حتى هذه الطريقة يمكن أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول قدرة يغاندسات إستروجين لتنظيم مستقبلات هرمون الاستروجين ألفا وآليات التضمينات مستقبلات هرمون الاستروجين الانتقائية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أنه هو طريقة بسيطة. أنه يدل على ligand تعتمد على هرمون الاستروجين مستقبلات ألفا ligand ربط المجال نشاط ال ديمرين في الخلايا.
إثبات الإجراء سيكون تانر جيفرسون، طالب ما بعد الدكتوراه من مجموعتنا. يستخدم هذا الأسلوب ثلاثة بلازميدات مختلفة للكشف عن مستقبلات الإستروجين liga binding المجال نشاط ال ديمرينيم في الخلايا. pG5-لوك هو plasmid مراسل لوسيفيراز للكشف عن فعالية النشاط الخافت.
pBIND الماوس هرمون الاستروجين مستقبلات ألفا EF هو عامل النسخ GAL4 GAL4 المستجيبة للgalctose DNA ملزمة للماوس الرئيسي تنصهر ألفا ليغاند مجال تجليد التعبير plasmid الذي يربط مع عنصر الاستجابة GAL4 على مراسل pG5-لوك. pACT الماوس هرمون الاستروجين مستقبلات ألفا EF هو فيروس الهربس البسيط transx جزء بروتين VP16 تنشيط المجال تنصهر هرمون الاستروجين الماوس مستقبلات ألفا ليغاند تجليد المجال التعبير plasmid التي لا تربط مباشرة إلى pG5-لوك مراسل. عندما يكون يغاند المناسبة موجودة, البروتينات المستمدة من مستقبلات هرمون الاستروجين الماوس pBIND ألفا EF وpACT مستقبلات هرمون الاستروجين الفا EF plasmids ربط من خلال مستقبلات هرمون الاستروجين ألفا ligand مجال ملزم.
يتم تحديد كفاءة التممير من قبل نشاط لوسيفالاس. الخطوة الأكثر أهمية هي السيطرة على نشاط هرمون الاستروجين الماوس pBIND مستقبلات ألفا EF المشتقة البروتين. يجب تقييم نشاط هرمون الاستروجين المستمدة من مستقبلات ألفا ligand ربط المجال في كل ليغاند دون مستقبلات هرمون الاستروجين pACT ألفا EF plasmid قبل تحليل مستقبلات هرمون الاستروجين تعتمد على ligand يميّد المجال.
تبدأ بإضافة تركيبات البلازميد المناسبة في اثنين من أنابيب microcentuge 1.5 ملليلتر لكل تركيبة. إعداد تركيبتين من خليط الحمض النووي. أول أنبوب يحتوي على pG5 لوك، pBIND-هرمون الاستروجين مستقبلات ألفا EF، وbsasmids pACT فارغة.
أنبوب الثاني يحتوي على pG5-لوك، pBIND-هرمون الاستروجين مستقبلات ألفا EF، وpACT-هرمون الاستروجين مستقبلات ألفا EF plasmids. للتعجيل بالحمض النووي، أضف 1/9 من حجم خليط الحمض النووي من ثلاثة خلات الصوديوم الضرس و20X ثلاثة أسيتات الصوديوم المولر حجم 100٪ الإيثانول إلى خليط الحمض النووي في كل أنبوب ودوامة الأنابيب. تخزين الخلائط في 20 درجة مئوية بين عشية وضحاها قبل الطرد المركزي في أقصى سرعة في صباح اليوم التالي.
تجاهل supernatants وإعادة تعليق الكريات غير مرئية في 120 ميكرولتر من 75٪ الإيثانول لكل أنبوب، مع الحرص على شطف أي الحمض النووي عالقة في الدواخل من الأنابيب. بعد الطرد المركزي الثاني في ظل نفس الظروف، والتخلص من عظمى وتجفيف الحمض النووي في فراغ المكثف لمدة 30 دقيقة. لtransfection، وغسل خلايا سرطان الكبد البشري المعدة مرتين مع 0.5 ملليلتر من درجة حرارة الغرفة PBS لكل غسل وتغذية الخلايا مع 0.5 ملليلتر من 37 درجة مئوية جديدة الفينول الأحمر خالية MEM تكملها 10٪ الفحم جردت الحرارة تنشيط مصل البقر الجنين واثنين من millimolar L-الجلوتامين.
بعد ذلك، تعليق خليط الحمض النووي المجفف البلازميد ومبيد الانبعاثات في الحجم المناسب من DMEM لكل عدد من الآبار في أنابيب الطرد المجهري 1.5 ملليلتر الفردية. إضافة حجم متساو من مُكْشف نقل الملوثات إلى كل أنبوب خليط الحمض النووي البلازمي المُعلَّق من DMEM. بعد حضانة لمدة 5 إلى 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، أضف 25 ميكرولترات من خليط الحمض النووي إلى الآبار التجريبية المناسبة لطبقة ثقافة خلايا سرطان الكبد الكبدية البشرية التي تبلغ 24 بئرًا لمدة ست ساعات في حاضنة ثقافة الخلايا.
