بإثبات جامعة كانساس مفهوم صندوق تمويل المشروع الحالي. نود أن نشكر موظفي التمريض في كومك (كانساس سيتي، كانساس) لمساعدتنا في الحصول على البشرية السرة الحبال، وديفيد يورجنسن لمساعدة مع الثقافات كوتشلياي.

وأجريت جميع الإجراءات، بما في ذلك القتل الرحيم الحيوان، وفقا للموافق عليها "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (IACUC) البروتوكول (أكوب #2014-2234) في المركز الطبي جامعة كانساس (كومك).
ملاحظة: هوجكس كانت معزولة من الحبال السرة البشرية التي كانت تبرعت بها المرضى التي قدمت المستنيرة واستخدمت العينات وفقا للبروتوكولات التي أقرتها اللجنة مواضيع البشرية جامعة كانساس (15402 # كو-مجلس الهجرة واللاجئين).
1-العظم الصدغي الحصاد والعزلة القوقعة
<ol>
	<li>قطع رأس ماوس euthanized على نحو ملائم، وعمرها 15 عاماً في الأسبوع بالقطع بين الجمجمة وأول فقرة عنق الرحم مع زوج حادة من مقص الجراحة، ثم رش أسفل الرأس مع الإيثانول 70% لتطهير (الشكل 1A).</li>
	<li>تقسم الجمجمة في طائرة منتصف السهمي استخدام نفس زوج حادة مقص جراحي (الشكل 1B-ج، خطوط متقطعة).</li>
	<li>إزالة أنسجة المخ من الجمجمة باستخدام زوج من الملقط (الشكل 1، رأس السهم).</li>
	<li>تحديد العظم الصدغي من خلال وجود السمع وجذور الأعصاب دهليزي (الشكل 1E-F، رؤوس الأسهم) في داخل الجمجمة وقناة الإذن من الخارج (الشكل 1F، السهم). قص بعناية من خلال الجمجمة لعزل العظم الصدغي من الجزء المتبقي الجمجمة (الشكل 1). ملاحظة: في بعض الحالات، قد يكون ممكناً دقة نقب عظام الجمجمة بعيداً عن العظم الصدغي المحيطة بها دون الحاجة إلى قطع.</li>
	<li>إدراج الملقط غرامة في فتح قناة الإذن حوالي 5 ملم (الشكل 1 ح)، حيث لا خطر النصائح ثقب القوقعة. كسر برفق فتح العظام الفقاعة (الشكل 1 ح، أعلى المنطقة المظللة بالأحمر) حيث أنها كسور (الرقم 1I، أحمر منقط الخط). ملاحظة: إذا لزم الأمر، مجهر تشريح يمكن أن تساعد في هذه العملية لضمان وضع دقيق والتلاعب بالصكوك.</li>
	<li>استخدام الملقط غرامة، حدق بعيداً ما تبقى الفقاعة من العظم الصدغي، فضح متاهة عظمى من القوقعة (1J الشكل، الأقواس الحمراء).</li>
	<li>ضع طبق بتري كبير بما فيه الكفاية لاحتواء العظم الصدغي (مثلاً، 30 ملم أو أكبر) تحت تشريح نطاق مجال الرؤية وملئه بما يكفي الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لتغطية العظم الصدغي (مثلاً، مل 0.5 إلى 1).</li>
	<li>غمر العظم الصدغي مع الفقاعة إزالة في برنامج تلفزيوني مع نوافذ بيضاوية وجولة القوقعة مواجهة. ملاحظة: إزالة النظام الدهليزية من القوقعة ليس من الضروري، كما النظام الدهليزية يخدم أيضا كمؤشر للتلاعب وتوجيه ملامح القوقعة (الرقم 1I و الشكل 2).</li>
	<li>استخدام زوج جيد جداً من الملقط، إزالة الشريان ستابيديال، الذي يمر stapes.</li>
	<li>إدراج تلميح واحد من الملقط غرامة فائقة من خلال قوس stapes حيث مرت الشريان، ودقة رفع stapes إلى أعلى. وينبغي رفع stapes ديسارتيكولاتيد الخروج من الإطار البيضاوي.</li>
	<li>استخدام تلميح واحد من الملقط غرامة فائقة، الثقب البيضاوي وجولة windows.</li>
	<li>استخدام برنامج تلفزيوني س 1 ملء محقنة قياس 28.5 مع أنابيب (القطر الداخلي 0.28 ملم، القطر الخارجي مم 0.61) المرفقة، ضع الأنبوب فوق الإطار البيضاوي (الشكل 2A -ب). ملاحظة: فتح الأنبوب يمكن التلاعب بها باستخدام الملقط غرامة فائقة مما يساعد على ضمان وضع دقيق.<ol>
		<li>استخدام المحاقن الطازجة وأنابيب لكل قوقعة الإذن.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>نتخلل 2 مل 10% مضاد حيوي فطري (المضادة مكافحة) و 10% البنسلين-ستربتوميسين (القلم-بكتيريا) في برنامج تلفزيوني عن طريق القوقعة ما يزيد على 5 دقائق لإزالة في perilymph. بيرفوسينج سريع جداً مع الكثير من الضغوط ستؤدي إلى الأضرار الهياكل الدقيقة داخل القوقعة. ملاحظة: يدوياً القيادة المحاقن باليد نتخلل السوائل عن طريق القوقعة فعالة، على الرغم من أن مضخة التروية يمكن أن تستخدم كبديل لذلك.<ol>
		<li>إذا بيرفوسينج يدوياً، استخدام زوج من الغرامة، ذاتية الإغلاق الملقط على استقرار القوقعة (الشكل 2A) أثناء التروية باستيعاب الجزء الدهليزية من العظم الصدغي. ملاحظة: على الرغم من أن ليس مطلوباً، وهذا يترك كلتا يديه مجاناً للتعامل مع الصكوك؛ جهة يمكن أن تدفع المحاقن (الشكل 2A) بينما أخرى يمكن وضع الأنابيب على النحو المناسب (الشكل 2).</li>
		<li>من هذه الخطوة إلى الأمام، والحرص على تجنب تعريض القوقعة دون داع إلى الهواء. إدخال فقاعات الهواء في المسافات السوائل بحظر تداول السوائل، وسيضر تجفيف المزيد الهياكل الدقيقة داخل القوقعة.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>إزالة وتجاهل أي المتبقية العضلات العظام والأنسجة الأجزاء باستخدام الملقط غرامة.</li>
	<li>إذا لزم الأمر، تخزين كوكليا معزولة في 4 درجات مئوية في مكافحة المضادة نسبة 10% والحل القلم-بكتيريا 10% في برنامج تلفزيوني لمدة تصل إلى سبعة أيام مع التغييرات العادية في حل المضادات الحيوية كل 48 ساعة.</li>
</ol>
2-cochlear التجهيز
<ol>
	<li>ديسيلولاريزيشن
	<ol>
		<li>لكل القوقعة، كبريتات ملء قنينة زجاج 20 مل التﻷلؤ مع دوديسيل صوديوم 1% (SDS) الحل في إزالة المتأين (DI) المياه، الذي يستخدم في ديسيلولاريزي القوقعة.</li>
		<li>قص غيض قبالة ماصة بلاستيك 7 مل نقل استخدام شفرة حلاقة حتى لا يكون كبيرا بما يكفي لقوقعة الإذن المرور من خلال فتح.</li>
		<li>استخدام ماصة نقل، برفق وضع القوقعة إلى ماصة حيث يمر فقط على حافة وقف إنتاج المواد الانشطارية قبل بضعة ملليمترات.</li>
		<li>طرد القوقعة إلى القنينة التﻷلؤ مملوءة بحل الحزب الديمقراطي الصربي 1%.</li>
		<li>تعميم 2 مل من الحزب الديمقراطي الصربي 1% في الماء (دي) دي المتأين عن طريق القوقعة في القنينة التﻷلؤ استخدام ماصة نقل.</li>
		<li>ضع القنينة التﻷلؤ في دوار، وتسمح القنينة التﻷلؤ لتدوير 10 لفة في الدقيقة ح 72 في درجة حرارة الغرفة.<ol>
			<li>تغيير حل الحزب الديمقراطي الصربي 1% كل 24 ساعة على مدى فترة ح 72. العناية عند تغيير الحزب الديمقراطي الصربي لفضح القوقعة للهواء ابدأ.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>أغسل القوقعة ثلاث مرات عن 30 دقيقة مع المياه دي.</li></ol></li></ol>أداء يغسل في نفس القنينة التﻷلؤ المستخدمة لرسوم مخزونات النشر الاستراتيجي؛ وفي هذه المرحلة، هو ديسيلولاريزيد القوقعة.
	
