ونود أن نشكر أعضاء المختبر والسمك الموظفين الإداريين منشأة Pelegri، الذين كان لهم دور فعال في تسهيل هذا المشروع. وقدم الدعم لهذا المشروع من قبل المعاهد الوطنية للصحة R56 GM065303 وNIH 2 T32 GM007133 إلى العلو، NIH 5 F31 GM108449-02 وNIH 2 T32 GM007133 إلى CCE، والمعاهد الوطنية للصحة RO1 GM065303 إلى FP

تم التعامل مع جميع الزرد بما يتفق تماما مع الممارسة الحيوانية جيدة، على النحو المحدد من قبل هيئات الرفق بالحيوان وطنية و / أو المحلية ذات الصلة، وتمت الموافقة على جميع الأعمال الحيوان من قبل اللجنة المختصة (جامعة ويسكونسن ماديسون ضمان عدد A3368-01). واستمرت الحيوانات تحت ظروف قياسية في 26.5 درجة مئوية. 1. ما قبل مختارة من الإناث ملاحظة: البويضات في الإناث البالغات تمتد عادة مجموعة من مراحل النمو، من المرحلة الأولى لV (الشكل 2). تطهير الإناث من البويضات الموجودة مسبقا من خلال التزاوج الطبيعي ناجحة يزيد تزامن انطلاق البويضة، كما تظهر البويضات النامية حديثا كما فوج 3، 14. في غضون نحو 8 أيام بعد تطهير معظم البويضات في المرحلة الرابعة في وقت مبكر، وهو الأمثل لبدء في المختبر النضج. هذا التزامن يزيد من العائد من ثا البويضاتتي يمكن أن تذهب من خلال عملية كاملة في المختبر النضج، وتسهيل التلاعب التجريبية. يرجى مراجعة الأوصاف السابقة 13 للحصول على تفاصيل حول إعداد الأسماك في التزاوج تقرن وعلى تكوين أسماك المياه (هنا، 14 غراما من الملح البحري و 150 غرام من NaHCO 3 في 1000 لتر من الماء التناضح العكسي، ودرجة الحموضة 6،5-8،5 (المدى فضل: 6.8 -7،5) والتوصيل من 180-360 ميكرو ثانية). رؤية العلامة التجارية وآخرون. 13 وصفات إضافية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثمانية إلى عشرة أيام قبل في المختبر التلاعب الثقافة، واستخدام شبكة السمك لنقل رجل واحد وامرأة واحدة الأسماك من سلالة المطلوب إلى خزان التزاوج. الزوج مجموعات متعددة. تركها في ليلة وضحاها خزان التزاوج. السماح لهم للتزاوج خلال المساء وخلال فترة ما بعد الظهر من اليوم التالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام شبكة السمك لفصل الإناث التي تسفر عن البيض خلال التزاوج ووضعها في خزان منفصل. إطعام هؤلاء النساء مرتين يوميا مع خليط الغذاء containiنانوغرام حوالي مبلغ مساو من الأرتيميا ورقائق الأسماك. يجب أن يكون مقدار ما يكفي من الغذاء لتوفير ما يقرب من 20 دقيقة، ولكن ليس أكثر من ذلك، من الساعة التغذية. </li></ol> 2. إعداد نضوج متوسط ملاحظة: إعداد المتوسطة النضج يوم في المختبر نضوج التجربة، في حدود 1 ساعة لإزالة البويضات من الإناث (انظر القسم 3). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 20 مل من المتوسط ​​ليبوفيتش L-15 مع L-الجلوتامين، ودرجة الحموضة 7.0 إلى أنبوب مخروطي 50 مل تحت ظروف معقمة. وصول بها إلى درجة الحموضة 9.0 مع 10 N هيدروكسيد الصوديوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 9 مل من المتوسط ​​L-15 ليبوفيتش، ودرجة الحموضة 9.0 إلى 2 منفصلة أنابيب مخروطية 50 مل. التسمية 1 أنبوب &quot;+ DHP&quot; والآخر &quot;-DHP&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في أنبوب + DHP، إضافة 10 ميكرولتر من 17α-20β-dihydroxy-4 pregnen-3-واحد (DHP)، 490 ميكرولتر من درهم 2 O، و 500 ميكرولتر من 10٪ الزلال المصل البقري (BSA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في أنبوب -DHP، إضافة 100 ميكرولتر من 10 ملغ / مل الجنتاميسين، 40081؛ L من درهم 2 O، و 500 ميكرولتر من 10٪ BSA. </li></ol> 3. تشريح البويضات وبدء في المختبر الثقافة ملاحظة: ويتم في المختبر تجربة الثقافة خارجا مع الإناث محددة مسبقا بعد 8-10 أيام من الإفراج البيض من خلال التزاوج الطبيعي. استخدام المتوسطة النضج وجهت نفس اليوم (انظر القسم 2). البويضات الناضجة بشكل مناسب إذا بدأت تشريح قرب نهاية دورة نهاري الأسماك (تحدد في المختبر عن طريق الإضاءة الصناعية المحددة مسبقا في منشأة الأسماك) 13، وربما العمليات التي تحدث من خلال التزاوج الطبيعي محاكاة. وهذا يعني أن معظم الخطوات في البروتوكول يجب أن تتم في المساء إذا ويعيش السمك في منشأة مع دورة ضوء معيار (على سبيل المثال، بدءا خطوة 3.2 في 06:00 في منشأة مع فترة الخفيفة 8:00 حتي 10:00)، على الرغم من أن العمل بدوام الفترات أخرى ممكنة مع دورة الضوء بشكل مناسب الوقت تحولت. