ونشكر تشانتزارا فاسيليكي للاضطلاع بتوقيت ماتينجس وموظفي "وحدة الموارد البيولوجية" في "معهد UCL لطب العيون" لتربية الماوس. وأيد هذه الدراسة "ويلكوم ترست المحقق جائزة" 095623/Z/11/Z إلى الجمهورية التشيكية.

<ol>
	<li>Wilsch-Brauninger, M., Florio, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neocortex+expansion+in+development+and+evolution+-+from+cell+biology+to+single+genes.">Neocortex expansion in development and evolution - from cell biology to single genes.</a> Curr Opin Neurobiol. 39, 122-132 (2016).</li><li>Gregg, C., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNTF/LIF/gp130+receptor+complex+signaling+maintains+a+VZ+precursor+differentiation+gradient+in+the+developing+ventral+forebrain.">CNTF/LIF/gp130 receptor complex signaling maintains a VZ precursor differentiation gradient in the developing ventral forebrain.</a> Development. 132 (3), 565-578 (2005).</li><li>Kwon, G. S., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eomes::GFP-a+tool+for+live+imaging+cells+of+the+trophoblast,+primitive+streak,+and+telencephalon+in+the+mouse+embryo.">Eomes::GFP-a tool for live imaging cells of the trophoblast, primitive streak, and telencephalon in the mouse embryo.</a> Genesis. 45 (4), 208-217 (2007).</li><li>Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hox+Genes+and+the+Hindbrain:+A+Study+in+Segments.">Hox Genes and the Hindbrain: A Study in Segments.</a> Curr Top Dev Biol. 116, 581-596 (2016).</li><li>Guthrie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+and+axon+guidance+of+cranial+motor+neurons.">Patterning and axon guidance of cranial motor neurons.</a> Nat Rev Neurosci. 8 (11), 859-871 (2007).</li><li>Fantin, A., Vieira, J. M., Plein, A., Maden, C. H., Ruhrberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+mouse+hindbrain+as+a+qualitative+and+quantitative+model+for+studying+the+molecular+and+cellular+mechanisms+of+angiogenesis.">The embryonic mouse hindbrain as a qualitative and quantitative model for studying the molecular and cellular mechanisms of angiogenesis.</a> Nat Protoc. 8 (2), 418-429 (2013).</li><li>Terriente, J., Gerety, S. S., Watanabe-Asaka, T., Gonzalez-Quevedo, R., Wilkinson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+from+hindbrain+boundaries+regulates+neuronal+clustering+that+patterns+neurogenesis.">Signalling from hindbrain boundaries regulates neuronal clustering that patterns neurogenesis.</a> Development. 139 (16), 2978-2987 (2012).</li><li>Coolen, M., Thieffry, D., Drivenes, O., Becker, T. S., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-9+controls+the+timing+of+neurogenesis+through+the+direct+inhibition+of+antagonistic+factors.">miR-9 controls the timing of neurogenesis through the direct inhibition of antagonistic factors.</a> Dev Cell. 22 (5), 1052-1064 (2012).</li><li>Dias, J. M., Alekseenko, Z., Applequist, J. M., Ericson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tgfbeta+signaling+regulates+temporal+neurogenesis+and+potency+of+neural+stem+cells+in+the+CNS.">Tgfbeta signaling regulates temporal neurogenesis and potency of neural stem cells in the CNS.</a> Neuron. 84 (5), 927-939 (2014).</li><li>Jacob, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoid+acid+specifies+neuronal+identity+through+graded+expression+of+Ascl1.">Retinoid acid specifies neuronal identity through graded expression of Ascl1.</a> Curr Biol. 23 (5), 412-418 (2013).</li><li>Alexandre, P., Reugels, A. M., Barker, D., Blanc, E., Clarke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+derive+from+the+more+apical+daughter+in+asymmetric+divisions+in+the+zebrafish+neural+tube.">Neurons derive from the more apical daughter in asymmetric divisions in the zebrafish neural tube.</a> Nat Neurosci. 13 (6), 673-679 (2010).</li><li>Peretz, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+role+of+hindbrain+boundaries+as+pools+of+neural+stem/progenitor+cells+regulated+by+Sox2.">A new role of hindbrain boundaries as pools of neural stem/progenitor cells regulated by Sox2.</a> BMC Biol. 14, 57 (2016).</li><li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+the+zebrafish+embryonic+brain+by+confocal+microscopy.">Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy.</a> J Vis Exp. (26), (2009).</li><li>Taverna, E., Haffner, C., Pepperkok, R., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+to+manipulate+the+fate+of+single+neural+stem+cells+in+tissue.">A new approach to manipulate the fate of single neural stem cells in tissue.</a> Nat Neurosci. 15 (2), 329-337 (2011).</li><li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types.">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> J Vis Exp. (94), (2014).</li><li>Hutton, S. R., Pevny, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX2+expression+levels+distinguish+between+neural+progenitor+populations+of+the+developing+dorsal+telencephalon.">SOX2 expression levels distinguish between neural progenitor populations of the developing dorsal telencephalon.</a> Dev Biol. 352 (1), 40-47 (2011).</li><li>Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+embryonic+mouse+neural+stem+cell+culture+using+the+neurosphere+assay.">Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay.</a> J Vis Exp. (47), (2011).</li><li>Sauer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis+in+the+neural+tube.">Mitosis in the neural tube.</a> The Journal of Comparative Neurology. 62 (2), 377-405 (1935).</li><li>Sessa, A., Mao, C. A., Hadjantonakis, A. K., Klein, W. H., Broccoli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tbr2+directs+conversion+of+radial+glia+into+basal+precursors+and+guides+neuronal+amplification+by+indirect+neurogenesis+in+the+developing+neocortex.">Tbr2 directs conversion of radial glia into basal precursors and guides neuronal amplification by indirect neurogenesis in the developing neocortex.</a> Neuron. 60 (1), 56-69 (2008).</li><li>Pilz, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification+of+progenitors+in+the+mammalian+telencephalon+includes+a+new+radial+glial+cell+type.">Amplification of progenitors in the mammalian telencephalon includes a new radial glial cell type.</a> Nat Commun. 4, 2125 (2013).</li><li>Fantin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+macrophages+act+as+cellular+chaperones+for+vascular+anastomosis+downstream+of+VEGF-mediated+endothelial+tip+cell+induction.">Tissue macrophages act as cellular chaperones for vascular anastomosis downstream of VEGF-mediated endothelial tip cell induction.</a> Blood. 116 (5), 829-840 (2010).</li><li>Kayam, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+for+Pax6+in+the+segmental+organization+of+the+hindbrain.">A novel role for Pax6 in the segmental organization of the hindbrain.</a> Development. 140 (10), 2190-2202 (2013).</li><li>Tata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+embryonic+neurogenesis+by+germinal+zone+vasculature.">Regulation of embryonic neurogenesis by germinal zone vasculature.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (47), 13414-13419 (2016).</li></ol>

