يتناول هذا البروتوكول تحليل العينات المحدودة التي تم الحصول عليها من الميكروبيوراكتورس لاستخراج المعلومات الحيوية حول سمات الجودة الحرجة للمنتجات. ميزة أخرى لهذه التقنيات هي أنها تستخدم الحد الأدنى من أوقات التحليل لتحديد السمات الرئيسية التي تملي معايير الجودة للمنتج المصنع. الإجراء البرهاني سيكون ديفيد باورز، تاليا فايسون وفيليب أنغارت، زملاء أبحاث من مختبري.
تبدأ من خلال فتح البرامج المرفقة إلى نظام تنقية ووضع 15 ملليلتر أنابيب مخروطية لجمع eluate الأجسام المضادة النقية و 50 ملليلتر أنابيب المخروطية لجمع تدفق من خلال خلال غسل الملح عالية في جامع الكسر. بعد ذلك، أضف 0.22 ميكرومتر المسام المصفاة السائل ثقافة الخلية المقطوعة إلى حقنة فارغة 12 ملليلتر مع فوهة توج. بعد إزالة الغطاء، أدخل فوهة الحقنة في منفذ الحقن اليدوي لنظام التنقية.
تحريف حقنة لتشد من ذلك في مكان والاكتئاب المكبس حتى تم حقن كامل حجم العينة ومرئية في حلقة عينة حجم كبير 10 milliliter المرفقة. حدد الطريقة المحفوظة وانقر فوق تشغيل عند المطالبة من قبل برنامج الجهاز. عندما تم التملص من جميع الأجسام المضادة ، تحييد على الفور البروتين النقي مع قاعدة واحدة من العث إلى 5.5 من 5.5.
لتركيز الأجسام المضادة النقية عن طريق الطرد المركزي، ضع مرشحات 100 كيلودالتون في أنابيب جمع الترشيحات. غسل المرشحات مع 500 ميكرولترات من الماء المقطر مزدوجة، ثم الطرد المركزي. كرر غسل المرشح مرتين.
بعد الغسيل الثاني، تخلص من الترشيحات ونقل المرشحات المشطفة إلى أنابيب طرد مركزي جديدة. بعد ذلك، إضافة 500 ميكرولترات من عينة لكل مرشح للطرد المركزي. في نهاية الدوران، عكس الفلتر في أنبوب جمع جديد للحصول على العينة المركزة مع الطرد المركزي النهائي.
بالنسبة لوضع العلامات على N-glycan وعزلها، قم بتخفيف 7.5 ميكرولترات من كل عينة جسم مضاد مركزة. مع 15.3 ميكرولترات من قياس الطيف الكتلي الكروماتوغرافيا السائل أو المياه LCMS الصف في أنابيب ملليلتر واحد من عدة، وdenature الأجسام المضادة مع ستة ميكرولترات من محلول 5٪ من الانزيم الصديقة لقياس الطيف السطحي ودية في 90 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. في نهاية التكاث، تسمح للعينات أن تبرد إلى درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث دقائق قبل إضافة 1.2 ميكرولترات من الببتيد N-جليكوسيدز F لاحتضان لمدة خمس دقائق في 50 درجة مئوية.
بعد تبريد العينات لمدة ثلاث دقائق لدرجة حرارة الغرفة ، وضع علامة على العينات مع 12 ميكرولترات من مبيد الفلورسنت الموسومة المذابة في ثنائي الشكل اللامائية لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، وتمييع الخليط N-الجليكان المسمى مع 358 ميكرولترات من الأسيتونيتريل ووضع لوحة كروماتوغرافيا التفاعل المائي في فراغ متعدد مع الحشوات وصينية النفايات. حالة الآبار مع 200 ميكرولترات من الماء مع فراغ تعديلها إلى 10 إلى 15 كيلوباسكال للتأكد من أن السائل سوف يستغرق 15 إلى 30 ثانية لتمرير من خلال الراتنج التفاعل الماءي اللوني.
اكويبيل الآبار مع 200 ميكرولترات من 85٪ الأسيتونيتريل لمدة 15 إلى 30 ثانية قبل تحميل 400 ميكرولترات من كل خليط الجليكان المسمى إلى كل بئر، وتطبيق الفراغ بعد إضافة كل السائل الجديد. عندما تم إضافة جميع العينات، وغسل الراتنج مرتين مع 600 ميكرولترات من 1٪ حمض فليك و 90٪ الأسيتونتريل في غسل واستبدال علبة النفايات مع 600 ميكرولتر أنابيب جمع. ثم استعصى على N-glycans المسمى مع ثلاثة مجلدات 30 ميكرولتر من عازلة elution الطيفي وتمييع تمييع تجمع مع 310 ميكرولترات من ثنائي الفينيل شكلميد في acetonitrile عينات eluent.
لتحليل عينات elution N-glycan المسمى على نظام كروماتوغرافيا السائل فائق الأداء إلى جانب كاشف الفلوروست ووقت رباعية من مطياف كتلة الطيران، استخدم 50 ميليمولار الأمونيوم formate و 100٪ LCMS الصف الأسيتونيتريلي للمراحل المتنقلة. تعيين معدل التدفق الأولي إلى 0.4 ملليلتر في الدقيقة الواحدة، مع تدرج LC توفير زيادة الأمونيوم formate خلال مرحلة elution. تعيين جهاز الكشف عن الفلوريس لقياس استثارة من 265 نانومتر وانبعاثات من 425 نانومتر مع معدل أخذ العينات من اثنين من هرتز.