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل الأسهم تريكين 0.2٪ في DH 2 O، مخزنة لدرجة الحموضة 7.0 مع 1 M تريس، ودرجة الحموضة 9.0، والحفاظ على هذا الحل في 4 درجات مئوية. وهذا يمكن أن يكون مستعدا في وقت مبكر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء التجربة 0-4 ساعة قبل نهاية دورة الخفيفة اليومية في المرفق. في كوب 250 مل، إضافة 20 مل من 0.2٪ محلول المخزون تريكين، ودرجة الحموضة 7.0 إلى 80 مل من الماء الأسماك والمزيج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الإناث محددة مسبقا إلى حل تريكين والموت ببطء لهم عن طريق التعرض المفرط. ترك الإناث في حل تريكين لمدة 15 دقيقة بعد توقف حركة الخيشومية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملعقة، وجمع الأسماك الموت الرحيم من الحل تريكين وشطف لهم لفترة وجيزة في الماء الأسماك. ضع السمك على منشفة ورقية لامتصاص الماء الزائد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام شفرة حلاقة نظيفة لقطع رأس السمكة الموت الرحيم على مستوى الزعنفة الصدرية. باستخدام مقص تشريح، وجعل شق طولي على الجانب البطني من الأسماك، وتمتد من نهاية الأمامي لمنطقة الشرج. </li><li&gt; ضع السمك في طبق بتري تحت المجهر تشريح مع الضوء الساقط. باستخدام زوج من ملقط تشريح، ونقل أجزاء المبيض إلى طبق الثقافة ملم 35 × 10 تحتوي على 4 مل من يبوفيتش L-15 متوسطة + DHP. ملاحظة: سوف المبايض، والتي تحتوي على البويضات النامية، تبدو وكأنها هياكل مبهمة وملتف داخل تجويف الجسم الداخلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط تشريح، فصل بلطف البويضات من الجماهير مسامي. ترتيب مرحلة مبكرة IV البويضات (الشكل 2B، قبل انهيار GV، في حجم شبه القصوى وتتميز الظلام، السيتوبلازم مبهمة وGV اضحة وضوح الشمس تقع غير متماثلة داخل البويضة). تجاهل البويضات في مراحل سابقة (الشكل 2A)، وشفافة، ناضجة البيض مرحلة V (مماثلة لتلك التي في الشكل 2C ولكن موجودة في المبيض قبل العلاج DHP). ويتم اختيار البويضات لنضج في المرحلة الرابعة في وقت مبكر، مرحلة مبكرة أن يؤدي ناضجة، مرحلة V oocyt: ملاحظةوفاق بعد الظروف ثقافة في المختبر (الشكل 2C وD) 3. لأن البويضات المرحلة الرابعة تنتج بنشاط المنتجات، والتلاعب في هذه المرحلة يسمح للتعبير عن المنتجات الخارجية من خلال حقن RNA أو للحد من وظيفة الجين عبر المنظمات الأعضاء عرضه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الماصة الزجاج باستور لنقل أوائل البويضات المرحلة الرابعة إلى الثانية 35 × 10 مم طبق ثقافة بلاستيكية تحتوي على 4 مل من يبوفيتش L-15 متوسطة + DHP. نقل كميات ضئيلة من -DHP المتوسطة إلى الطبق الذي يحتوي على حل + DHP. </li></ol> 4. إبر دقيقة جدا سيت ملاحظة: عزل المرحلة الرابعة البويضات تمر في نضوج في المختبر يمكن microinjected لتقديم الكواشف للتلاعب وظيفي أو تعبير البروتين الموسومة. وMicroinjection من الكواشف، مثل مرنا والمنظمات الأعضاء (انظر القسم 4)، ويتم عادة خارجا عندما البويضات تشهد في المختبر matuالتموينية في + DHP المتوسطة، قبل defolliculation. إذا رغبت في ذلك، من أجل إتاحة المزيد من الوقت لإجراء التلاعب قبل نضوج البويضة، ويمكن أيضا أن يتم الحقن في -DHP المتوسطة، وذلك قبل النضج، لمدة 2 ساعة على الأقل. يمكنهم بعد ذلك يتم تحويلها إلى + DHP المتوسطة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد من mRNAs استخدام عدة التعبير القياسية. الاحتفاظ بها في -80 ° C باعتباره 100-500 خريج الأسهم / ميكرولتر للحقن بتركيز نهائي من 50-500 غ / ميكرولتر (200 غ / ميكرولتر مستحسن) في المياه RNA الصف. إعداد المنظمات الأعضاء في تركيز 4 نانوغرام / ميكرولتر في الماء وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. ضخها في تركيزات النهائي من 2 نانوغرام / ميكرولتر (أو كما تحدد تجريبيا). تتم الحقن عادة في + DHP المتوسطة قبل defolliculation (انظر الملاحظة في القسم 5): ملاحظة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا حقن مرنا، مباشرة قبل الحقن، وتمييع مرنا باستخدام RNA الصف المياه التناضح العكسي و 0.2 M بوكل لتحقيق الحل النهائي من 0.1 M بوكل.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا حقن المنظمات الأعضاء، مباشرة قبل الحقن، ويخفف من المنظمات الأعضاء إلى التركيز المطلوب باستخدام المياه التناضح العكسي و 0.2 M بوكل لتحقيق الحل النهائي من 0.1 M بوكل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد يدويا البويضات مع ملقط غرامة وحقن ما يقرب من 1 NL إلى البرية من نوع البويضات المرحلة الرابعة باستخدام إبرة مصنوعة مع سحب الزجاج الشعرية ماصة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الإبر الزجاج عن طريق سحب ساخنة أنابيب زجاجية الشعرية، وتحميل الحل ليتم حقنه، وكسر رأس الإبرة مع ملقط، كما هو موضح سابقا في بروتوكولات لحقن القياسية في الأجنة المبكرة الزرد 15. ملاحظة: من المفيد أن الإبرة لديها تفتق تدريجي وليس مفاجئ واحد. وهذا يسمح بمزيد من المرونة من حيث مكان وجود كسر في رأس الإبرة وأيضا يساعد على منع تلف الجنين حقن. باستخدام نفس الإبرة والحل بالنسبة للحقن الجنين، وضبط حجم حقن من قبل تحديدضبط ضغط microinjector التي تنتج حجم المطلوب. يمكن تحديد هذه الإعدادات وهمية عن طريق الحقن في قطرة من الزيت المعدني على شريحة المجهر مرحلة المعايرة (0.01 مم) وضبط الإعدادات microinjector للحصول على القطر المطلوب في البلعة من حل حقن، كما هو موضح سابقا (15). </li></ol></li></ol> 5. سيت النضج وDefolliculation ملاحظة: أثناء نضوج البويضة، فإن البويضات تصبح شفافة تدريجيا، والذي يسمح لتقييم ظروف التربية الناجحة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مواصلة احتضان غير ناضجة (وإذا المناسبة، حقن) البويضات في + DHP المتوسطة في 26.5 درجة مئوية، وفحص دوري (كل 30 دقيقة) للتأكد من أن البويضات لا تزال سليمة وتشهد نضوج الصحيح قبل أن تصبح شفافة تدريجيا (انظر الشكل 2C) . <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة أي البويضات الناشر مع ماصة باستور والتخلص منهافي كوب النفايات مختبر للحفاظ على جودة متوسطة. تبادل مستنبت مع ما يقرب من نصف حجم من طازجة + DHP المتوسطة للحفاظ على حل واضح، وهذا يتوقف على مقدار تحلل البويضة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للفي المختبر النضج والمضي قدما حتى أغلبية البويضات تصبح شفافة ولها GV التي لم تعد واضحة (حوالي 2 ساعة في العلاج DHP، انظر الشكل 2C بالمقارنة مع D). عرضها تحت المجهر تشريح مع البصريات الضوئية المرسلة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة غشاء مسامي الأبعد من كل بويضة ناضجة. استخدام ملقط خارج غرامة لجعل المسيل للدموع في غشاء مسامي في المنطقة مع زيادة المسافة بين البويضة والغشاء. تقشر جزء من الغشاء ولفة البويضة من الغشاء أثناء الضغط باستمرار على جزء مقشر. ملاحظة: سوف الغشاء المشيمي الأساسي يبقى عادة في ارتباط وثيق مع البيض خلال هذه العملية؛ بعد عمل البيضivation، فإنه يتمدد لتشكيل طبقة واقية للجنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل البويضات defolliculated في حجم الحد الأدنى من المتوسط ​​(عادة، ونقل حوالي 5-10 البويضات الناضجة في أقل من 20 ميكرولتر) إلى طبق بتري مع بضع قطرات من الثقافة المتوسطة (+ DHP)، والشروع في الإخصاب. </li></ol> 6. تسميد في المختبر مثقف البويضات ملاحظة: الحل الحيوانات المنوية على الجليد، الذي أعد أدناه، سوف تحافظ على قوتها لمدة 2 ساعة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل الحيوانات المنوية قرب نهاية الخطوة بويضة النضج وقبل defolliculation باستخدام الخصيتين من خمسة ذكور في 500 ميكرولتر من محلول هانكس &quot;، كما هو موضح سابقا 16 و 17. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10-50 ميكرولتر من محلول الحيوانات المنوية إلى البويضات defolliculated في مستنبت + DHP. انتظر 10 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة، إضافة بضع قطرات من الجنينية (E3) متوسطة إلى البويضات. انتظر 1 دقيقة ثم إغراق ررأكل مع E3 المتوسطة. ملاحظة: تكوين E3 المتوسطة على النحو التالي: 5 مم كلوريد الصوديوم، 0.17 ملي بوكل، 0.33 ملي CaCl 2، 0.33 ملي MgSO 4، و1-5٪ الميثيلين الأزرق 13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 5.3، 6.2، و 6.3 للحصول على عدد أكبر من الأجنة المخصبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للأجنة مخصبة لتطوير. استخدام مجهر تشريح مع عدسات الخفيفة التي تنتقل عن طريق لمراقبة تطور عبر مراحل الانقسام لضمان إخصاب ناجحة، كما هو موضح سابقا للإخصاب 17 و 18 التدريج. </li></ol>

<ol>
	<li>Lindeman, R., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+maternal-effect+genes:+insights+into+fertilization,+early+cleavage+divisions,+and+germ+cell+determinant+localization+from+studies+in+the+zebrafish.">Vertebrate maternal-effect genes: insights into fertilization, early cleavage divisions, and germ cell determinant localization from studies in the zebrafish.</a> Mol Rep Dev. 77 (4), 299-313 (2010).</li><li>Abrams, E. W., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+zebrafish+development:+it's+in+the+maternal+genes.">Early zebrafish development: it's in the maternal genes.</a> Curr Opin Genet Dev. 19 (4), 396-403 (2009).</li><li>Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+oocyte+culture-based+manipulation+of+zebrafish+maternal+genes.">In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes.</a> Dev Dyn. 242 (1), 44-52 (2013).</li><li>Selman, K., Petrino, T. R., Wallace, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+conditions+for+oocyte+maturation+in+the+zebrafish,+Brachydanio+rerio.">Experimental conditions for oocyte maturation in the zebrafish, Brachydanio rerio.</a> J Exp Zool. 269 (6), 538-550 (1994).</li><li>Fauvel, C., Omnes, M. H., Suquet, M., Normant, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+assessment+of+overripening+in+turbot+(Scophtalmus+maximus)+by+a+simple+pH+measurement.">Reliable assessment of overripening in turbot (Scophtalmus maximus) by a simple pH measurement.</a> Aquaculture. 117 (1-2), 107-113 (1993).</li><li>Lahnsteiner, F., Weismann, T., Patzner, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+of+the+ovarian+fluid+in+4+salmonid+speices:+Onchorhynchus+mykiss,+Salmo+trutta+flacustris,+Salvelinus+alpinus+and+Husho+hucho.">Composition of the ovarian fluid in 4 salmonid speices: Onchorhynchus mykiss, Salmo trutta flacustris, Salvelinus alpinus and Husho hucho.</a> Reprod Nutr Dev. 35 (5), 465-474 (1995).</li><li>Pati&#241;o, R., Bolamba, D., Thomas, P., Kumakura, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+external+pH+on+hormonally+regulated+ovarian+follicle+maturation+and+ovulation+in+Atlantic+croaker.">Effects of external pH on hormonally regulated ovarian follicle maturation and ovulation in Atlantic croaker.