لدى أي من أصحاب المصالح المتنافسة أو المصالح المتضاربة.

هذا البروتوكول يصف كيفية استخدام hindbrain الجنينية الماوس كنموذج لدراسة آليات الخلايا التنموية. استخدام مجموعة متنوعة من أساليب إيمونولابيلينج مختلفة، يمكن تصور hindbrain الشخصيات وعددها كمياً في أقسام الأنسجة أو عبر جهاز ووليمونتس. ويضمن سهولة التشريح والتشريح شقة أن يمكن تصويرها في هيندبرين في إعداد 'كتاب مفتوح' لجمع المعلومات عن أنماط الخلايا على مستوى الجهاز.
نعرض كذلك أن مورفولوجيا المجلس الوطني والمتصلة بدوره الخلية لمجلس الشعب لتحديد المواقع يمكن تصور على سهولة في العائمة-أو كريوسيكشنز هيندبرين. يمكن أن تستغل كل السلوكيات لتعريف السكان الجدد السلف، كما قد أجريت سابقا في الثدييات تيلينسيفالون20. على سبيل المثال، أوائل تشكيل نيوروبيثيليا Sox2+ وإطلاق شعاعي قمي Pax6+ موجودة في21،هيندبرين22، ولكن hindbrain يفتقر إلى فروعه القاعدية Tbr2+ 3 .
البروتوكول هو موضح هنا أيضا يمكن تكييفها لمراقبة سلوك الفئات السكانية الفرعية للمجلس الوطني محددة بوصفها الفلورسنت للتصوير الحي و/أو تتبع النسب في الأنسجة الثابتة. يمكن أن يتحقق هذا، على سبيل المثال، بدراسة هيندبراينس من الفئران تحمل التحوير Sox1-iCreERT2 تاموكسيفين إيندوسيبلي و مراسل Rosa26تدتوماتو 23.
بالإضافة إلى تعزيز المعرفة بالخلايا مورين، الذين يدرسون في هيندبرين قد توضيح الآليات العصبية ذات الصلة على نطاق واسع التي تمت مشاركتها عبر الأنواع، لأنه هيندبرين وهي منطقة الدماغ العالية مصانة التي من المتوقع أن يكون أكثر مماثلة بين الأنواع الفقارية مما forebrain.
كما hindbrain الخلايا يحدث خلال إطار زمني أقصر نسبيا من الخلايا فوريبرين23، من المهم النظر في الحاجة إلى مقارنة كافية نظموا الأجنة. تبعاً لذلك، هو تجنب التحيز التجريبية عد وتسجيل عدد أزواج سميط في جنين قبل عزل به هيندبرين. الأنسجة هيندبراين نفسها لا يزال هشا وينبغي لذلك أن تعالج الملقط بعناية عند فصل الأنسجة هيندبراين عن ميسينتشيمي الرأس والسحايا؛ زوجين من 'تشغيل الممارسة' قد يكون ولذا من المستصوب قبل محاولة تشريح الأجنة قيمة. وعلاوة على ذلك، ينبغي أن تنقل هيندبرينس من أنبوب واحد إلى آخر باستخدام ماصة باستور تحمل على نطاق بدلاً من الملقط لتجنب الأضرار (يمكن توسيع فتح ماصة بقطع رأس مع مقص نظيف). وأخيراً، على الرغم من غير المألوف، مدى إدماج إيدو/بردو الشخصيات S-المرحلة قد يكون المتغير، خاصة خلال نبضات قصيرة (أي، ح 1). لتحسين وضع العلامات، ضمان أن إيدو/بردو هو حل بشكل صحيح قبل تحميل الحل في المحاقن وحقن بعناية في التجويف الصفاقى. سوف يؤدي إلى فقدان أو محاصرة الحل إيدو/بردو حقن الفقراء، مثل تلك التي تحت الجلد عن طريق الصدفة، ومنعه من الدخول إلى الدورة الدموية.