	
	<li>ديكالسيفيكيشن
	<ol>
		<li>إزالة المياه دي المتبقية من القنينة التﻷلؤ، وترك ما يكفي لإبقاء القوقعة المغمورة.</li>
		<li>لبدء ديكالسيفيكيشن، إضافة 5 مل حمض الإيثيلين 10% (يدتا) (0.02 M) في المياه دي التﻷلؤ القنينة التي تحتوي على القوقعة.</li>
		<li>تعميم 2 مل يدتا 10% في المياه دي عن طريق القوقعة في القنينة التﻷلؤ باستخدام ماصة نقل.</li>
		<li>مكان القنينة التﻷلؤ في محور دوار، والسماح للقنينة التﻷلؤ لتدوير 10 لفة في الدقيقة ح 72 في درجة حرارة الغرفة. تغيير الحل يدتا 10% كل 24 ساعة على مدى فترة ح 72. العناية عند تغيير الحلول حيث أن القوقعة لا يتعرض للهواء.</li>
		<li>شطف القوقعة 3 مرات ل 2 ح مع برنامج تلفزيوني 1 x؛ وفي هذه المرحلة، هو ديكالسيفيد القوقعة.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>تخزين
	<ol>
		<li>تخزين كوتشلياي ليصل إلى 72 ساعة في 10% مكافحة المضادة، 10% بكتيريا قلم حلاً في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية. ملاحظة: قد تكون أطول من فترات التخزين ممكن مع التغييرات العادية في حل المضادات الحيوية؛ ومع ذلك، لا تم التحقق من تخزين ممتدة من كوكليا المجهزة في هذا البروتوكول.</li>
	</ol>
	</li>