ونهاية الحضانة، واستبدال المتوسطة transfection مع 0.5 ملليلتر من 37 درجة مئوية جديدة الفينول الأحمر خالية MEM تكملها مع 10٪ الفحم تجريدها من الحرارة المعطلة FBS، اثنين من ملليمولار L-الجلوتامين، 1٪ بنسلين الستربتوميسين، وليغاند لكل بئر وإعادة الخلايا إلى حاضنة ثقافة الخلايا لآخر 16 إلى 18 ساعة. في صباح اليوم التالي، وغسل الخلايا مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني في البئر وإرفاق الخلايا من كل بئر مع 100 ميكرولترات من العازلة الانحلال السلبي في بئر وهز قوية مع خلاط دوامة. ثم تجميد الخلايا في النيتروجين السائل.
في يوم مقايسة لوسيفيراز المزدوجة ، اهز الليسات على شاكر حتى تصل اللوحة إلى درجة حرارة الغرفة ، ونقل 10 ميكرولترات من الليسيت إلى آبار فردية من لوحة بلاستيكية بيضاء من 96 بئرًا. ثم قراءة نشاط لوسيفراز من كل عينة الخلية lysate على قارئ microplate. علاج pBIND الماوس مستقبلات هرمون الاستروجين ألفا EF وبلازميدات pACT الخلايا العابرة مع 10 استراديول نانومولار يحفز نشاط luciferase كما مستقبلات هرمون الاستروجين ألفا ليغاند ملزم المجال يحتوي على التفكك في مجال التانسلوب تعتمد على ليجوند، AF-2.
واحد و 10-نانوموللار التركيزات ومع ذلك, حث على نشاط لوسيفيراز في الخلايا transerd مع مزيج من pBIND وpACT الماوس مستقبلات هرمون الاستروجين ألفا EF plasmids, مما يشير إلى جدوى هذا الإجراء لتقييم مستقبلات هرمون الاستروجين ألفا ligand مجال الربط نشاط التمرم في ما يصل إلى نانومولار واحد من العلاج استراديول. العلاج مع 4-hydroxy-تاموكسيفين لا تثير نشاط لوسيفيراز في مستقبلات هرمون الاستروجين الماوس pBIND ألفا EF وبلازميد بلازميد الخلايا المصابة, مما يشير إلى أن لا يتم تنشيط وظيفة AF-2 من مستقبلات هرمون الاستروجين ألفا من قبل هذا ليغاند. ما يصل إلى 10 تركيزات نانومولار ومع ذلك, يدفع نشاط لوسيفيرايز في الخلايا transerd مع مزيج من pBIND وpACT مستقبلات هرمون الاستروجين الماوس ألفا EF plasmids, مما يشير إلى أن هذا الإجراء هو ممكن لتقييم مستقبلات هرمون الاستروجين ألفا ligand ربط المجال نشاط ال ديمر في ما يصل إلى 10 نانومولر من 4-hydroxy-تامينفينوكسي العلاج.
النشاط من مزيج من pBIND وpACT الماوس هرمون الاستروجين مستقبلات ألفا ligand تجليد المجال التعبير plasmids مع 4-hydroxy-تاموكسيفين هو أعلى بكثير من مزيج من pBIND وpACT مستقبلات هرمون الاستروجين الإنسان ألفا ligand تجليد المجال التعبير plasmids. وهذا يشير إلى أن 4-hydroxy-تاموكسيفين تعتمد على نشاط التجانس من مستقبلات هرمون الاستروجين الماوس المجال ملزم ألفا ليغاند هو أكثر فعالية من مستقبلات الإستروجين الإنسان ألفا ليغاند ملزم المجال. وعلاوة على ذلك، فإن 4-hydroxy-تاموكسيفين تعتمد على نشاط التجانس من مستقبلات هرمون الاستروجين الماوس ألفا ليغاند مجال ملزم يحتوي على المجال F الإنسان هو أقل بكثير من ذلك من نوع هرمون الاستروجين الماوس البرية مستقبلات ألفا ليغاند ملزم المجال.
في المقابل، 4-hydroxy-تاموكسيفين تعتمد على نشاط التجانس من مستقبلات الإستروجين الإنسان المجال ملزم ألفا ligand التي تحتوي على نطاق F الماوس أعلى بكثير من ذلك من نوع هرمون الاستروجين البشري مستقبلات ألفا ليغاند مجال ملزم. وهذا يشير إلى أن المجال F له تأثير على الأنواع المحددة 4-hydroxy-تاموكسيفين تعتمد على مستقبلات هرمون الاستروجين ألفا ليغاند الربط مجال النشاط. أثناء محاولة هذا الإجراء, من المهم أن نتذكر لاختبار النشاط القاعدي من GAL4 الحمض النووي ملزمة المجال تنصهر مستقبلات هرمون الاستروجين ألفا ligand نشاط المجال مع ligand الخاص بك.
وينبغي أن يكون هذا النشاط هو نفس معاملة المركبات.