أثناء تطوير الثدييات الجنينية، تقسيم الشخصيات في البطين (VZ) ومناطق (SVZ) سوبفينتريكولار نيوروبيثيليوم الآخذة في التوسع لتوليد الخلايا العصبية الجديدة في عملية تسمى 'الخلايا'. جيل جديد من الخلايا العصبية وسلائفها نواب تم التحقيق على نطاق واسع في forebrain1، بينما يعرف عن هذه العملية في مناطق أخرى.
Forebrain هو بنية معقدة ومعقد مطوية التي يتم دراستها إلى حد كبير مع أساليب نسيجية بعد تقطيع الأنسجة، مما يجعل فهم أنماط الخلايا عبر الجهاز كله تحديا. وبالإضافة إلى ذلك، دراسات للخلايا forebrain ليست التنبؤية بالضرورة سلوك العصبية في مناطق أخرى في الدماغ أو في الحبل الشوكي. على سبيل المثال، إشارات العظة قد الحصول على ردود متباينة عبر مناطق متميزة في الجهاز العصبي المركزي، كما لوحظ في حالة عامل نيوروتروفيك الهدبية واللوكيميا المثبطة، التي تشجع التجديد الذاتي للشخصيات في الأفقي ganglionic فضيلة، ولكن محرك الأقراص التفريق بين النخاع الشوكي المتكفل2. وعلاوة على ذلك، توجد فئة فرعية من الشخصيات التي ملء forebrain النامية ويسهم إلى حد كبير إلى التوسع في قشرة الدماغ1 من3هيندبرين والحبل الشوكي. عكسيا، فمن المتصور أن الحبل الشوكي و hindbrain تحتوي على أنواع فرعية للمجلس الوطني البديلة ليست موجودة في القشرة.
Hindbrain الجنين الماوس هو منطقة أقدم التطوري الدماغ الثدييات وينشئ المخيخ وجذع الدماغ. وعلى الرغم من المحافظة عليه عبر الأنواع، المعروف قليل نسبيا حول الخلايا هيندبراين، بما في ذلك الأنواع الفرعية لمجلس الشعب أو تنظيمها. معظم البحوث هيندبرين في الماوس ركز على عملية تجزئة الأنسجة، يقودها Hox الجينات4، والزخرفة من الخلايا العصبية الانقسامية بعد5. وبالإضافة إلى ذلك، قد استخدمت في هيندبرين كنموذج لدراسة آليات إنمائية تولد الأوعية6.
على النقيض من hindbrain الماوس، استخدمت على نطاق واسع hindbrain الزرد متابعة نواب التمايز والنسب التدرج في كائن نموذج فقاريات (مثلاً،،من78). كما استخدمت hindbrain الفرخ لدراسة الخلايا أثناء تطوير الفقارية (مثلاً،،من910). مماثلة إلى hindbrain الزرد11، hindbrain فرخ يمكن أن يعيش تصويرها لدراسة سلوك نواب واللائحة على مدى الساعة12. المراقبة طولية شبيهة بتصوير مباشر من غير الممكن حاليا في الكائنات الثديية، نظراً لأنها تضع في الرحم. وعلاوة على ذلك، تستهدف التلاعب من خلال تقنيات مثل يمكن تطبيقها انهانسر سهولة الزرد الشرانق الأجنة أو الفرخ الأجنة في ovo (مثلاً،13)، ولكن هذه التقنيات أيضا أكثر صعوبة في الرحم.
ومع ذلك، هيندبراين الجنين الماوس رائع مناسبة لتحديد الآليات الجزيئية والخلوية التي تنظم الخلايا. أولاً، تحليل hindbrain الماوس سيتم، في كثير من الحالات، توفر معلومات أكثر صلة بتطورات البشر من التي تم الحصول عليها من خلال دراسة الفقاريات أقل. وعلاوة على ذلك، تتوفر عدد ضخم من السلالات المعدلة وراثيا الماوس أنه يمكن أما استخدام لمصير تعيين مورين الشخصيات أو لتغيير آليات تنظيمية مع الآليلات الطور التأسيسي أو الشرطي الجينات ذات الصلة. وأخيراً، مؤخرا وقد ثبت أن microinjection hindbrain البطين موروث السابقين فيفو يسمح على الأقل دراسة موجزة ل hindbrain نواب حركية14. ومع ذلك، في الوقت الحاضر، هو يعرف إلا القليل جداً عن المنظمة الزمانية المكانية والسلوك من الشخصيات هيندبرين في سياق جهاز كله.
هنا، علينا أن نظهر طريقة بسيطة وسريعة لاستخدام في هيندبرين كنموذج قوية لتحليل سلوك نواب الثدييات في أقسام الأنسجة والاستعدادات ووليماونت. نقدم كذلك البروتوكولات ﻻستخدام إيمونولابيلينج لدراسة معلمات مختلفة من الخلايا وعملية hindbrain عينات أخرى للتطبيقات الجزيئية المصب مثل الكمية عكس المنتسخة (قرة)-بكر.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="763">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Round-bottomed reagent tube, 2.0 ml (Safe-Lock)</td>
			<td style="width:97px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">211-2120</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Plastic cell culture dish, 60 mm</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">150288</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Cell culture plates, 12-well</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">150628</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Pasteur pipettes</td>
			<td style="width:97px;">Copan</td>
			<td style="width:119px;">200C</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Dumont Watchmaker forceps, no. 5</td>
			<td style="width:97px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">91150-20</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Dumont Watchmaker forceps, no. 55</td>
			<td style="width:97px;">FST</td>
			<td>11295-51</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">29G needle/syringe</td>
			<td style="width:97px;">BD</td>
			<td>BD Micro-Fine +1ml</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Anti-phospho-histone H3 primary antibody</td>
			<td style="width:97px;">Millipore</td>
			<td>06-570</td>
			<td style="width:291px;">Goat, dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Anti-BrdU primary antibody</td>
			<td style="width:97px;">Abcam</td>
			<td>ab6326</td>
			<td style="width:291px;">Rat, dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Anti-Ki67 primary antibody</td>
			<td style="width:97px;">BD Biosciences</td>
			<td>550609</td>
			<td style="width:291px;">Mouse, dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:257px;">Anti-RC2 primary antibody</td>
			<td style="width:97px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>RC2</td>
			<td style="width:291px;">Mouse (IgM), dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Alexa Fluor 488-conjugated goat anti rabbit secondary antibody</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A11029</td>
			<td style="width:291px;">Dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Alexa Fluor 594-conjugated goat anti rabbit secondary antibody</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A11037</td>
			<td style="width:291px;">Dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse IgM secondary antibody</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A21042</td>
			<td style="width:291px;">Dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse secondary antibody</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A11001</td>
			<td style="width:291px;">Dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Alexa Fluor 594-conjugated goat anti rat secondary antibody</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A11007</td>
			<td style="width:291px;">Dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D9542</td>
			<td style="width:291px;">Use at 10 &#956;g per mL</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">5-ethynyl-2&#8217;-deoxyuridine (EdU)</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">900584</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">5-bromo-2&#180;-deoxyuridine (BrdU)</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">B5002</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">C10086</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Heat-inactivated goat serum</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G9023</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A7906</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">DAKO protein-block serum free</td>
			<td style="width:97px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">X0909</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T8787</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Phosphate buffer saline</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4417</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Sodium tetraborate</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">B9876</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Sucrose</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S0389</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Agarose</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9539</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Super PAP pen liquid blocker</td>
			<td style="width:97px;">Ted Pella, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">22309</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">SlowFade Antifade Kit</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S-2828</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Glycerol</td>
			<td style="width:97px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10337700</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Mowiol</td>
			<td style="width:97px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">475904</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">OCT</td>
			<td style="width:97px;">Scigen</td>
			<td style="width:119px;">4583</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Isopentane</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M32631</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Methanol</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">10675112</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">10316380</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:97px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">631-0912</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Superfrost microscope slides</td>
			<td style="width:97px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">631-0108</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Thermometer</td>
			<td style="width:97px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">620-0858</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Cover glass</td>
			<td style="width:97px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">631-0137</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Stereo Microscope, Leica MZ16</td>
			<td style="width:97px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">not applicable</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Confocal laser scanning microscope&#160; LSM710</td>
			<td style="width:97px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">not applicable</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the mouse hindbrain as a model for studying embryonic neurogenesis