3-المشتريات وتوسيع هوجكس
<ol>
	<li>عزل هوجكس وفقا للبروتوكولات المنشورة سابقا22. بإيجاز، الجزء السري الحبال إلى أقسام 3 سم.</li>
	<li>بعناية تجعل الطول شق ضحلة مع مشرط على كل قطعة من الحبل السري لإلغاء وفضح جيلي وارتون الحبل السري. استخدام الملقط لإزالة الأوعية الدموية.</li>
	<li>تغسل شرائح الحبل السري مرتين مع برنامج تلفزيوني كافية (مثلاً، 40 مل في 60 مم طبق بيتري) إلى غمر الأنسجة. فرم ناعما شرائح الأنسجة مع مشرط. هضم الأنسجة في 100 مم طبق بيتري مع 50 مل متوسطة الهضم (كولاجيناز نوع 2 0.2 ٪، 1 ٪ البنسلين والستربتوميسين، في انخفاض الجلوكوز المتوسطة (دميم "تعديل النسر" دولبيكو)).</li>
	<li>وضع الأنسجة في هضم المتوسطة في شاكر مداري 50 لفة في الدقيقة بين عشية وضحاها في 5% CO2، حاضنة 37 درجة مئوية. وفي اليوم التالي تضعف الهضم المتوسطة بنسبة 01:16 في المائة 2 مضاد حيوي فطري في برنامج تلفزيوني، وبيليه الخلايا باستخدام الطرد المركزي في ز 500 x في درجة حرارة الغرفة (~ 27 درجة مئوية) للمادة 10 دقيقة تجاهل طافية.</li>
	<li>ريسوسبيند الكريات في متوسط نمو الخلايا الجذعية الوسيطة (مسكجم) وإعادة تجميع الخلايا. تعامل الخلايا لوحة في كثافة 7 × 103 خلايا/سم2 في زراعة الأنسجة قوارير T-75. الثقافة هوجكس في مسكجم، وتوسيع لمرور 5 للتجارب. ملاحظة: هوجكس قد تكون شبه مثقف في قوارير تي أكبر (مثلاً، T-150، T-300) عند باساجينج لزيادة غلة هوجكس للتجارب.</li>
</ol>
4-ضخ هوجكس في "كوتشلياي ديسيلولاريزيد"
<ol>
	<li>إعداد كوتشلياي ديسيلولاريزيد
	<ol>
		<li>باستخدام تقنية معقمة، أغسل كوتشلياي المخزنة في برنامج تلفزيوني 1 x ثلاث مرات لكل 30 دقيقة.</li>
		<li>نقل كوتشلياي إلى آبار منفصلة من صفيحة 24-جيدا، وإضافة 1 مل من 37 درجة مئوية قبل استعد مسكجم.</li>
		<li>احتضان كوتشلياي في 5% CO2, 37 درجة مئوية خلية ثقافة حاضنة للحد ني ح 1 قبل ضخ للخلايا.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>فصل هوجكس وريسوسبيند
	<ol>
		<li>أغسل هوجكس مع 37 درجة مئوية قبل استعد 1 x PBS مرتين.</li>
		<li>إضافة ما يكفي 37 درجة مئوية قبل استعد التربسين مع يدتا 0.5% لتغطية سطح السفينة الخلية.</li>
		<li>احتضان هوجكس لمدة تصل إلى 5 دقائق في 5% CO2, 37 درجة مئوية خلية ثقافة حاضنة.<ol>
			<li>تحقق من أن فصل 90% خلايا من سطح الثقافة الخلية عن طريق عرض الخلايا تحت مجهر مقلوب. ملاحظة: فصل الخلايا التي تتحرك عندما يتم استغلالها السفينة الثقافة بلطف،. وقد فصل الخلايا التي تظل ثابتة، لا.</li>
			<li>اضغط برفق جانبي قارورة كذلك إزاحة الخلايا المرفقة.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>باستخدام تقنية معقمة، هوجكس نقل من سفينة الثقافة إلى أنبوب 50 مل مخروطية الشكل الذي يحتوي على وحدة تخزين ما يعادل من مسكجم لحجم التربسين المستخدمة لفصل الخلايا.</li>
		<li>بيليه هوجكس طريق سينتريفوجينج في 500 غرام x في درجة حرارة الغرفة (~ 27 درجة مئوية) لمدة 5 دقائق.</li>
		<li>نضح المادة طافية، وريسوسبيند هوجكس في مسكجم بتركيز 500,000 خلايا/مل.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>نتخلل كوتشلياي
	<ol>
		<li>نقل كوتشلياي إلى لوحة 24-بئر جديدة باستخدام ماصة نقل.</li>
		<li>إضافة قطره مسكجم لكل قوقعة الإذن لمنع أي القوقعة من الجفاف.</li>
		<li>دقة توجيه القوقعة استخدام الملقط غرامة فائقة بحيث تواجه النوافذ البيضاوي وجولة. ملاحظة: اتخاذ الحذر الشديد عند التعامل مع كل القوقعة مباشرة كما هو تلف القوقعة بسهولة.</li>
		<li>استخدام المحاقن معقمة 28.5-قياس الأنسولين مع أنابيب متصلة، رسم يصل 0.2 مل حراكه هوجكس (100,000 الخلايا).</li>
		<li>استخدام الملقط المعقم غرامة، ضع أنابيب الإطار البيضاوي.</li>
		<li>دقة وبطء نتخلل القوقعة مع 0.2 مل من حراكه هوجكس استخدام حقنه الأنسولين 28.5-قياس متصلة بأنابيب البولي إيثيلين (القطر الخارجي: 0.61 ملم، و "قطرها الداخلي": 0.28 ملم) على مدى ما يقرب من 5 دقائق.</li>
		<li>بعد نضح، إضافة 0.8 مل 37 درجة مئوية قبل استعد مسكجم تتضمن أيضا القوقعة لتحقيق الحجم الإجمالي في البئر إلى 1 مل.</li>
		<li>كرر الخطوات 4.3.3-4.3.7 لكل القوقعة، استخدام المحاقن طازجة والأنابيب في كل مرة.</li>
		<li>مكان perfused كوتشلياي في 5% CO2, 37 درجة مئوية خلية ثقافة حاضنة، وتغيير وسائل الإعلام ثلاث مرات في الأسبوع.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5-القوقعة الحصاد والحفاظ عليها
ملاحظة: كوتشلياي قد يكون مثقف وتحصد في أي وقت تصل إلى 30 يوما بعد انتهاء التروية.
<ol>
	<li>للحفاظ على كوتشلياي، إصلاح في بارافورمالدهيد 4% في برنامج تلفزيوني س 1 بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية على منصة هزاز.</li>
	<li>بعد التثبيت، يغسل كوكليا مع برنامج تلفزيوني 1 x ثلاث مرات لمدة 5 دقائق.</li>
	<li>تدريجيا يذوي القوقعة مع الإيثانول وواضحة مع المذيبات هيدروكربونية الاليفاتيه قبل تضمينها في البارافين.</li>
	<li>قسم العينات بسمك 10 ميكرون باستخدام مبضع وجبل على الزجاج شرائح المجهر. ملاحظة: نماذج جاهزة الآن لغذائها أو تجهيز المناعي باستخدام البروتوكولات القياسية.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Raphael, Y., Altschuler, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+innervation+of+the+cochlea.">Structure and innervation of the cochlea.</a> Brain Res Bull. 60 (5-6), 397-422 (2003).</li><li>LeMasurier, M., Gillespie, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair-Cell+Mechanotransduction+and+Cochlear+Amplification.">Hair-Cell Mechanotransduction and Cochlear Amplification.</a> Neuron. 48 (3), 403-415 (2005).</li><li>Neal, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cell+counts+in+a+rat+model+of+sound+damage:+Effects+of+tissue+preparation+&amp;+identification+of+regions+of+hair+cell+loss.">Hair cell counts in a rat model of sound damage: Effects of tissue preparation &amp; identification of regions of hair cell loss.</a> Hear Res. 328, 120-132 (2015).</li><li>Ivory, R., Kane, R., Diaz, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-induced+hearing+loss:+a+recreational+noise+perspective.">Noise-induced hearing loss: a recreational noise perspective.</a> Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 22 (5), 394-398 (2014).</li><li>Stucken, E. Z., Hong, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-induced+hearing+loss:+an+occupational+medicine+perspective.">Noise-induced hearing loss: an occupational medicine perspective.</a> Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 22 (5), 388-393 (2014).</li><li>Dille, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tinnitus+onset+rates+from+chemotherapeutic+agents+and+ototoxic+antibiotics:+results+of+a+large+prospective+study.">Tinnitus onset rates from chemotherapeutic agents and ototoxic antibiotics: results of a large prospective study.</a> J Am Acad Audiol. 21 (6), 409-417 (2010).</li><li>Sajjadi, H., Paparella, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meniere's+disease.">Meniere's disease.</a> Lancet. 372 (9636), 406-414 (2008).</li><li>House, J. W., Brackmann, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tinnitus:+surgical+treatment.">Tinnitus: surgical treatment.</a> Ciba Found Symp. 85, 204-216 (1981).</li><li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+of+age-related+hearing+loss+by+early+noise+exposure:+evidence+of+a+misspent+youth.">Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth.</a> J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).</li><li>Ryals, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+species+differences+in+susceptibility+to+noise+exposure.">Avian species differences in susceptibility to noise exposure.</a> Hear Res. 131 (1-2), 71-88 (1999).</li><li>Koehler, K. R., Mikosz, A. M., Molosh, A. I., Patel, D., Hashino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+inner+ear+sensory+epithelia+from+pluripotent+stem+cells+in+3D+culture.">Generation of inner ear sensory epithelia from pluripotent stem cells in 3D culture.</a> Nature. 500 (7461), 217-221 (2013).</li><li>Sekiya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+transplantation+to+the+auditory+nerve+and+cochlear+duct.">Cell transplantation to the auditory nerve and cochlear duct.</a> Exp Neurol. 198 (1), 12-24 (2006).</li><li>Shi, F., Edge, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospects+for+replacement+of+auditory+neurons+by+stem+cells.">Prospects for replacement of auditory neurons by stem cells.</a> Hear Res. 297, 106-112 (2013).</li><li>Mellott, A. J., Shinogle, H. E., Nelson-Brantley, J. G., Detamore, M. S., Staecker, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+decellularized+cochleae+as+scaffolds+for+inner+ear+tissue+engineering.">Exploiting decellularized cochleae as scaffolds for inner ear tissue engineering.</a> Stem Cell Res Ther. 8, (2017).</li><li>Santi, P. A., Johnson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+ear+tissues+as+scaffolds+for+stem+cell+differentiation.">Decellularized ear tissues as scaffolds for stem cell differentiation.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 14 (1), 3-15 (2013).</li><li>Davies, D., Holley, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+alpha+3+and+alpha+6+integrins+in+the+developing+mouse+inner+ear.">Differential expression of alpha 3 and alpha 6 integrins in the developing mouse inner ear.</a> J Comp Neurol. 445 (2), 122-132 (2002).</li><li>Gerchman, E., Hilfer, S. R., Brown, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+extracellular+matrix+in+the+formation+of+the+inner+ear.">Involvement of extracellular matrix in the formation of the inner ear.</a> Dev Dyn. 202 (4), 421-432 (1995).</li><li>Goodyear, R. J., Richardson, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrices+associated+with+the+apical+surfaces+of+sensory+epithelia+in+the+inner+ear:+molecular+and+structural+diversity.">Extracellular matrices associated with the apical surfaces of sensory epithelia in the inner ear: molecular and structural diversity.</a> J Neurobiol. 53 (2), 212-227 (2002).</li><li>Mellott, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+Viability+and+Transfection+Efficiency+with+Human+Umbilical+Cord+Wharton's+Jelly+Cells+Through+Use+of+a+ROCK+Inhibitor.">Improving Viability and Transfection Efficiency with Human Umbilical Cord Wharton's Jelly Cells Through Use of a ROCK Inhibitor.</a> Cell Reprogram. , (2014).</li><li>Mellott, A. J., Shinogle, H. E., Moore, D. S., Detamore, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Photo-conversion:+A+second+chance+to+label+unique+cells.">Fluorescent Photo-conversion: A second chance to label unique cells.</a> Cell Mol Bioeng. 8 (1), 187-196 (2015).</li><li>Mitchell, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+cells+from+Wharton's+jelly+form+neurons+and+glia.">Matrix cells from Wharton's jelly form neurons and glia.</a> Stem Cells. 21 (1), 50-60 (2003).</li><li>Mellott, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonviral+Reprogramming+of+Human+Wharton's+Jelly+Cells+Reveals+Differences+Between+ATOH1+Homologues.">Nonviral Reprogramming of Human Wharton's Jelly Cells Reveals Differences Between ATOH1 Homologues.</a> Tissue Eng Part A. 21 (11-12), 1795-1809 (2015).</li><li>Buytaert, J. A., Johnson, S. B., Dierick, M., Salih, W. H., Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroCT+versus+sTSLIM+3D+imaging+of+the+mouse+cochlea.">MicroCT versus sTSLIM 3D imaging of the mouse cochlea.</a> J Histochem Cytochem. 61 (5), 382-395 (2013).</li><li>Nonoyama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+ototoxicity+of+gadoteridol+(ProHance)+and+gadodiamide+(Omniscan)+in+mice.">Investigation of the ototoxicity of gadoteridol (ProHance) and gadodiamide (Omniscan) in mice.</a> Acta Otolaryngol. 136 (11), 1091-1096 (2016).</li><li>Dai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhesus+Cochlear+and+Vestibular+Functions+Are+Preserved+After+Inner+Ear+Injection+of+Saline+Volume+Sufficient+for+Gene+Therapy+Delivery.">Rhesus Cochlear and Vestibular Functions Are Preserved After Inner Ear Injection of Saline Volume Sufficient for Gene Therapy Delivery.</a> J Assoc Res Otolaryngol. , (2017).</li><li>Sutherland, A. J., Converse, G. L., Hopkins, R. A., Detamore, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bioactivity+of+cartilage+extracellular+matrix+in+articular+cartilage+regeneration.">The bioactivity of cartilage extracellular matrix in articular cartilage regeneration.</a> Adv Healthc Mater. 4 (1), 29-39 (2015).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

