يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الأدوية المتعلقة بسلامة القلب. على سبيل المثال، هل يحمل الطب البشري الجديد خطر تعديل إيقاع القلب الطبيعي؟ والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تقييم أعداد كبيرة من المركبات بسرعة وبتكلفة معتدلة.
إثبات الإجراء سيكون (كاميلي) باحثة في مختبري للتحضير لقياس تقلصات التزامنية من الخلايا القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثة بالإنسان، أو HIPSCCMs، ابدأ بوضع أحواض التبريد التي تحتوي على خلايا مجمدة في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين. نقل كامل تعليق الخلية المذابة من كل أنبوب إلى واحد، أنبوب مخروطي 50 ملليلتر الطازجة.
لاسترداد بقايا الخلايا، وغسل كل أنبوب مع ملليلتر واحد من 37 درجة مئوية من متوسط الطلاء مسبق اسخناؤها وإضافة هذه المتوسطة إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر التي تحتوي على الخلايا المذابة. إضافة ثمانية ملليلتر من التصفيح الدافئ إلى الأنبوب وخلط بعناية التعليق. استخدام طريقة استبعاد trypan الأزرق ومقياس للهيموسيتلت لحساب الخلايا الحية.
عن طريق إضافة المتوسطة الطلاء الدافئة، وضبط التركيز إلى 50،000 خلية لكل ملليلتر. لتوزيع الخلايا إلى اثنين جديد 384 جيدا خلية لوحة ثقافة، إضافة 25 ميكرولترات لكل بئر، والتي سوف تسفر عن حوالي 12،500 خلية في بئر. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية في 384-آبار في الغلاف الجوي المرطب مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لما مجموعه ثلاثة إلى أربعة أسابيع.
في اليوم التالي، استبدل الوسيلة ذات الطلاء بـ 50 ميكرولترات من وسط الصيانة الدافئة. بعد ذلك، استبدال نصف متوسط الصيانة كل يومين إلى ثلاثة أيام. في الأيام السابعة و14 و21، استبدل الوسط بالكامل.
مرة واحدة تم الحفاظ على الخلايا في الثقافة لمدة ثلاثة إلى أربعة أسابيع، أنها شكلت تلقائيا التعاقد syncytia، ويمكن قياس تأثير المركبات على هذه الانقباضات. في يوم الفحص ، قبل ساعتين على الأقل من لوحة الخلية الأولى ليتم وضعها داخل قارئ اللوحة للقياس ، قم بتشغيل القارئ وتعيين نظام التدفئة عند 37 درجة مئوية. لإعداد لوحات المركب، دافئة لدرجة حرارة الغرفة 40 ملليلتر من صيانة المتوسطة تكمل مع 1٪ حجم من قبل حجم ستريبتوميسين البنسلين.
في حين أن المتوسطة هي الاحماء، وتوزيع مركبات الاختبار والضوابط في اثنين من لوحات مركب 384 جيدا عن طريق إضافة 1.5 ميكرولترات من محلول الأسهم في بئر. أجهزة الطرد المركزي لوحات المركب في 100 G لمدة دقيقة واحدة. إضافة 37 ميكرولترات من صيانة متوسطة لكل بئر والطرد المركزي لوحات مرة أخرى في 100 G لمدة دقيقة واحدة.
لإعداد صبغة الفلورسنت، دافئ 100 ملليلتر من صيانة المتوسطة تكملها 1٪ حجم من قبل حجم ستيربتوماليسين في حمام الماء 37 درجة مئوية. ثم، إضافة 10 ملليلتر من المتوسطة الدافئة إلى مزيج من صبغة الفلورسنت الحساسة للكالسيوم و quencher لإعادة تشكيلها كوسيلة فلورية الأسهم. بدء تشغيل برنامج قارئ لوحة.