Forebrain الجنين الماوس هو نظام العاملين الأكثر شيوعاً لدراسة الخلايا الثديية أثناء التطوير. ومع ذلك، نيوروبيثيليوم forebrain مطوية عالية غير قابلة لتحليل ووليماونت دراسة أنماط الخلايا على مستوى الجهاز. وعلاوة على ذلك، تحديد آليات الخلايا forebrain ليست بالضرورة التنبؤية للخلايا في أجزاء أخرى من الدماغ؛ على سبيل المثال، بسبب وجود أنواع فرعية محددة forebrain السلف. هيندبرين الماوس يوفر نموذج بديل لدراسة الخلايا الجنينية التي قابلة للتحليل ووليماونت، فضلا عن أقسام الأنسجة لمراقبة توزيع الزمانية المكانية وسلوك موروث العصبية. وعلاوة على ذلك، هو تشريح بسهولة للتطبيقات المتلقين للمعلومات الأخرى، مثل تحليل العزلة أو البيولوجيا الجزيئية في خلية. كما يمكن تحليل hindbrain الماوس سهولة في عدد كبير من خلية نسب مراسل وسلالات متحولة الماوس التي أصبحت متاحة، ويقدم نموذجا قويا لدراسة الآليات الجزيئية والخلوية للخلايا التنموية في الثدييات الكائن الحي. نقدم هنا، طريقة بسيطة وسريعة لاستخدام hindbrain الجنين الماوس لتحليل سلوك الخلية (مجلس الشعب) السلف العصبية الثدييات في أقسام الأنسجة والاستعدادات ووليماونت.