لقد أظهرنا بنجاح أن يمكن إزالة الخلايا cochlear الأصلية من القوقعة عبر عملية ديسيلولاريزيشن، الذي يسمح باستخدام القوقعة سقالة أنسجة معقدة، ثلاثية الأبعاد. سانتي وآخرون. 15 تطوير أسلوب كوكليا ديسيلولاريزينج الأولية، ودقة ويقدر حجم العديد من الهياكل cochlear عن طريق مع المعونة من الورقة الخفيفة الميكروسكوب23. مثل هذا العمل في وقت مبكر بمثابة أساس قوي لهندسة الأنسجة والخلية ثقافة التقنيات المعروضة هنا. ديسيلولاريزيد القوقعة يمكن بنجاح يملؤه الخلايا، ومثقف ثم لفترة طويلة من الزمن. ويمكن نظرياً الاستفادة كوكليا من مجموعة واسعة من الحيوانات في تركيبة مع مجموعة واسعة وكذلك أنواع الخلايا. هذه التركيبات تسمح التقنيات المعروضة هنا الاستفادة منها في العديد من التصاميم التجريبية المحتملة، مثل الأنسجة التطبيقات التي تدرس ظهارة الحسية التنمية14، المخدرات اختبار لوكلاء الأدوية الجديدة الهندسية 24، ونماذج التنمية لإصلاح cochlear25. ومع ذلك، على الرغم من انطباق واسع النطاق لهذه التقنيات فليست دون قيود.
أحد أوجه قصور الأسلوب الحالي نضح متغير استناداً إلى الفرد. وضع حامل للقوقعة، واستخدام مضخة الحقن بإجراء بيرفوسيونس قد زيادة دقة ونجاح العملية. بالإضافة إلى ذلك، تثبت نهائياً ديسيلولاريزيشن ناجحة يمكن يحتمل أن إنجازه من خلال عدة طرق. استخدمنا DAPI تلطيخ التي تم استخدامها لتحديد مقدار نويات الخلايا المتبقية، ولاحظنا لا وظيفة-ديسيلولاريزيشن الأنوية المتبقية. بالإضافة إلى ذلك، استخدام الحمض النووي معيار القياس الكمي فحوصات الكاشف، الصبغة الخضراء كشف كميات حلول للحمض النووي، والتعرف على بقايا الحمض النووي، التي قد تكون أكثر حساسية من DAPI بصريا لتحديد وجود شظايا صغيرة من النووية الأحماض في الأنسجة ديسيلولاريزيد26. بغض النظر عن التقنيات التي تستخدم للتحقق من صحة ديسيلولاريزيشن ناجحة، قد لا تكون ممكنة لإظهار ديسيلولاريزيشن كاملة من القوقعة الفردية قبل استخدام ذلك سقالة. ومع ذلك، وجدنا أن عملية ديسيلولاريزيشن لتكون ناجحة وقوية.
هي الخطوات الأكثر أهمية اثنين في البروتوكول الحالي على العزلة ومناولة كوكليا، ونضح من كوكليا. يجب إيلاء عناية كبيرة عند القوقعة معزولة في البداية، كما القوقعة حساسة وهشة. إذا تم تطبيق قوة كبيرة جداً أثناء التعامل مع القوقعة مع الملقط، يمكن تجزئة القوقعة. وبالتالي، من الضروري التعامل مع كل قوقعة الإذن بلطف قبل ديسيلولاريزيشن وديكالسيفيكيشن. ويعمل النظام الدهليزية، إذا تركت سليمة، كمؤشر كبير للاستيلاء على الإذن الداخلية المعقدة مع الملقط، وتوجيه القوقعة. وبالمثل، عندما بيرفوسينج القوقعة مع الخلايا، الضغط خلف نضح يجب لن يكون كبيرا جداً، خلاف الخلايا قد لا البقاء على قيد الحياة في التروية. كما ورد في البروتوكول الحالي، ربط الأنابيب إلى نهاية حقنه الأنسولين 1 مل يسمح لتسهيل التعامل للقوقعة مع جهة، وقدر أكبر من الدقة في بيرفوسينج الخلايا عن طريق القوقعة باليد الأخرى.
كخطوة تالية، سيكون من الطبيعي لتقييم علامات التنموية والوظيفية لتحديد إذا كان المحتوى cochlear هو الذي يحفز التمايز للخلايا الجذعية، وإذا كان ذلك، أي مكونات محددة من مكونات إدارة المحتوى في المؤسسة في القوقعة هي حمل تغييرات في الخلايا. بيرفوسينج أنواع مختلفة من الخلايا (مثلالخلايا الجذعية، نيوروبروجينيتورس، الليفية، إلخ) عن طريق القوقعة لمراقبة الخلية التمايز والسلوك سيكون آخر رائعة متابعة التحقيق. وبالإضافة إلى ذلك، الخلايا التي تم تعديلها وراثيا أو يتعرض لبروتوكول تمايز عامل النمو قد تقدم رؤى جديدة في كيفية cochlear ECM يدعم التنمية الحسية، وربما الدالة في جلسة الاستماع. وهكذا، البروتوكول الحالي هو خطوة أولى هامة في استخدام المحتوى cochlear لدراسة التنمية الحسية الإذن الداخلية والصيانة، وهي اليوم قد يؤدي إلى تطوير علاجات جديدة لاستعادة السمع.