إعداد البرنامج لتسجيل قطعة لمدة دقيقتين من موجات الكالسيوم مع تردد اقتناء ما لا يقل عن 10 هرتز. لجعل الفلورسينس متوسطة لكل صفيحة خلية، تمييع ثلاثة ملليلترات من الفلورانس الأسهم المتوسطة مع 12 ملليلتر من الصيانة الدافئة المتوسطة مع المضادات الحيوية. استبدال 20 ميكرولترات من المتوسط في كل بئر من لوحة الخلية مع 30 ميكرولترات من الفلورسينس المتوسطة ومزيج عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا مرة واحدة.
مباشرة بعد ذلك، ضع لوحة في قارئ لوحة من أجل السماح HIPSCCMs التكيف مع درجة حرارة القارئ لمدة 60 دقيقة. ثم، بدء تشغيل برنامج قارئ لوحة. تسجيل قطعة دقيقة من موجات الكالسيوم مع تردد اقتناء ما لا يقل عن 10 هرتز لتحديد معدل الضرب خط الأساس لكل بئر.
من المهم التأكد من عدم نقل لوحة الخلية خارج الجهاز بعد الحصول على البيانات. مع بعض إصدارات البرامج، يجب إيقاف التسجيل قبل أن ينتهي تماما. استخدام الروبوت قارئ لوحة إلى ماص خمسة ميكروليترس من المركبات الاختبار والمرجع جيدا إلى جيد من لوحة المركب في لوحة الخلية.
بعد ذلك، ابدأ عملية الحصول على البيانات في برنامج قارئ اللوحة لتسجيل مقطعين من موجات الكالسيوم لمدة دقيقة تبدأ من خمسة و15 و30 و45 و60 دقيقة بعد إضافة المركب. لبدء تحليل البيانات، قم بتصدير البيانات الأولية لكل فترة تسجيل من برنامج قارئ اللوحة في ملفات ASCII النصية. ثم استيرادها إلى برنامج تحليل البيانات.
من برنامج تحليل البيانات، تصدير الترددات الضرب الأولية لكل فترة تسجيل نسخ الحافظة. استخراج وتيرة الضرب الابتدائي لكل بئر وكل نقطة زمنية. وأخيراً، قم باستيراد الترددات الضربية إلى برنامج جدول بيانات عن طريق لصق الحافظة ومتابعة تحليل البيانات كما هو موضح في بروتوكول النص.
تسجيل موجات الكالسيوم في خط الأساس عبر لوحة واحدة 384 جيدا يظهر أنه في معظم الحالات تكشف جميع الآبار عن معدل الضرب المنتظم مع القليل من التباين عبر لوحة. عندما تضاف حاصرات قنوات أيونات القلب، فإنها تؤثر على إيقاع عضلة القلب. Amlodipine، مانع من قنوات الكالسيوم بطيئة، يسرع إيقاع أكثر من 100٪ بطريقة تعتمد على التركيز تصل إلى ميكرومولار واحد.
وفوق ذلك، (أمالويديين) يعتقل الضرب. E-4031، مانع من القنوات البوتاسيوم المصححة المتأخرة السريعة يتباطأ إيقاع حوالي 65 إلى 70٪ بطريقة تعتمد على التركيز تصل إلى 10 ميكرومولار. Tetrodotoxin، مانع من قنوات الصوديوم سريع يتباطأ إيقاع حوالي 15٪ بطريقة تعتمد على التركيز تصل إلى 1 إلى 30 ميكرومولار، في حين أن أكثر من 30 ميكرومولار، tetrodotoxin الاعتقالات الضرب في غضون الدقائق الخمس الأولى.
Bepridil، مانع مختلط من قنوات الصوديوم والكالسيوم والبوتاسيوم القلب أيضا تنتج تأثير كل شيء أو لا شيء، مما يشير إلى أن كتلة قناة الصوديوم هو العمل الأساسي من bepridil. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن تكون لطيف للغاية عند الأنابيب في لوحة ثقافة الخلية. هذه الأنسجة هشة جدا وتلف بسهولة إذا لمست من قبل الماصات.
لا تنس أن العمل مع الخلايا البشرية والأدوية النشطة يمكن أن تكون خطرة، وينبغي اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء قفازات السلامة والنظارات دائما أثناء تنفيذ هذا الإجراء.