ويوضح هذا القسم أمثلة على النتائج التي يمكن الحصول عليها عند دراسة الخلايا في هيندبراين الجنينية الماوس من خلال تحليل المقطع ووليمونت والأنسجة.
نظهر أن إيمونولابيلينج ووليماونت من هيندبرين ميكروديسيكتيد مع جسم مضاد يتصور pHH3 ماركر الانقسامية تقسيم الشخصيات في VZ (الشكل 2B – د). نعرض pHH3+ الشخصيات في تكبير عالية لتسليط الضوء على مراحل مختلفة من الانقسام (الشكل 2). ونحن قد يتضح أن هذا الأسلوب وضع العلامات المناسبة التي يتعين القيام بها عبر عدة مراحل متتالية من التنمية هيندبرين مراقبة مسار الوقت الانقسام الوطني في هذا الجهاز (الشكل 2D).
نظهر أن التصوير إيمونولابيليد عرضية فيبرتوم أبواب hindbrain ح 1 بعد حقن إيدو، يتصور اتجاه الانقسام والشخصيات الانقسامية (الشكل 3B)، نمط الهجرة النووية بسيودوستراتيفيد، إينتيركينيتيك من ركوب الدراجات موروث18 (الشكل 3، د)، والهيكل العام VZ (الشكل 3B – د). لاحظ أن pHH3 الانقسامية+ الشخصيات موجودة فقط في سطح البطين وليس أكثر بأسالي (الشكل 3)، التي يتناقض نمط الشخصيات أكثر التزاما في forebrain19شعبة القاعدية.
نحن أيضا لتوضيح كيف يمكن المسمى ركوب الدراجات الشخصيات وذرياتهم متباينة مع بردو أو إيدو لتقييم تطور نسب نواب (الشكل 4). إيمونولابيلينج كريوسيكتيونس عرضية من الماوس hindbrain يوم 1 بعد حقن بردو بردو و Ki67يوضح العدد وتحديد المواقع للدراجات الشخصيات في نيوروبيثيليوم (الشكل 4 أ، ب)، حيث أن عدد الذاتي تجديد الشخصيات يمكن تعريفها بواسطة حساب النسبة مئوية Ki67 الخلايا بردو+ + بين جميع الخلايا بردو+ (الشكل 4 أ، ج).
أخيرا، نحن إظهار مثال على إيمونولابيلينج أقسام فيبرتوم hindbrain RC2، مستضد في الشعيرة المتوسطة الخاصة بالعصبية نيستين، وضع تصور لنواب الشعب الصيني اندفيت (الشكل 5B) والعمليات (الشكل 5). أقسام فيبرتوم، بدلاً من كريوسيكتيونس رقيقة، السماح بالمراقبة المحسنة الشخصيات العالية تشعبت وأيضا الهيكل العام نيوروبيثيليال.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56793/56793fig1.jpg"> الشكل 1 : الخطوات الرئيسية في التشريح هيندبرين من جنين الفأر e11.5. (أ – د) تصوير ميكروديسيكتيون هيندبراين التخطيطي. (أ) الأنسجة الرأس والذيلية تتم إزالتها من قبل قطع على طول أحمر منقط. (ب) لوحة سقف اخترقت وثم مزقت بعيداً في اتجاهات كل من روسترال ووالذيليه على طول خط الوسط (الخطوط الحمراء الرأسية) ومن ثم أفقياً للكشف عن نيوروبيثيليوم هيندبرين. (ج) نيوروبيثيليوم هو تبتعد عن السحايا بعد إدراج الملقط بين كل الهياكل، وتتم إزالة الأنسجة midbrain والحبل الشوكي بقطع الأنسجة بالملقط على طول أحمر منقط. (د) هذا الإجراء غلة هيندبراين الأرض. (ﻫ–ك) التقاط الصور من المراحل الرئيسية في الإجراء ميكروديسيكشن هيندبرين. (ﻫ) الجنين هو مقطوعة الرأس بجب على طول الخط المنقط. (و) hindbrain 4th البطين، المحاطة بلوحة السقف، اقتطعت ومفصولة من الرأس بجب على طول الخطوط المنقطة. (ز) البطينال 4 الموجه صعودا قبل الرصاصات ثقب صغير في سقف لوحة (العلامة النجمية). هو اتسع الثقب تقشير الأنسجة بدقة كل روسترالي وكاودالي على طول خط الوسط (الأسهم) للكشف هيندبراين. هيندبرين هو الجانب بيل متوضعة أسفل واليسار إلى إضعاف بها في إعداد كتاب مفتوح (ح؛ والأسود يشير رأس السهم إلى الأنسجة العصبية hindbrain). إذا كان مطلوباً هيندبراين في إيمونولابيلينج ووليمونت، تتم إزالة الغشاء بيال من المتطفلين بلطف نيوروبيثيليوم هيندبراين من الأغشية السحائي المحيطة باستخدام الملقط (أنا). الزائدة midbrain (ميغابايت) والحبل الشوكي (sc) الأنسجة هو إزالة (الخطوط المنقطة في J) لعزل hindbrain (K). مقياس بار: 500 ميكرومتر (E)، 300 ميكرون (و – ك). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56793/56793fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56793/56793fig2.jpg"> الشكل 2 : إيمونولابيلينج ووليمونت يمكن استخدامها لقياس ميتوسيس المجلس الوطني عبر هيندبراين- توضح التصوير تواجه أون من الشخصيات الانقسامية في طبقة البطين hindbrain التخطيطي (A). الخامس، الجانب hindbrain البطين؛ ف، الجانب هيندبرين بيل. (ب) بلاط [كنفوكل] مسح z كومة من هيندبرين e10.5 بعد إيمونولابيلينج ووليماونت على pHH3 ماركر الانقسامية (أحمر). المربع الأبيض يشير إلى منطقة سيظهر في أعلى التكبير في الفريق الثاني في (د). (ج) ما قبل طور الصعود (السهم الأبيض) والأرقام الانقسامية طور الصعود (السهم الأسود) يمكن تمييزها ضمن الفوج مجموع الانقسامية طبعا الشخصيات-(د) وقت من pHH3 ووليماونت وسم من e9.5 13.5. تغيير حجم أشرطة: 500 ميكرومتر في (ب)؛ 20 ميكرومتر (C)؛ 100 ميكرومتر (د). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56793/56793fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56793/56793fig3.jpg"> الشكل 3 : الشخصيات ركوب الدراجات داخل منطقة جيرمنال الخاصة بهم في هيندبرين روسترال. (أ) التخطيطي يصور موقف الانقسامية (الأخضر) والشخصيات S-المرحلة (الأحمر) على سطح البطين هيندبرين وفي منطقة المحيط بالبطينات، على التوالي. يتم عرض شريحة افتراضية من خلال هيندبرين التكبير أعلى على اليمين. السهم الأسود يشير إلى اتجاه هجرة ذرية للمجلس الوطني أن إنهاء دورة الخلية نحو منطقة التمايز. (ب) z [كنفوكل] كومة من مقطع هيندبرين e11.0 العائمة من جنين التي تلقي ح 1 نبض إيدو؛ واستخدمت إيمونولابيلينج pHH3 وايدو تصور الانقسامية (الأخضر) والشخصيات S-المرحلة (أحمر)، على التوالي. تتم الإشارة إلى الأسطح هيندبرين بخطوط منقطة؛ الخامس، الجانب hindbrain البطين؛ ف، الجانب hindbrain بيال. ويرد في المنطقة المشار إليها بمربع أبيض في أعلى التكبير في الداخلي؛ تشير الأسهم إلى الطائرة الانقسام في مجلس الشعب في طور الصعود، بالنسبة إلى سطح البطين. (ج) قناة واحدة تعرض pHH3 إيمونولابيلينج فقط. يتم الإشارة إلى الشخصيات الانقسامية برؤوس الأسهم السماوي؛ هو أشارت إلى نقص الشعب القاعدية Δ-(د) قناة واحدة تعرض إيدو العلامات فقط. إيدو+ الشخصيات تعتمد على توزيع بسيودوستراتيفيد بسبب هجرتهم النووية إينتيركينيتيك. ويمكن قياس المسافة التي تهاجر الشخصيات بعيداً عن سطح البطين، كما هو مبين بخط برتقالي ممثل. تغيير حجم أشرطة: 100 ميكرومتر في (ب -د)؛ 10 ميكرومتر في اقحم في (ب). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56793/56793fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56793/56793fig4.jpg"> الشكل 4 : بردو الجمع بين مع Ki67 وضع العلامات لتحديد القدرات الذاتي تجديد المجلس الوطني هيندبراين- (أ) ض [كنفوكل] كومة من كريوسيكشن هيندبرين e10.5 بعد وضع العلامات Ki67 (الأخضر) ونبض بردو (أحمر) بعد يوم 1 بردو. الخلايا إيجابية مزدوجة في منطقة البطين هي الشخصيات التي أدرجت بردو ولا تزال تتحرك من خلال دورة الخلية، كما ورد وصفها Ki67. نسبة الخلايا المسماة مزدوج بين مجموع السكان بردو+ يمثل النسبة المئوية لتجديد ذاتي الشخصيات. (ب، ج) واحد قنوات عرض Ki67 (ب) وإيمونولابيلينج بردو (ج) فقط. يتم الإشارة إلى خلية بردو+ التي تفتقر إلى Ki67 وقد خرجت ولذلك يرجح أن دورة الخلية على رأس سهم سماوي في (ألف،ج). تتم الإشارة إلى الأسطح هيندبراين بخطوط منقطة؛ الخامس، الجانب hindbrain البطين؛ ف، الجانب هيندبرين بيل. شريط الحجم: 50 ميكرومتر. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56793/56793fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56793/56793fig5.jpg"> الشكل 5 : إيمونولابيلينج نيستين يتصور عمليات المجلس الوطني واندفيت- (أ – ج) ويوضح الفلورة ل RC2، الذي يعترف حانمه على خيوط متوسطة العصبية نيستين، مورفولوجيا المجلس الوطني عبر نيوروبيثيليوم هيندبرين. (أ) ض [كنفوكل] كومة من مقطع عائمة من هيندبرين e11.5 عقب إيمونولابيلينج RC2؛ المناطق محاصر تظهر في أعلى التكبير في (ب، ب؛ المنطقة قمي/البطين) و (ج، ج '؛ والقاعدية المنطقة). تتم الإشارة إلى الأسطح هيندبراين بخطوط منقطة؛ الخامس، الجانب hindbrain البطين؛ ف، الجانب هيندبرين بيل. (ب، ج) مكدسات z [كنفوكل] مناطق محاصر في (أ)؛ وتظهر المقاطع بصري واحد في (ب، ج ')، على التوالي. يشار مجلس الشعب اندفوت قمي ترتكز على سطح البطين سهم في (ب). يتم الإشارة إلى عمليات المجلس الوطني واحد وفاسسيكولاتيد برؤوس بيضاء وسوداء في (ج ')، على التوالي. تغيير حجم أشرطة: 100 ميكرومتر، (A)؛ 25 ميكرومتر (ب، ج). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56793/56793fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about The Mouse Hindbrain As a Model for Studying Embryonic Neurogenesis at JoVE.com