القوقعة بنية معقدة دوامة موجودة في العظم الصدغي. وهو يتألف متاهة عظمى خارجي و متاهة membranous متحدة المركز، والداخلية1. متاهة ميمبرانوس يتكون من ثلاثة ممنوع السوائل: فيستيبولي سكالا، سكالا وسائط الإعلام، و حبل سكالا1. دور وسائط الإعلام سكالا ظهارة الحسية، التي تتألف من العديد من أنواع الخلايا، ولكن خلايا الشعر الحسية (المفوض السامي)، الذي ترانسدوسي الطاقة الميكانيكية في الموجات الصوتية للنبضات العصبية2، تتسم بأهمية خاصة. التعرض للصدمات الصوتية3،،من45،6من الدواء والمرض7،8والشيخوخة9 كل ما يمكن أن يؤدي وظيفة السمع البصر عن طريق الإعدام المفوض السامي. فقدان خلايا الشعر في الثدييات دائمة، على عكس HCs إنفلونزا الطيور، التي يمكن تجديدها بعد إصابة10.
مجموعة متنوعة من الجهود البحثية المعاصرة سعت إلى استعادة HCs المفقودة، على الرغم من اختلاف النهج التجريبية المحددة. التلاعب بالجينات في ظهارة الحسية وزرع الخلايا الجذعية التي ميزت خارج الجسم هي النهج السائد في الميدان، على الرغم من أن قد تم طرق الاستقراء التي تسعى إلى التفريق بين الخلايا الجذعية في cochlear أورجانويدس حاول11،،من1213. كل من هذين النهجين أما يعتمد مباشرة على الخلايا الجذعية، أو العظة التنموية المستخدمة من قبل الخلايا الجذعية؛ بيد أن المشتركة ثانية، ويحتمل أن تكون حاسمة، هو عنصر إدارة المحتوى المؤسسي للقوقعة نفسها14،15.
إدارة المحتوى في المؤسسة لا يوفر الدعم المادي للخلايا والأنسجة، والتي تشمل سطح لالتصاق الخلايا وانتشار، والبقاء على قيد الحياة، والهجرة، ولكن أيضا تلعب أدواراً حاسمة في تطوير HCs ودوامه العقدة15،16 ،17. وبطبيعة الحال يوفر إدارة المحتوى في المؤسسة التي تحدث إشارات الاستقرائية التي قد توجه تحديد النمط الظاهري الخلية و/أو خلية التصاق وانتشارها، وبقاء18. ونتيجة لذلك، استخدام القوقعة ديسيلولاريزيد في تركيبة مع هوجكس المستزرعة توفر فرصة فريدة لاستكشاف دور تجديد إدارة المحتوى في المؤسسة، والمفوض السامي. هوجكس هي نوع خلية متاحة بسهولة، وغير مثيرة للجدل المعزولة من حبل السرة البشرية التي تتصرف مثل الخلايا الجذعية الوسيطة19. وقد أظهرت هوجكس القدرة على التفريق بين أسفل الخلية الحسية الأنساب20،21. وهكذا، تفاصيل البروتوكول الحالي العزلة، وديسيلولاريزيشن، ونضح من كوكليا من جثث الماوس C57BL مع هوجكس للهندسة أنسجة الإذن الداخلية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Allegra X-14R Centrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>B08861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intramedic Semi-Rigid Tubing</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>427401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova 2000 Orbital Shaler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1190-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11370-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18155-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-mL Conical Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB087579B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-100 Insulin Syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-829-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-341-73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88-861-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-170-404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost PLUS Glass Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-170-404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear-Rite 3</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-046341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Forma Series II 3110 Water-Jacekted CO2 Incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-998-078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesenchymal Stem Cell Growth Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP T-75 Culture Flask</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>TP90076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP T-150 Culture Flask</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>TP90151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP T-300 Culture Flask</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>TP90301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Microscope</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>SMZ800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ts2R-FL Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>MFA51010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuAire Class II, Type A2 Biosafety Cabinet</td>
			<td>NuAire</td>
			<td>NU-425-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5368-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% SDS Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>436143-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a protocol for decellularizing mouse cochleae for inner ear tissue engineering