تعيين وقت الطيران رباعية إلى وضع حساسية الأيونات MS1 إيجابية مع نطاق كتلة من 100 إلى 2،000 دالتون، وقت المسح الضوئي من 0.25 ثانية، واقتناء البيانات المستمرة. ثم قم بتحميل العينات في مجموعة العينات التلقائية إلى 10 درجة مئوية وقم بتشغيل الأسلوب المحمل. لsalt عينة استعدادا لتحليل البديل تهمة، المفاجئة قبالة سدادة أسفل عمود desalting 0.5 ملليلتر، وتخفيف سدادة أعلى، ووضع العمود desalting في أنبوب الطرد المركزي 1.7 ملليلتر.
نقل العمود الجديد إلى أنبوب جديد microcentrifuge وإضافة 80 ميكرولترات من 3.5 ملليغرام في حل الأجسام المضادة ملليلتر إلى أعلى العمود. محاذاة العمود إلى الاتجاه الأصلي والطرد المركزي العمود. ثم تجاهل العمود desalting وخلط دقيق العينة المركزة.
تمييع العينة إلى تركيز مليغرام لكل ملليلتر في 25 ميكرولترتر من الماء فائق البور في بئر واحدة من لوحة 96-well وإضافة خمسة ميكرولترات من العازلة وضع العلامات وخمسة ميكرولترات من كاشف العلامات إلى البئر. بعد حضانة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء، اخلط 60 ميكرولترات من الماء الكاشف مع العينة واغطي الطبق بختم لوحة للطرد المركزي. لإعداد رقاقة متغير الشحن، وإزالة حل التخزين وغسل الآبار واحد وثلاثة وأربعة وسبعة وثمانية و10 بالماء.
استبدال المياه مع درجة 7.2 درجة إستكمالات 7.2 تشغيل العازلة وإضافة 750 ميكرولترات من تشغيل العازلة إلى أنبوب العازلة. اضغط على لوحة التفريغ على واجهة المستخدم الصك وإزالة الختم من لوحة 96-well. أدخل اللوحة وأنبوب المخزن المؤقت في البقع المشار إليها على درج عينة GX2 واضغط على لوحة التحميل.
ضع الرقاقة في غرفة الرقاقة، أغلق الغطاء إلى غرفة الشريحة، حدد مقايسة HT لشحن البروتين عند المطالبة، وانقر فوق تشغيل. تنقية عينة زراعة الخلايا المقطوعة من مفاعل حيوي مصغر آلي بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة البروتينية السريعة يسمح بتوصيف سمات الجودة الحرجة للبروتينات المنقية من خلال مختلف الأساليب التحليلية المصب، كما هو موضح. N-الجليكان البيانات من الصينية الهامستر المبيض المنتجة الأجسام المضادة أحادية النسيلة التي يتم معالجتها بواسطة الطيف الشامل ينبغي أن تظهر مماثلة لهذه الكروماتوجرامات تمثيلية.
يمكن استخدام تشتت الضوء متعدد الزاوية في استبعاد الحجم لتقييم ملف التجميع والوزن الجزيئي للجسم المضاد. وكمية العينة الصغيرة وأهمية التجميع من سمات النوعية الحاسمة التي تجعل من هذه التقنية أداة تحليلية تكميلية قيّمة للغاية لنظام الميكروبيوراكتور الآلي. نتيجة لكهربية منطقة الشعيرات الدموية الصغيرة هو تخطيط كهربائي ويمكن استخدامها لإظهار ملف تعريف متغير تهمة للأجسام المضادة أحادية النسيلة، وهو توقيع فريد للبروتين يجري التحقيق التي هي حساسة للغاية لدرجة الHH التشغيل.
ويمكن أيضا أن يتم رصد استهلاك الأحماض الأمينية لتحديد ما إذا كان استنفاد يسبب تغييرات في سمات نوعية حرجة من الأجسام المضادة. من المهم ضمان تنقية سليمة وفعالة للمنتج المصنع ، حيث لا يمكن تنفيذ الخطوات التحليلية إلا ببروتين منقّى بشكل صحيح. ويمكن أيضا أن يخضع المنتج لرسم خرائط الببتيد واختبار الاستقرار.
ولكن بمجرد استخدام البروتين لطريقة توصيف واحدة ، فإنه لا يمكن عادة أن تستخدم لآخر. تسمح هذه التقنيات بتحليل المنتجات المنتجة من منصات فحص المعالجة البيولوجية ذات الإنتاجية العالية والأحجام الصغيرة لفهم تأثير بارامترات المعالجة البيولوجية على جودة المنتج. بعض هذه التقنيات استخدام حمض البيركلوريك المركزة، حمض فورميك، ن-dimethylformamide، وكلها خطرة وينبغي التعامل معها بعناية أثناء ارتداء معدات الحماية المناسبة.