</a> Gen Comp Endocrinol. 141 (2), 126-134 (2005).</li><li>Seki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+reliable+in+vitro+maturation+system+for+zebrafish+oocytes.">Development of a reliable in vitro maturation system for zebrafish oocytes.</a> Reproduction. 135 (3), 285-292 (2008).</li><li>Selman, K., Wallace, R. A., Sarka, A., Qi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+oocyte+development+in+the+zebrafish,+Brachydanio+rerio.">Stages of oocyte development in the zebrafish, Brachydanio rerio.</a> J Morphol. 218 (2), 203-224 (1993).</li><li>Clelland, E., Peng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocrine/paracrine+control+of+zebrafish+ovarian+development.">Endocrine/paracrine control of zebrafish ovarian development.</a> Mol Cell Endocrinol. 312 (1-2), 42-52 (2009).</li><li>Kane, D. A., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+midblastula+transition.">The zebrafish midblastula transition.</a> Development. 119 (2), 447-456 (1993).</li><li>Kanagaraj, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Souffle/Spastizin+controls+secretory+vesicle+maturation+during+zebrafish+oogenesis.">Souffle/Spastizin controls secretory vesicle maturation during zebrafish oogenesis.</a> PLoS Genet. 10 (6), e1004449 (2014).</li><li>Brand, M., Granato, M., N&#252;sslein-Volhard, C., N&#252;sslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Keeping and raising zebrafish,Zebrafish - A Practical Approach. , 7-37 (2002).</li><li>Connoly, M. H., Dutkosky, R. M., Heah, T. P., Sayler, G. S., Henry, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+dynamics+of+oocyte+growth+and+vitellogenin+gene+expression+in+zebrafish+(Danio+rerio).">Temporal dynamics of oocyte growth and vitellogenin gene expression in zebrafish (Danio rerio).</a> Zebrafish. 11 (2), 107-114 (2014).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. (25), e1115 (2009).</li><li>Pelegri, F., Mullins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+for+mutations+affecting+adult+traits+and+parental-effect+genes.">Genetic screens for mutations affecting adult traits and parental-effect genes.</a> Meth Cell Biol. 104, 83-120 (2011).</li><li>Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ploidy+manipulation+of+zebrafish+embryos+with+Heat+Shock+2+treatment.">Ploidy manipulation of zebrafish embryos with Heat Shock 2 treatment.</a> J Vis Exp. , (2016).</li><li>Kimmel, C., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullman, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+in+the+zebrafish.">Stages of embryonic development in the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Eisen, J. S., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+morpholino+experiments:+don't+stop+making+antisense.">Controlling morpholino experiments: don't stop making antisense.</a> Development. 135 (10), 1735-1743 (2008).</li><li>Schulte-Merker, S., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Out+with+the+old,+in+with+the+new:+reassessing+morpholino+knockdowns+in+light+of+genome+editing+technology.">Out with the old, in with the new: reassessing morpholino knockdowns in light of genome editing technology.</a> Development. 141 (16), 3103-3104 (2014).