في الثدييات، وخلايا الشعر ميتشانوسينسوري التي تيسر الاستماع الافتقار إلى القدرة على التجدد، التي حدت من العلاجات لفقدان السمع. استراتيجيات الطب التجديدي الحالية تركز على زرع الخلايا الجذعية أو التلاعب بالجينات المحيطة بدعم الخلايا في الإذن الداخلية لتشجيع استبدال التالف من الخلايا الجذعية لتصحيح السمع. ومع ذلك، المصفوفة خارج الخلية (ECM) قد تلعب دوراً حيويا في حفز والحفاظ على وظيفة خلايا الشعر، ولم يجر التحقيق فيها جيدا. استخدام cochlear إدارة المحتوى في المؤسسة سقالة لزراعة الخلايا الجذعية البالغة قد يوفر رؤى فريدة من نوعها في كيفية تكوين والهندسة المعمارية للبيئة خارج الخلية الإيدز الخلايا في الحفاظ على وظيفة السمع. هنا نقدم طريقة لعزل وديسيلولاريزينج كوتشلياي من الفئران لاستخدامها بمثابة السقالات قبول perfused الخلايا الجذعية البالغة. في البروتوكول الحالي، كوتشلياي يتم عزل من الفئران euthanized، ديسيلولاريزيد، وديكالسيفيد. بعد ذلك، تم بعناية perfused جيلي الخلايا البشرية وارتون (هوجكس) التي كانت معزولة من الحبل السري في كل قوقعة الإذن. واستخدمت في كوتشلياي كالمفاعلات الحيوية، وتم استزراع الخلايا لمدة 30 يوما قبل أن يخضع لتحليل تجهيز. كوكليا ديسيلولاريزيد الاحتفاظ بهياكل خارج الخلية يمكن تحديدها، ولكن لم يكشف عن وجود خلايا أو ملاحظته شظايا من الحمض النووي. اجتاحت معظم الداخلية والخارجية للقوقعة الخلايا perfused إلى القوقعة ونمت دون وقوع أي حادث خلال مدة 30 يوما. وهكذا، يمكن استخدام الأسلوب الحالي لدراسة كيف cochlear التنمية الخلية يؤثر على المحتوى والسلوك.

Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering at JoVE.com

A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering

بروتوكول ديسيلولاريزينج كوكليا الماوس لهندسة الأنسجة الإذن الداخلية

والهدف من هذا البروتوكول إظهار وسيلة فعالة ديسيلولاريزي وديكالسيفي كوكليا الماوس للاستخدام السقالات لتطبيقات هندسة الأنسجة.

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current ...

a-protocol-for-decellularizing-mouse-cochleae-for-inner-ear-tissue

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.7K Views.  University of Kansas Medical Center. والهدف من هذا البروتوكول إظهار وسيلة فعالة ديسيلولاريزي وديكالسيفي كوكليا الماوس للاستخدام السقالات لتطبيقات هندسة الأنسجة.

Video: A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering

Fabrication of Biologically Derived Injectable Materials for Myocardial Tissue Engineering

This protocol provides methods for the preparation of an injectable extracellular matrix (ECM) gel for myocardial tissue engineering applications. Briefly, decellularized tissue is lyophilized, milled, enzymatically digested, and then brought to physiological pH. The lyophilization removes all water content from the tissue, resulting in dry ECM that can be ground into a fine powder with a small mill. After milling, the ECM powder is digested with pepsin to form an injectable matrix. After adjustment to pH 7.4, the liquid matrix material can be injected into the myocardium. Results of previous characterization assays have shown that matrix gels produced from decellularized pericardial and myocardial tissue retain native ECM components, including diverse proteins, peptides and glycosaminoglycans. Given the use of this material for tissue engineering, in vivo characterization is especially useful; here, a method for performing an intramural injection into the left ventricular (LV) free wall is presented as a means of analyzing the host response to the matrix gel in a small animal model. Access to the chest cavity is gained through the diaphragm and the injection is made slightly above the apex in the LV free wall. The biologically derived scaffold can be visualized by biotin-labeling before injection and then staining tissue sections with a horse radish peroxidase-conjugated neutravidin and visualizing via diaminobenzidine (DAB) staining. Analysis of the injection region can also be done with histological and immunohistochemical staining. In this way, the previously examined pericardial and myocardial matrix gels were shown to form fibrous, porous networks and promote vessel formation within the injection region.

Methods for preparing an injectable matrix gel from decellularized tissue and injecting it into rat myocardium in vivo are described.

تصنيع مواد حقن المشتقة بيولوجيا للهندسة الأنسجة عضلة القلب

This protocol provides methods for the preparation of an injectable extracellular matrix (ECM) gel for myocardial tissue engineering applications.  ...

Procedure for Lung Engineering

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths annually; chronic obstructive pulmonary disease is currently the fourth leading cause of death in the United States1. Contributing to this mortality is the fact that lungs do not generally repair or regenerate beyond the microscopic, cellular level. Therefore, lung tissue that is damaged by degeneration or infection, or lung tissue that is surgically resected is not functionally replaced in vivo. To explore whether lung tissue can be generated in vitro, we treated lungs from adult rats using a procedure that removes cellular components to produce an acellular lung extracellular matrix scaffold. This scaffold retains the hierarchical branching structures of airways and vasculature, as well as a largely intact basement membrane, which comprises collagen IV, laminin, and fibronectin. The scaffold is mounted in a bioreactor designed to mimic critical aspects of lung physiology, such as negative pressure ventilation and pulsatile vascular perfusion. By culturing pulmonary epithelium and vascular endothelium within the bioreactor-mounted scaffold, we are able to generate lung tissue that is phenotypically comparable to native lung tissue and that is able to participate in gas exchange for short time intervals (45-120 minutes). These results are encouraging, and suggest that repopulation of lung matrix is a viable strategy for lung regeneration. This possibility presents an opportunity not only to work toward increasing the supply of lung tissue for transplantation, but also to study respiratory cell and molecular biology in vitro for longer time periods and in a more accurate microenvironment than has previously been possible.

We have developed a decellularized lung extracellular matrix and novel biomimetic bioreactor that can be used to generate functional lung tissue. By seeding cells into the matrix and culturing in the bioreactor, we generate tissue that demonstrates effective gas exchange when transplanted in vivo for short periods of time.