The Mouse Hindbrain As a Model for Studying Embryonic Neurogenesis

هيندبراين الماوس كنموذج لدراسة الخلايا الجنينية

يوضح هذا المقال كيفية hindbrain الجنينية الماوس يمكن استخدامها كنموذج لدراسة الخلايا التنموية في كل من الجهاز كله واستعدادات قسم الأنسجة.

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded ...

the-mouse-hindbrain-as-a-model-for-studying-embryonic-neurogenesis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.9K Views.  UCL Institute of Ophthalmology. يوضح هذا المقال كيفية hindbrain الجنينية الماوس يمكن استخدامها كنموذج لدراسة الخلايا التنموية في كل من الجهاز كله واستعدادات قسم الأنسجة.

Video: The Mouse Hindbrain As a Model for Studying Embryonic Neurogenesis

Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish embryos, injection of plasmid DNA results in mosaic expression, allowing for the visualization of single cells or small clusters of cells 1 . We describe how injection of plasmid DNA encoding membrane-targeted Green Fluorescent Protein (mGFP) under the control of a ubiquitous promoter can be used for imaging cells undergoing neurulation. Central to this protocol is the methodology for imaging labeled cells at high resolution in sections and also in real time. This protocol entails the injection of mGFP DNA into young zebrafish embryos. Embryos are then processed for vibratome sectioning, antibody labeling and imaging with a confocal microscope. Alternatively, live embryos expressing mGFP can be imaged using time-lapse confocal microscopy. We have previously used this straightforward approach to analyze the cellular behaviors that drive neural tube formation in the hindbrain region of zebrafish embryos 2. The fixed preparations allowed for unprecedented visualization of cell shapes and organization in the neural tube while live imaging complemented this approach enabling a better understanding of the cellular dynamics that take place during neurulation.

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early embryo is the ability to image cells at high resolution. We describe here a technique for labeling single cells or small clusters of cells in whole zebrafish embryos with membrane-targeted Green Fluorescent Protein.

التوسيم وخلايا الدماغ المؤخر التصوير في اسماك الزرد

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish ...

A Procedure for Studying the Footshock-Induced Reinstatement of Cocaine Seeking in Laboratory Rats

The most insidious aspect of drug addiction is the high propensity for relapse. Animal models of relapse, known as reinstatement procedures, have been used extensively to study the neurobiology and phenomenology of relapse to drug use. Although procedural variations have emerged over the past several decades, the most conventional reinstatement procedures are based on the drug self-administration (SA) model. In this model, an animal is trained to perform an operant response to obtain drug. Subsequently, the behavior is extinguished by withholding response-contingent reinforcement. Reinstatement of drug seeking is then triggered by a discrete event, such as an injection of the training drug, re-exposure to drug-associated cues, or exposure to a stressor 1.
Reinstatement procedures were originally developed to study the ability of acute non-contingent exposure to the training drug to reinstate drug seeking in rats and monkeys 1, 2. Reinstatement procedures have since been modified to study the role of environmental stimuli, including drug-associated cues and exposure to various forms of stress, in relapse to drug seeking 1, 3, 4.
Over the past 15 years, a major focus of the reinstatement literature has been on the role of stress in drug relapse. One of the most commonly used forms of stress for studying this relationship is acute exposures to mild, intermittent, electric footshocks. The ability of footshock stress to induce reinstatement of drug seeking was originally demonstrated by Shaham and colleagues (1995) in rats with a history of intravenous heroin SA5. Subsequently, the effect was generalized to rats with histories of intravenous cocaine, methamphetamine, and nicotine SA, as well as oral ethanol SA 3, 6.
Although footshock-induced reinstatement of drug seeking can be achieved reliably and robustly, it is an effect that tends to be sensitive to certain parametrical variables. These include the arrangement of extinction and reinstatement test sessions, the intensity and duration of footshock stress, and the presence of drug-associated cues during extinction and testing for reinstatement. Here we present a protocol for footshock-induced reinstatement of cocaine seeking that we have used with consistent success to study the relationship between stress and cocaine seeking.

Animal models of relapse, known as reinstatement procedures, have been used extensively to study the role of stress in relapse to drug seeking. Here, we report on a method for inducing the reinstatement of cocaine seeking in laboratory rats via acute exposures to mild, intermittent electric footshock.

إجراء دراسة لإعادة Footshock الناتج عن السعي من الكوكايين في فئران التجارب

The most insidious aspect of drug addiction is the high propensity for relapse.  Animal models of relapse, known as reinstatement procedures, have been ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

تأسيس الخلايا الجذعية الجنينية الماوس العصبية الثقافة باستخدام الفحص Neurosphere

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. Neuroepithelial cells of the neural tube that express Nkx6.1 are the unique precursor cells for spinal motoneurons1. Though postmitotic motoneurons move towards their final position and organize themselves into columns along the spinal tract2,3. More than 90% of all these differentiated and positioned motoneurons express the transcription factors Islet 1/2. They innervate the muscles of the limbs as well as those of the body and the inner organs. Among others, motoneurons typically express the high affinity receptors for brain derived neurotrophic factor (BDNF) and Neurotrophin-3 (NT-3), the tropomyosin-related kinase B and C (TrkB, TrkC). They do not express the tropomyosin-related kinase A (TrkA)4. Beside the two high affinity receptors, motoneurons do express the low affinity neurotrophin receptor p75NTR. The p75NTR can bind all neurotrophins with similar but lower affinity to all neurotrophins than the high affinity receptors would bind the mature neurotrophins. Within the embryonic spinal cord, the p75NTR is exclusively expressed by the spinal motoneurons5. This has been used to develop motoneuron isolation techniques to purify the cells from the vast majority of surrounding cells6. Isolating motoneurons with the help of specific antibodies (panning) against the extracellular domains of p75NTR has turned out to be an expensive method as the amount of antibody used for a single experiment is high due to the size of the plate used for panning. A much more economical alternative is the use of lectin. Lectin has been shown to specifically bind to p75NTR as well7. The following method describes an alternative technique using wheat germ agglutinin for a preplating procedure instead of the p75NTR antibody. The lectin is an extremely inexpensive alternative to the p75NTR antibody and the purification grades using lectin are comparable to that of the p75NTR antibody. Motoneurons from the embryonic spinal cord can be isolated by this method, survive and grow out neurites.

