يمكن أن تساعد هذه الطريقة في تصنيف الأنواع الفرعية العصبية وتوسيع فهمنا للخريطة الوظيفية للدوائر القشرية. وقد تم تحسين هذا البروتوكول للحفاظ على البنية الفائقة من الخلايا العصبية والحصول على انتعاش ممتاز من كل من arbors التشعب والمحوسة، مما يسمح إعادة بناء عالية الجودة. في نهاية تسجيل كهربائي فيزيولوجيا، نقل شريحة تحتوي على الخلية المسجلة إلى طبق صغير من ACSF.
أثناء العمل في غطاء الدخان، لفة شريحة على قطعة صغيرة من ورق تصفية نوعية غرامة ووضع قطعة أخرى من ورقة مرشح مبلل على شريحة. ضع الأنسجة في وعاء بلاستيكي صغير يحتوي على 5 إلى 10 ملليلتر من محلول التثبيت وتخزينه عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، نقل الأنسجة من الحاوية مع حل المثبت إلى حاوية مع اثنين من ملليلتر من 0.1 عازلة فوسفات المول من أجل شطف، وقطع بعيدا أي الأنسجة الزائدة مع شفرة مشرط.
إزالة الأنسجة الزائدة عن طريق وضع شريحة في طبق بيتري، وقطع بعيدا الأنسجة الزائدة مع شفرة مشرط. نقل الأنسجة المشذبة إلى طبق بيتري نظيفة، وضمان أن تقع شقة مع عدم وجود طيات أو تجاعيد. قم بإزالة المخزن المؤقت الزائد باستخدام فرشاة طلاء جافة.
تغطية الأنسجة مع محلول الجيلاتين الدافئة ووضع طبق بيتري على كتلة المجمدة لتبريد المحلول بسرعة. ثم، نقل طبق من وضع الجيلاتين إلى 4 درجات مئوية لمدة 30 إلى 60 دقيقة. في غطاء الدخان، استخدم شفرة مشرط لقطع كتلة صغيرة، 1 × 1 سنتيمتر تحتوي على الأنسجة المضمروسة الجيلاتين.
ارفع الكتلة باستخدام ملعقة صغيرة ونقلها بعناية إلى حل تثبيتي جديد. السماح لإصلاح لمدة 30 دقيقة على الأقل في أربع درجات مئوية. بعد هذا التثبيت الثاني، وغسل كتلة الجيلاتين في خمسة ملليلتر من PB ثلاث مرات.
بعد الغسيل، جفف الكتلة باستخدام قطعة من نسيج الورق. ثم استخدام كمية صغيرة من الغراء سيانوكريلات لعصا كتلة، موجهة مع الأنسجة في الجزء العلوي، على شاحنة هزاز باستخدام الغراء السوبر. قسم شريحة في 50 ميكرون سمك باستخدام هزاز ووضع كل قسم بعناية في قارورة زجاجية تحتوي على 10 في المئة السكروز.
بعد القسم، التقط بعناية مقطعًا من القارورة ووضعها مسطحة في غطاء طبق بيتري. ثم استخدم شفرة مشرط جديدة لإزالة الجيلاتين من جميع أنحاء القسم. وضع المقاطع في قارورة تحتوي على 2 ملليلتر من السكروز الطازج 10 في المئة في PB، وتهيج لمدة 10 دقائق لبدء عملية cryoprotection.
بعد cryoprotection، ضع المقاطع مسطحة على مستطيل صغير من رقائق الألومنيوم باستخدام فرشاة الطلاء. إزالة أي فائض السائل من المقاطع وأضعاف بعناية احباط في طرد. عقد رقائق الألومنيوم على مقربة من سطح النيتروجين السائل دون لمس السطح لمدة 30 ثانية.
ثم تسمح المقاطع للذوبان تماما لمدة 30 ثانية تقريبا. كرر تجميد ذوبان مرة أخرى مرتين. إزالة جميع المقاطع من احباط مع فرشاة الطلاء ووضعها في قارورة زجاجية تحتوي على مليلترين من PB لغسل السكروز الزائد تحت الانفعالات المستمرة.
بعد المناعة للتصوير المفلور، ضع الشريحة في طبق بيتري زجاجي يحتوي على PBS، وقم بإزالة زلة الغطاء بعناية. ثم غسل المقاطع قبالة الشريحة باستخدام نبضات لطيف من برنامج تلفزيوني من ماصة باستور. ضع المقاطع في قارورة زجاجية نظيفة تحتوي على PBS.
تنفيذ رد فعل افيدين HRP عن طريق احتضان الأقسام أولا في مجمع Avidin البيوتين أو ABC، لمدة ساعتين على الأقل لتضخيم المنتج تفاعل HRP. بعد ذلك، قم بغسل المقاطع باستخدام برنامج تلفزيوني 3 مرات لمدة 10 دقائق، ثم مع المخزن المؤقت لـ tris مرتين لمدة 10 دقائق. بعد إزالة آخر tris العازلة غسل، بسرعة إضافة قطرة واحدة من ثمانية في المئة محلول كلوريد النيكل إلى حل ديامينوبينزيدين أو حل DAB.