الداخلي للهندسة الرئة

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and increasing obesity1. Currently, bypass surgery using autologous vessels, allografts, and synthetic grafts are known as a commonly used for arterial substitutes2. However, these grafts have limited applications when an inner diameter of arteries is less than 6 mm due to low availability, thrombotic complications, compliance mismatch, and late intimal hyperplasia3,4. To overcome these limitations, tissue engineering has been successfully applied as a promising alternative to develop small-diameter arterial constructs that are nonthrombogenic, robust, and compliant. Several previous studies have developed small-diameter arterial constructs with tri-lamellar structure, excellent mechanical properties and burst pressure comparable to native arteries5,6. While high tensile strength and burst pressure by increasing collagen production from a rigid material or cell sheet scaffold, these constructs still had low elastin production and compliance, which is a major problem to cause graft failure after implantation. Considering these issues, we hypothesized that an elastometric biomaterial combined with mechanical conditioning would provide elasticity and conduct mechanical signals more efficiently to vascular cells, which increase extracellular matrix production and support cellular orientation.
The objective of this report is to introduce a fabrication technique of porous tubular scaffolds and a dynamic mechanical conditioning for applying them to arterial tissue engineering. We used a biodegradable elastomer, poly (glycerol sebacate) (PGS)7 for fabricating porous tubular scaffolds from the salt fusion method. Adult primary baboon smooth muscle cells (SMCs) were seeded on the lumen of scaffolds, which cultured in our designed pulsatile flow bioreactor for 3 weeks. PGS scaffolds had consistent thickness and randomly distributed macro- and micro-pores. Mechanical conditioning from pulsatile flow bioreactor supported SMC orientation and enhanced ECM production in scaffolds. These results suggest that elastomeric scaffolds and mechanical conditioning of bioreactor culture may be a promising method for arterial tissue engineering.

Elastomeric PGS scaffolds with vascular smooth muscle cells cultured in a pulsatile flow bioreactor may lead to promising small-diameter arterial constructs with native ECM production in a relatively short culture period.

PGS السقالات المرنة في هندسة الأنسجة الشرياني

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and ...

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying cellular responses under various culture conditions in vitro. The three dimensional environment more closely mimics what the cells observe in vivo due to the application of mechanical and chemical stimuli in all dimensions 1. Three-dimensional hydrogels can either be made from synthetic polymers such as PEG-DA 2 and PLGA 3 or a number of naturally occurring proteins such as collagen 4, hyaluronic acid 5 or fibrin 6,7. Hydrogels created from fibrin, a naturally occurring blood clotting protein, can polymerize to form a mesh that is part of the body's natural wound healing processes 8. Fibrin is cell-degradable and potentially autologous 9, making it an ideal temporary scaffold for tissue engineering.
Here we describe in detail the isolation of neonatal cardiomyocytes from three day old rat pups and the preparation of the cells for encapsulation in fibrin hydrogel constructs for tissue engineering. Neonatal myocytes are a common cell source used for in vitro studies in cardiac tissue formation and engineering 4. Fibrin gel is created by mixing fibrinogen with the enzyme thrombin. Thrombin cleaves fibrinopeptides FpA and FpB from fibrinogen, revealing binding sites that interact with other monomers 10. These interactions cause the monomers to self-assemble into fibers that form the hydrogel mesh. Because the timing of this enzymatic reaction can be adjusted by altering the ratio of thrombin to fibrinogen, or the ratio of calcium to thrombin, one can injection mold constructs with a number of different geometries 11,12. Further we can generate alignment of the resulting tissue by how we constrain the gel during culture 13.
After culturing the engineered cardiac tissue constructs for two weeks under static conditions, the cardiac cells have begun to remodel the construct and can generate a contraction force under electrical pacing conditions 6. As part of this protocol, we also describe methods for analyzing the tissue engineered myocardium after the culture period including functional analysis of the active force generated by the cardiac muscle construct upon electrical stimulation, as well as methods for determining final cell viability (Live-Dead assay) and immunohistological staining to examine the expression and morphology of typical proteins important for contraction (Myosin Heavy Chain or MHC) and cellular coupling (Connexin 43 or Cx43) between myocytes.

We describe the isolation of neonatal cardiomyocytes and the preparation of the cells for encapsulation in fibrin hydrogel constructs for tissue engineering. We describe methods for analyzing the tissue engineered myocardium after the culture period including active force generated upon electrical stimulation and cell viability and immunohistological staining.

تغليف الخلايا العضلية في هيدروجيل الفايبرين للهندسة الأنسجة القلبية

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do not have suitable autologous donor vessels due to disease progression or previous harvest. The aim of vascular tissue engineering is to develop a suitable alternative source for these bypass grafts. In addition, engineered vascular tissue may prove valuable as living vascular models to study cardiovascular diseases. Several promising approaches to engineering blood vessels have been explored, with many recent studies focusing on development and analysis of cell-based methods.2-5 Herein, we present a method to rapidly self-assemble cells into 3D tissue rings that can be used in vitro to model vascular tissues.
To do this, suspensions of smooth muscle cells are seeded into round-bottomed annular agarose wells. The non-adhesive properties of the agarose allow the cells to settle, aggregate and contract around a post at the center of the well to form a cohesive tissue ring.6,7 These rings can be cultured for several days prior to harvesting for mechanical, physiological, biochemical, or histological analysis. We have shown that these cell-derived tissue rings yield at 100-500 kPa ultimate tensile strength8 which exceeds the value reported for other tissue engineered vascular constructs cultured for similar durations (&lt;30 kPa).9,10 Our results demonstrate that robust cell-derived vascular tissue ring generation can be achieved within a short time period, and offers the opportunity for direct and quantitative assessment of the contributions of cells and cell-derived matrix (CDM) to vascular tissue structure and function.

This article outlines a versatile method to create cell-derived tissue rings by cellular self-assembly. Smooth muscle cells seeded into ring-shaped agarose wells aggregate and contract to form robust three-dimensional (3D) tissues within 7 days. Millimeter-scale tissue rings are conducive to mechanical testing and serve as building blocks for tissue assembly.

توجه الخلوي الذاتي الجمعية الى افتعال خواتم نسيج الخلايا المستمدة من النشاط الحيوي لتحليل وهندسة الأنسجة

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

Postproduction Processing of Electrospun Fibres for Tissue Engineering

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo undergo biaxial distension to varying extents such as skin, bladder, pelvic floor and even the hard palate as children grow. In producing scaffolds for these purposes there is a need to develop scaffolds of appropriate biomechanical properties (whether achieved without or with cells) and which are sterile for clinical use. The focus of this paper is not how to establish basic electrospinning parameters (as there is extensive literature on electrospinning) but on how to modify spun scaffolds post production to make them fit for tissue engineering purposes - here thickness, mechanical properties and sterilisation (required for clinical use) are considered and we also describe how cells can be cultured on scaffolds and subjected to biaxial strain to condition them for specific applications.
Electrospinning tends to produce thin sheets; as the electrospinning collector becomes coated with insulating fibres it becomes a poor conductor such that fibres no longer deposit on it. Hence we describe approaches to produce thicker structures by heat or vapour annealing increasing the strength of scaffolds but not necessarily the elasticity. Sequential spinning of scaffolds of different polymers to achieve complex scaffolds is also described. Sterilisation methodologies can adversely affect strength and elasticity of scaffolds. We compare three methods for their effects on the biomechanical properties on electrospun scaffolds of poly lactic-co-glycolic acid (PLGA).
Imaging of cells on scaffolds and assessment of production of extracellular matrix (ECM) proteins by cells on scaffolds is described. Culturing cells on scaffolds in vitro can improve scaffold strength and elasticity but the tissue engineering literature shows that cells often fail to produce appropriate ECM when cultured under static conditions. There are few commercial systems available that allow one to culture cells on scaffolds under dynamic conditioning regimes - one example is the Bose Electroforce 3100 which can be used to exert a conditioning programme on cells in scaffolds held using mechanical grips within a media filled chamber.4 An approach to a budget cell culture bioreactor for controlled distortion in 2 dimensions is described. We show that cells can be induced to produce elastin under these conditions. Finally assessment of the biomechanical properties of processed scaffolds cultured with or without cells is described.