</li><li>Dekens, M. P. S., Santoriello, C., Vallone, D., Frassi, G., Whitmore, D., Foulkes, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+regulates+the+cell+cycle+in+zebrafish.">Light regulates the cell cycle in zebrafish.</a> Curr Biol. 13 (23), 2051-2057 (2003).</li><li>Sakai, N., Burgess, S., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+in+vitro+fertilization+of+zebrafish+eggs+in+Hank's+saline+containing+bovine+serum+albumin.">Delayed in vitro fertilization of zebrafish eggs in Hank's saline containing bovine serum albumin.</a> Mol Mar Biotechnol. 6 (2), 84-87 (1997).</li><li>Pelegri, F., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+for+mutations+affecting+adult+traits+and+parental-effect+genes.">Genetic screens for mutations affecting adult traits and parental-effect genes.</a> Meth Cell Biol. 135, (2016).</li><li>Lindeman, R. E., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+products+of+futile+cycle/lrmp+promote+centrosome-nucleus+attachment+in+the+zebrafish+zygote.">Localized products of futile cycle/lrmp promote centrosome-nucleus attachment in the zebrafish zygote.</a> Curr Biol. 22 (10), 843-851 (2012).</li><li>Nair, S., Marlow, F., Abrams, E., Kapp, L., Mullins, M., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromosomal+passenger+protein+Birc5b+organizes+microfilaments+and+germ+plasm+in+the+zebrafish+embryo.">The chromosomal passenger protein Birc5b organizes microfilaments and germ plasm in the zebrafish embryo.</a> PLoS Genetics. 9 (4), e1003448 (2013).</li><li>Eno, C., Solanki, B., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=aura+(mid1ip1l)+regulates+the+cytoskeleton+at+the+zebrafish+egg-to-embryo+transition.">aura (mid1ip1l) regulates the cytoskeleton at the zebrafish egg-to-embryo transition.</a> Development. 143 (9), 1585-1599 (2016).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

البروتوكول أعلاه هو للتلاعب من المنتجات الجينات قبل الإخصاب، وبالتالي السماح لدراسة الجينات المنتجات الأمهات في الجنين الزرد في وقت مبكر. وكانت دراسات سابقة قادرة على تنضج البويضات في المختبر (4)؛ تم تعديل هذا البروتوكول للسماح للإخصاب في المختبر لاحق نضجت البويضات 8. وهذا بدوره يسمح لحقن المواد الكيميائية للتلاعب وظيفي والتصور من المنتجات ورثت أمومي في أوائل الجنين 3. الأجنة الناتجة عن هذه الطريقة يمكن أن تكون قابلة للحياة ويمكن البقاء على قيد الحياة ليصبحوا بالغين خصبة. في التجارب الأولية، كان ما يقرب من نصف الأجنة المخصبة المستمدة من هذا الإجراء قابلا للتطبيق في يوم 5 من التنمية، وفقا لتقييم التضخم المثانة السباحة في تلك المرحلة، نصفها تقريبا أصبح صحية، خصبة البالغين (الملاحظات غير منشورة). هناك عددخطوات حاسمة للنظر في البروتوكول. البويضات في المرحلة المناسبة لبدء النضج (أوائل المرحلة الرابعة) يمكن التخصيب إذا تم تزاوج الأنثى في الآونة الأخيرة، ولكن ليس قبل 8 النيابة العامة. استخدام الأسماك التي لم تزاوج مؤخرا قد يؤدي إلى تحولها البيض 14، والتي لن تخضع النضج. سوف الإناث تزاوج خلال أقل من 8 أيام لديهم أغلبية من البيض في المرحلة الثالثة أو أقل، وبالتالي، فإن البيض لا تنضج بشكل صحيح في المختبر. والمبايض في الإناث التي تزاوج قبل 8 أيام يكون لها جزء الأمثل للالبويضات في مرحلة مبكرة IV. ويمكن التعرف على هذه عن طريق التعتيم على وجود GV في موقف غريب الأطوار (الشكل 2B). ويمكن أيضا أن بويضة تقرير المرحلة يتم بمساعدة من قياس حجم، مع البويضات وضعت على شريحة ميكرون تخرج تحت المجهر ومقارنة مع المبادئ التوجيهية انطلاق القياسية (الجدول 1). ومع