يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الاتجار بالبروتين حول النقل النووي والسيكتوبلازمي في النظام الذي لا يتوفر فيه التصوير الضوئي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تطبيقها كمراسم عامة لدراسة حركة البروتينات الزمنية دون أن تنطوي على تصوير الضوء. 20 إلى 24 ساعات قبل عدوى الفيروس البذور 5 مرات 10 إلى 4 بشرية رئة جنينية أو خلايا الانفجار الألياف HEL في بئر على شريحة أربعة 11 ملليمتر بشكل جيد و متوسط النمو للحضانة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع خمسة في المئة ثاني أكسيد الكربون.
من المهم أن تهز الشريحة بدقة لضمان توزيع متكافئ للخلايا مع الحرص على تجنب تسرب الوسط الثقافي. في اليوم التالي، استبدلوا المُتشردين، لذا فإن الثقافات التي تبلغ 70 إلى 80 بالمئة تُخلط مع الثقافات المتوسطة 199، التي تحتوي على 410 وحدات لتشكيل البلاك لكل خلية، ووضع الشريحة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع الاهتزاز، لمدة ساعة واحدة. في نهاية الحضانة، استبدال الماوسين مع متوسط النمو الطازجة وإعادة الخلايا إلى الحاضنة لفترة العدوى التجريبية المناسبة.
بالنسبة للتلوين المناعي للخلايا المصابة بالفيروس، اغسل الخلايا بسرعة ثلاث مرات باستخدام PBS. تليها حضانة لمدة ثماني إلى عشر دقائق في 200 ميكرولترات من أربعة في المئة شبهformaldehyde في برنامج تلفزيوني في البئر. في نهاية التثبيت، وغسل الخلايا ثلاث مرات مع 200 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني لكل غسل، و permeabilize الخلايا مع 100 ميكرولترات من 0.2 في المئة غير الأيونية السطحي لكل بئر لمدة خمس إلى عشر دقائق.
غسل الخلايا permeabilized ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني كما هو موضح، وإضافة 200 ميكرولترات من العازلة سد إلى كل بئر لاحتضان ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، إضافة التركيز المناسب من الأجسام المضادة الأولية ذات الأهمية لكل بئر لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة الحضانة. في نهاية الحضانة، وإزالة أي جسم مضاد الأولية غير منضم مع ثلاثة، عشر دقائق يغسل في عازلة منع جديدة، وإضافة جسم مضاد الثانوية المناسبة لكل بئر لاحتضان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء.
في نهاية الحضانة، وغسل الخلايا ثلاث مرات في عازلة حظر كما هو موضح، تليها غسل واحد في برنامج تلفزيوني وإضافة قطرة واحدة من antifade تصاعد المتوسطة تستكمل مع DAPI إلى كل بئر. ثم ضع زلة غطاء على الشريحة وختم منحدر الغطاء مع طلاء الأظافر الشفاف. إن ممارسة الضغط اللطيف أثناء تركيب زلة الغطاء سيؤدي إلى إزالة أي وسط زيادة في التركيب، مما يساعد على ضمان المساعدة في ضمان الحصول على صور عالية الجودة.
للتصوير confocal من المسمى، والخلايا المصابة، حدد الأجسام المضادة الثانوية المناسبة وأطوال موجية DAPI، وتعيين تنسيق الصورة إلى 1، 024 في 1، 024 بكسل مع خط متوسط من ثمانية. ثم صورة كل جيدا على الشريحة أربعة بئر تحت الهدف 100x. لحساب عدد كبير من الخلايا، والحصول على خمس إلى عشر صور من حقول متتالية في نفس البئر تحت الهدف 40x.
لتحليل التوزيع النووي والسيكتوبلازمي من ICP0، افتح المشروع في برنامج التطبيق confocal وحدد صورة. افتح علامة التبويب الكمية، وحدد ترتيب مناطق الاهتمام من القائمة أدوات. حدد رسم الخط، ورسم خط طولي عبر الخلية ليتم تحليلها.
سيظهر مدرج بياني يظهر شدة الفلور على طول الخط لكل من البروتين الذي يهمك، و DAPI. بناء على تلطيخ الخلفية، تعيين عتبة ثابتة لشدة البروتين من الفائدة لتحليل التوزيع الخلوي الفرعي للبروتين في كل تجربة. إذا كانت إشارة البروتين، في المتوسط، أقل من العتبة في المنطقة النووية، ولكنها تتجاوز العتبة خارج حدود DAPI، فصنف إشارة البروتين على أنها تقع في الغالب داخل السيتوبلازم.
إذا كانت إشارة البروتين فوق العتبة في جميع أنحاء النواة، وخارج حدود إشارة DAPI، فجموع إشارة البروتين كنواة بالإضافة إلى التعريب السيتوبلازمي. إذا كانت إشارة البروتين فوق العتبة في النواة، ولكن في المتوسط هو أقل من عتبة خارج حدود مجموعة إشارة DAPI إشارة البروتين كتوطين نووي. وأخيراً، اِنْحَب أكثر من 200 خلية مصابة من كل عينة في نقاط زمنية مختلفة للإصابة، وارسم البيانات في رسم بياني شريطي لتوضيح حركة البروتين الذي يهمك بمرور الوقت.
كما هو موضح، هذه الطريقة تسهل تحليل نقل النووية إلى السيتوبلازمية من البروتينات ذات الأهمية. على سبيل المثال، خلية مصابة بروتين صفر، أو ICP0 التغييرات التوزيع دون الخلوية مع تقدم العدوى الفيروسية. لفهم العناصر المطلوبة للاتجار ICP0 أثناء العدوى، يمكن تتبع حركات ICP0 في نوع البرية و متحولة نوع فيروس الهربس البسيط 1-الفيروسات في مراحل العدوى المختلفة، مما يسمح بتقييم التوزيع الخلوي الفرعي من ICP0 في نقاط زمنية مختلفة من العدوى.
من المهم أن نتذكر لاستخدام الثقافات monolayer حتى virions الحصول على قدم المساواة إلى الخلايا وتطبيع تعدد العدوى وفقا لعنوان الفيروس بحيث تطور العدوى قابلة للمقارنة بين وداخل الفيروسات. بعد كل تطور، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجالات علم الأحياء وعلم الفيروسات الخلوية لاستكشاف حركة البروتين من خلال دراسة التعريب دون الخلوي الزمني للبروتينات ذات الأهمية داخل مجموعة الخلايا.