Electrospun scaffolds can be processed post production for tissue engineering applications. Here we describe methods for spinning complex scaffolds (by consecutive spinning), for making thicker scaffolds (by multi-layering using heat or vapour annealing), for achieving sterility (aseptic production or sterilisation post production) and for achieving appropriate biomechanical properties.

المعالجة بعد الإنتاج من الألياف Electrospun للهندسة الأنسجة

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce  scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical discoveries with the aims of developing functional tissues for cardiac regeneration as well as in vitro screening assays. However, the ability to create high-fidelity models of heart tissue has proven difficult. The heart&#8217;s extracellular matrix (ECM) is a complex structure consisting of both biochemical and biomechanical signals ranging from the micro- to the nanometer scale2. Local mechanical loading conditions and cell-ECM interactions have recently been recognized as vital components in cardiac tissue engineering3-5.
A large portion of the cardiac ECM is composed of aligned collagen fibers with nano-scale diameters that significantly influences tissue architecture and electromechanical coupling2. Unfortunately, few methods have been able to mimic the organization of ECM fibers down to the nanometer scale. Recent advancements in nanofabrication techniques, however, have enabled the design and fabrication of scalable scaffolds that mimic the in vivo structural and substrate stiffness cues of the ECM in the heart6-9.
Here we present the development of two reproducible, cost-effective, and scalable nanopatterning processes for the functional alignment of cardiac cells using the biocompatible polymer poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)8 and a polyurethane (PU) based polymer. These anisotropically nanofabricated substrata (ANFS) mimic the underlying ECM of well-organized, aligned tissues and can be used to investigate the role of nanotopography on cell morphology and function10-14.
Using a nanopatterned (NP) silicon master as a template, a polyurethane acrylate (PUA) mold is fabricated. This PUA mold is then used to pattern the PU or PLGA hydrogel via UV-assisted or solvent-mediated capillary force lithography (CFL), respectively15,16. Briefly, PU or PLGA pre-polymer is drop dispensed onto a glass coverslip and the PUA mold is placed on top. For UV-assisted CFL, the PU is then exposed to UV radiation (&#955; = 250-400 nm) for curing. For solvent-mediated CFL, the PLGA is embossed using heat (120 &#176;C) and pressure (100 kPa). After curing, the PUA mold is peeled off, leaving behind an ANFS for cell culture. Primary cells, such as neonatal rat ventricular myocytes, as well as human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, can be maintained on the ANFS2.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

الشعرية قوة الطباعة الحجرية لهندسة الأنسجة القلبية

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Protocol for Relative Hydrodynamic Assessment of Tri-leaflet Polymer Valves

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of tri-leaflet polymer valve prostheses. However, identification of a protocol for initial assessment of polymer valve hydrodynamic functionality is paramount during the early stages of the design process. Traditional in vitro pulse duplicator systems are not configured to accommodate flexible tri-leaflet materials; in addition, assessment of polymer valve functionality needs to be made in a relative context to native and prosthetic heart valves under identical test conditions so that variability in measurements from different instruments can be avoided. Accordingly, we conducted hydrodynamic assessment of i) native (n = 4, mean diameter, D = 20 mm), ii) bi-leaflet mechanical (n= 2, D = 23 mm) and iii) polymer valves (n = 5, D = 22 mm) via the use of a commercially available pulse duplicator system (ViVitro Labs Inc, Victoria, BC) that was modified to accommodate tri-leaflet valve geometries. Tri-leaflet silicone valves developed at the University of Florida comprised the polymer valve group. A mixture in the ratio of 35:65 glycerin to water was used to mimic blood physical properties. Instantaneous flow rate was measured at the interface of the left ventricle and aortic units while pressure was recorded at the ventricular and aortic positions. Bi-leaflet and native valve data from the literature was used to validate flow and pressure readings. The following hydrodynamic metrics were reported: forward flow pressure drop, aortic root mean square forward flow rate, aortic closing, leakage&#160;and regurgitant volume, transaortic closing, leakage, and total energy losses. Representative results indicated that hydrodynamic metrics from the three valve groups could be successfully obtained by incorporating a custom-built assembly into a commercially available pulse duplicator system and subsequently, objectively compared to provide insights on functional aspects of polymer valve design.

There has been renewed interest in developing polymer valves. Here, the objectives are to demonstrate the feasibility of modifying a commercial pulse duplicator to accommodate tri-leaflet geometries and to define a protocol to present polymer valve hydrodynamic data in comparison to native and prosthetic valve data collected under near-identical conditions.

بروتوكول لتقييم هيدرودينامي النسبية للثلاثي النشرة بوليمر صمامات

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of ...

Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

We designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for transplantation. While the device primarily functions as a bioreactor that mimics the native mechanical strains, it is also outfitted with a load cell for providing force feedback or mechanical testing of the constructs. The device subjects engineered cartilage constructs to biaxial mechanical loading with great precision of loading dose (amplitude and frequency) and is compact enough to fit inside a standard tissue culture incubator. It loads samples directly in a tissue culture plate, and multiple plate sizes are compatible with the system. The device has been designed using components manufactured for precision-guided laser applications. Bi-axial loading is accomplished by two orthogonal stages. The stages have a 50 mm travel range and are driven independently by stepper motor actuators, controlled by a closed-loop stepper motor driver that features micro-stepping capabilities, enabling step sizes of less than 50 nm. A polysulfone loading platen is coupled to the bi-axial moving platform. Movements of the stages are controlled by Thor-labs Advanced Positioning Technology (APT) software. The stepper motor driver is used with the software to adjust load parameters of frequency and amplitude of both shear and compression independently and simultaneously. Positional feedback is provided by linear optical encoders that have a bidirectional repeatability of 0.1 &mu;m and a resolution of 20 nm, translating to a positional accuracy of less than 3 &mu;m over the full 50 mm of travel. These encoders provide the necessary position feedback to the drive electronics to ensure true nanopositioning capabilities. In order to provide the force feedback to detect contact and evaluate loading responses, a precision miniature load cell is positioned between the loading platen and the moving platform. The load cell has high accuracies of 0.15% to 0.25% full scale.

We designed a novel mechanical loading bioreactor that can apply uniaxial or biaxial mechanical strain to a cartilage biocomposite prior to transplantation into an articular cartilage defect.

تصميم مفاعل حيوي ذو محورين الميكانيكية جار للهندسة الأنسجة

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

الهندسة 3D Cellularized الهلام الكولاجين لتجديد الأنسجة الوعائية

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...