ذلك، البويضات IV مرحلة مبكرة لها حجم شبه القصوى مقارنة حتى تنضجالبويضات (معترف بها من قبل الشفافية النسبية وعدم وجود GV، الشكل 2C) ويتم التعرف بسهولة، كما هو موضح أعلاه، الذي سيغني عموما الحاجة إلى القياس المباشر حجم البويضة. في نضوج المختبر يجب أن تبدأ في غضون عدة ساعات من نهاية دورة النهار التي يتم تأقلم المانحين بويضة الأنثى. والبويضات لا تنضج بشكل صحيح، ينعكس في معدلات التسميد الفقيرة، إذا مثقف خلال الفترة الصباحية من دورة الخفيفة. لا يفهم سبب تبعية الساعة البيولوجية للفي المختبر بويضة طريقة النضج ولكن من المرجح يعكس التحيز الساعة البيولوجية الكامنة في الجسم الحي في البيض النضج التي تنطوي على التعبير الجيني ركوب الدراجات أثناء مراحل تكوين البويضات 21. سبب شائع للالبويضات عدم الخضوع ناجحة في نضوج المختبر على الرغم من انطلاق البويضة الصحيح هو أن DHP قد انتهت. تنتهي DHP الهرمون بشكل عام بعد عام، ولضمان تأثيرنضوج إيف، يجب أن يتم استبدال الدفعة عمل في غضون 9 أشهر من الاستخدام. حقن البويضات هو خطوة حاسمة أخرى عندما يكون الغرض من هذه الطريقة للتلاعب وظيفي للمنتجات الأمهات. هذا الإجراء ومتطلبات تختلف عن تلك التي لحقن القياسية في البويضة المخصبة في 0-30 MPF. وهناك عامل أساسي في حقن بويضة هو الحاجة إلى إجراء الحقن في ظل الظروف التي لا تؤدي إلى تنشيط البويضة سابقا لأوانه، كما هو الحال في ليبوفيتش L-15 متوسطة 22 و 23. لأنها هي جزء لا يتجزأ في المبايض، البويضات التي تستحق أيضا تحديات خاصة للحقن. بروتوكول فوق يوحي أولا النأي البويضات من المبايض ومن ثم عقد كل فصل على حدة بويضة مع ملقط في حين حقن. وقد عملت هذه التقنية بشكل جيد ويسمح البويضات الفرز قبل في المرحلة المناسبة مع الحد الأدنى من التعامل معها. ويمكن أيضا طرق بديلة يمكن استخدامها، مثلعلى النحو التالي: أ) وضع البويضات في حقن القياسية أحواض الاغاروز 15، حيث الجدران الرأسية للدعم حوض البويضة خلال حقن (في هذه الطريقة البديلة، تحتاج البويضات على أن يتم تحويلها إلى لوحات حقن حين يوضع في في المختبر نضوج المتوسطة) والثاني ) مما يسمح للبقاء البويضات التي تعلق على كتلة المبيض، والتي يمكن أن تعقد مع ملقط خلال الحقن لتجنب الاتصال مع البويضة حقن (في هذا النهج، ينبغي فصل البويضات بعد الحقن لكلا تسهيل التعرض DHP والسماح defolliculation بهم ، في حد ذاته ضروري لIVF). وعلى الرغم من هذا التحدي معين، البويضات IV مرحلة يمكن اختراقها بسهولة مع إبرة الحقن، على الأرجح لأن الغشاء المشيمي في هذه المرحلة ليست متطورة تماما 9. واحد الحد من بروتوكول نضوج الحالي هو أنه في ظروف نضوج المختبر التي تعزز التنمية بويضة سليمةلا يمكن إنشاء عند بدء نضوج البويضة في مراحل مبكرة من المرحلة الرابعة. تصبح البويضات المختصة للرد على DHP التي تمر النضج عند بلوغهم يبلغ قطرها 520 ميكرون، والذي يحدث خلال المرحلة الثالثة (تكون المح الموافق مدى 340 إلى 690 ميكرون) 9. ومع ذلك، فإن ثقافة المرحلة الثالثة البويضات النتائج في البويضات التي ليست مختصة للإخصاب 3. البويضات فقط الذي يبدأ في المرحلة الرابعة (الشكل 2B) في المختبر الثقافة يمكن أن تتطور إلى ناضجة، البويضات مرحلة V (الشكل 2C وD). قد تكون متعلقة هذا إلى حقيقة أن المرحلة الثالثة هي ضرورية لتكون المح وبويضة نمو 9. وهكذا، في المختبر إجراء بويضة نضوج الواردة في هذه المادة ينبغي أن تستخدم فقط مع بدء سكان المرحلة الرابعة البويضات (B)، وليس مع البويضات في مراحل سابقة (مراحل I - III، شملت رقم البريد <strأونج&gt; 2A). لنفس السبب، وهذا الإجراء يقتصر على الجينات التي يتم التعبير عنها في المرحلة الرابعة أو في وقت لاحق. قد يكون تلاعب وظيفي من الجينات التي يتم التعبير عنها في وقت سابق من المنتجات بدلا من الاعتماد على الأساليب الوراثية (انظر أدناه). قد تحسينات على الطرق في المختبر ثقافة النضج في المستقبل تسمح للبدء في زراعة بويضة