An alternative way of isolating mouse embryonic motoneurons from the spinal cord is described. The method takes into account the fact that lectin can bind to the low affinity nerve growth factor receptor p75NTR. This lectin-based preplating allows a purification similar to that with a specific antibody against the p75NTR.

Lectin القائم على عزل وثقافة حركية مماثلة الجنينية الماوس

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C. elegans genome includes potential antipsychotic drug (APD) targets conserved in humans, including genes encoding proteins required for neurotransmitter synthesis and for synaptic structure and function. APD exposure produces developmental delay and/or lethality in nematodes in a concentration-dependent manner. These phenotypes are caused, in part, by APD-induced inhibition of pharyngeal pumping1,2. Thus, the developmental phenotype has a neuromuscular basis, making it useful for pharmacogenetic studies of neuroleptics. Here we demonstrate detailed procedures for testing APD effects on nematode development and pharyngeal pumping. For the developmental assay, synchronized embryos are placed on nematode growth medium (NGM) plates containing APDs, and the stages of developing animals are then scored daily. For the pharyngeal pumping rate assay, staged young adult animals are tested on NGM plates containing APDs. The number of pharyngeal pumps per unit time is recorded, and the pumping rate is calculated. These assays can be used for studying many other types of small molecules or even large molecules.

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Approaches for testing the effects of antipsychotic drugs (APDs) in Caenorhabditis elegans are demonstrated. Assays are described for testing drug effects on development and viability and on pharyngeal pumping rate. These methods are also applicable for pharmacogenetic experiments with drug classes other than APDs.

أساليب لدراسة آليات عمل المضادة للذهان من أدوية في<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

التصوير حية من الانقسام في تطوير الجنينية الماوس اللحاء

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets containing specific growth factors that trigger blood vessel growth throughout the naturally avascular cornea, angiogenesis can be measured and quantified. In this assay the angiogenic response is generated over the course of several days, depending on the type and dose of growth factor used. The induction of neovascularization is commonly triggered by either basic fibroblast growth factor (bFGF) or vascular endothelial growth factor (VEGF). By combining these growth factors with sucralfate and hydron (poly-HEMA (poly(2-hydroxyethyl methacrylate))) and casting the mixture into pellets, they can be surgically implanted in the mouse eye. These uniform pellets slowly-release the growth factors over five or six days (bFGF or VEGF respectively) enabling sufficient angiogenic response required for vessel area quantification using a slit lamp. This assay can be used for different applications, including the evaluation of angiogenic modulator drugs or treatments as well as comparison between different genetic backgrounds affecting angiogenesis. A skilled investigator after practicing this assay can implant a pellet in less than 5 min per eye.

The protocol describes the corneal micropocket assay as developed in mice.

والقرنية Micropocket الفحص: نموذج من الأوعية الدموية في العين ماوس

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets ...

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering the molecular signals that cooperatively guide neuronal migration in the embryonic brain is therefore important to understand how the complex neural networks form which later support postnatal life. Facial branchiomotor (FBM) neurons in the mouse embryo hindbrain migrate from rhombomere (r) 4 caudally to form the paired facial nuclei in the r6-derived region of the hindbrain. Here we provide a detailed protocol for wholemount ex vivo culture of mouse embryo hindbrains suitable to investigate the signaling pathways that regulate FBM migration. In this method, hindbrains of E11.5 mouse embryos are dissected and cultured in an open book preparation on cell culture inserts for 24 hr. During this time, FBM neurons migrate caudally towards r6 and can be exposed to function-blocking antibodies and small molecules in the culture media or heparin beads loaded with recombinant proteins to examine roles for signaling pathways implicated in guiding neuronal migration.

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the neural tube, but migrate to reach appropriate targets. Facial branchiomotor (FBM) neurons are a useful model to study neuronal migration. This protocol describes the wholemount ex vivo culture of mouse embryo hindbrains to investigate mechanisms that regulate FBM migration.

الماوس الدماغ المؤخر<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; الثقافة لدراسة الهجرة Branchiomotor الوجه العصبية

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering ...

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional afferent fibers monitor other characteristics of the muscle environment, including metabolite buildup, temperature, and nociceptive stimuli. Overall, abnormal activation of sensory neurons can lead to movement disorders or chronic pain syndromes. We describe the isolation of the extensor digitorum longus (EDL) muscle and nerve for in vitro study of stretch-evoked afferent responses in the adult mouse. Sensory activity is recorded from the nerve with a suction electrode and individual afferents can be analyzed using spike sorting software. In vitro preparations allow for well controlled studies on sensory afferents without the potential confounds of anesthesia or altered muscle perfusion. Here we describe a protocol to identify and test the response of muscle spindle afferents to stretch. Importantly, this preparation also supports the study of other subtypes of muscle afferents, response properties following drug application and the incorporation of powerful genetic approaches and disease models in mice.

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscle sensory neurons are involved in proprioceptor signaling and also report on metabolic state and injury related events. We describe an adult mouse in vitro muscle-nerve preparation for studies on stretch-activated muscle afferents.

و<em&gt; في المختبر</em&gt; ماوس الكبار إعداد العضلات العصبية لدراسة خصائص اطلاق Afferents العضلات

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

النظام الشمي كنموذج لدراسة أنماط نمو محور عصبي ومورفولوجيا<em&gt; في فيفو</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...