ثم الماصات الحل داخل وخارج لخلط و بسرعة إضافة ملليلتر واحد من هذا الحل على الأقسام. احتضان المقاطع في هذا الحل لمدة 15 دقيقة. ثم إضافة 10 ميكروليتر من بيروكسيد الهيدروجين 1 في المئة إلى حل DAB.
السماح لرد الفعل للمضي قدما في الظلام تحت التحريض المستمر لمدة دقيقة إلى دقيقتين حتى يتم تسمية الخلايا. في غطاء الدخان، ضع دائرة صغيرة من ورق التصفية في طبق بيتري وخففه مع PB. ارفع المقاطع مرة واحدة من القارورة الزجاجية باستخدام فرشاة طلاء وضعها بحرص على الورق. غطي المقاطع بدائرة أخرى مبللة من ورق الفلتر وأزل العازلة الزائدة عن طريق لمس ورق الأنسجة على السطح برفق.
تطبيق ثماني أو تسع قطرات من واحد في المئة أوزميوم تتروكسيد في PB إلى الورقة العليا. يُغطّى الطبق ويُحفظ في غطاء الدخان لمدة 30 دقيقة على الأقل، ولكن لا يزيد عن ساعة واحدة. بعد الشطف، وتركيب، ويغطي المقاطع، والجفاف من خلال سلسلة من 50 في المئة، 70 في المئة، 95 في المئة، و 100 في المئة حلول الكحول.
بعد خطوة الجفاف، نقل المقاطع إلى قارورة زجاجية تحتوي على 100 في المئة الإيثانول على شاكر لمدة خمس دقائق تقريبا. استبدل محلول الكحول بأكسيد البروبيلين واغسله ثلاث مرات لمدة خمس دقائق. بعد الغسيل الأخير، احتفظ بحوالي ملليلترين من أكسيد البروبيلين في القارورة وأضف الراتنج بنسبة 1:1.
تأكد من أن يتم حل الراتنج والحفاظ على المقاطع تحت الانفعالات المستمرة لمدة 30 دقيقة. بعد 30 دقيقة، استخدم عصا خشبية لوضع كل قسم في لوح من الألومنيوم يحتوي على راتنج الايبوكسي، واحتضان بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، ضع اللوح على طبق ساخن لمدة 10 دقائق تقريبًا.
ثم التقاط كل قسم مع عصا خشبية ومكان على شريحة نظيفة. بمجرد نقل جميع الأقسام على الشريحة، عرض الشريحة تحت مجهر تشريح للتحقق من اتجاه الشرائح ووضع غطاء على الأقسام. علاج في الفرن لمدة 48 ساعة في 56 درجة مئوية.
استخدام هدف التكبير منخفضة للتركيز على المقطع المنزل يحتوي على جسم الخلية. ثم استخدم هدف 100x ، والتركيز على جسم الخلية ، وانقر في المركز لوضع علامة على نقطة مرجعية. لتتبع سوما في 3D باستخدام الهدف 100x، حدد كفاف من علامة التبويب تتبع وحدد كفاف جسم الخلية.
استخدام عصا التحكم لنقل التركيز إلى أعلى جدا من جسم الخلية. ضع النقاط بالنقر حول محيط الجزء الذي هو حاليا في التركيز. انقر بزر الماوس الأيمن وحدد إغلاق كفاف لإنهاء هذا المخطط التفصيلي الأول.
كرر هذه العملية في مواقع z مختلفة حتى يتم الوصول إلى الجزء السفلي من جسم الخلية. لتتبع arbor dendritic، حدد التشعب أو dendrite apical، في قائمة الخلايا العصبية. أولاً، تتبع قطعة أولية قصيرة لكل dendrite باستخدام عجلة التمرير الماوس لضبط قطر المؤشر لتطابق قطر dendrite.
تتبع على طول كل dendrite. عند الوصول إلى عقدة في الشجرة، انقر بزر الماوس الأيمن فوق وحدد عقدة ثنائية أو عقدة ثلاثية من القائمة المنسدلة. لتحديد نقاط المطابقة بين التشعبات في مقطع يتطابق مع القسم المكتمل، انقر فوق علامة التبويب نقل وحدد نقاط المطابقة.
حدد عدد النقاط المطلوبة لتطابقها، ثم اضغط على موافق. انقر على إنهاء فرع مكتمل ثم انقر على الفرع. كرر هذا لكل نقطة تطابق. مرة واحدة وقد تم تتبع كل من dendrites من كل قسم، تتبع محور عصبي باستخدام نفس العملية هو مبين هنا هو إعادة بناء خلية سلة CA2 مع arbor متشعب ومحك عصبي مقيدة باستخدام أنبوب الرسم.
التشعبات باللون الأسود والمحاسن باللون الأحمر. هذا هو مثال على صورة من خلية سلة مملوءة biocytin بعد بروتوكول افيدين HRP الموصوفة هنا. يظهر هنا هو شريط فيديو لإعادة بناء الخلايا العصبية 3D من CA2 خلية السلة.
Dendrites في الوردي الداكن ومحور عصبي باللون الأبيض. وأخيراً، تُظهر هذه الصورة مخططًا مُتَرَكّرًا لخلية سلة CA2. وسوف يستغرق وقتاً أن تصبح بارعة مع هذا البروتوكول.
ومع ذلك، يمكن لهذا النهج الأمثل توليد صور عالية الدقة من الهياكل القشرية وفرس النهر المعقدة في المختبر.
