحص الدهون محايدة يرتبط جيدا مع محتوى الجلسرين triose على طبقة رقيقة المقابلة لوحة اللونية.
على عكس A.Protothecoides، والعلاج IAA لم تمنع نمو C.Sorkiniana. بعد استخراج الدهون من الطحالب، يمكن تحليل البليت الخلية المتبقية لمحتوى جدار النشا والخلية، وتوفير صورة أكثر تفصيلا لمنتجات تخزين الطاقة داخل الخلية. وقد مكنت الطرق المذكورة هنا اكتشافات جديدة في مجال الوقود الحيوي algel ومعالجة مياه الصرف الصحي.
على وجه التحديد، وقد استخدم هذا النظام لفهم أفضل كيف تؤثر البكتيريا نمو algel.