في المراحل السابقة، وبالتالي توسيع قوة في المختبر نهج النضج. قيود أخرى في طريقة عرض هو أن defolliculation، وهو أمر ضروري للخطوات اللاحقة التي الإخصاب، ويعمل حاليا الحد من معدل خطوة في الإجراء. غشاء مسامي هو عبارة عن طبقة شفافة المحيطة البويضة النامية، وإزالة يمكن أن تكون مملة. إذا لم تتم إزالة هذا الغشاء تماما، فإن البيض لا تصبح تفعيلها بشكل كامل والمخصبة. يرصد هذا واضح من فشل المشيمه لتوسيع وتطوير وضعها بشكل غير منتظم، ثلم مثل شارعructures (pseudocleavages)، سمة من أجنة غير مخصبة 11. طرق defolliculation الأنزيمية مثل كولاجيناز، كما تستخدم في القيطم، قد حوكموا. ومع ذلك، في أيدينا، لم يكن هذا الأسلوب ناجح، وبالتالي فإننا نعتمد على defolliculation اليدوي. لأن defolliculation اليدوي كثيفة العمالة وتستغرق وقتا طويلا، فمن الصعب الحصول على دفعات كبيرة من البويضات المخصبة بعد في المختبر بويضة النضج. بسبب القيد الزمني الذي تفرضه defolliculation اليدوي، نحن تسميد حاليا عدد قليل من defolliculated والبيض ناضجة في وقت واحد، على دفعات صغيرة من 5-10 البيض. إن إدماج defolliculation الأنزيمي مع هذا الإجراء يزيد من المرجح بشكل كبير العائد وسهولة الشاملة للاستخدام. على الرغم من أن الأجنة المنتجة بعد إخصاب البويضات في المختبر -matured يمكن أن تصبح قابلة للحياة البالغين، نلاحظ أن بعد الإخصاب في المختبر، وهي جزء من الأجنة تفعل<html> لا تقسم عادة أو في الوقت المناسب. نحن اختيار حاليا لخطوط التي تشمل جولات من بويضة في المختبر النضج، مما قد يؤدي إلى أنماط أكثر قوة للتنمية في الأجنة من خلال هذا الأسلوب نشر. وقد سمح هذا الإجراء لإنقاذ واضحة أو تصور توطين البروتين لعدد من الطفرات 24 و 25. ومع ذلك، بالنسبة لبعض الجينات، وتنظيم التعبير المنتج قد يكون حاسما، وبالتالي فإن المنتجات التي أعرب عنها مرنا حقن قد يؤدي إلى نتائج متغيرة 26. ومن المهم أيضا أن تضع في اعتبارها جميع الضوابط (على سبيل المثال، حقن الأجنة مع الكواشف التي لها خصائص مشابهة لتلك التي استخدمت في التجربة حتى الآن ومن المتوقع أن لا تنتج أثرا، مثل المنظمات الأعضاء السيطرة أو الرنا الترميز لالبروتينات الخاملة فقط، مثل كما GFP)، والتباين الأساسي قد يؤدي إلى استنتاجات غير سليمة. الإقليم الشمالي &quot;&gt; نهج تنطوي في المختبر التلاعب تليها الإخصاب مفيد بشكل خاص في حالة المنتجات المودعة للأمهات، حيث الطريقة المعيارية لحقن RNA، المنظمات الأعضاء، أو البروتين في البويضة المخصبة قد لا فعالا في الحد منتجات تراكمت بالفعل في البيض. طرق تطويرها مؤخرا الأخرى، مثل الجيل كريسبر متحولة، هي أيضا فعالة في توليد الظروف متحولة عن الجينات وأعرب أمهات (26). ومع ذلك، فإن هذا الأسلوب يتطلب نمو عدة أجيال من الأسماك. وفي المختبر تقنية بويضة النضج تسمح للتلاعب وظيفي السريع ل دراسة وظيفة الجينات وأعرب أمهات، بما في ذلك الانقاذ ونسخة مظهرية الطفرات تأثير الأمهات، وكذلك التعبير عن RNA والبروتينات في الجنين في وقت مبكر.

خلال تنمية الحيوانية، والودائع الأم منتجات الجين (على سبيل المثال، الرنا والبروتينات والجزيئات الحيوية الأخرى) داخل البويضة. هذه المنتجات هي مهمة للعمليات الخلوية الأولى مباشرة بعد الإخصاب 1 و 2. التلاعب في التعبير وظيفة من المنتجات الأمهات عادة غير فعالة عند استخدام نهج موحد لحقن الكواشف في بويضات المخصبة 3. وذلك لأن يتم إنتاج معظم الرنا والبروتينات التي البويضة خلال مراحل تكوين البويضات، من المنتجات للأمهات قبل تحميلها موجودة في بويضة ناضجة بالفعل. هذه المنتجات الموجودة مسبقا هي منيع لضربة قاضية وظيفية مع الجينات التي تستهدف وكلاء، مثل oligos Morpholino العقاقير (موس)، لأن المنظمات الأعضاء استهداف مرنا، وليس البروتين موجودة مسبقا موجودة بالفعل في البيضة عند التلقيح. وبالإضافة إلى ذلك، تحدث العديد من العمليات الجنيني المبكر في وقت قريب جدا بعد الإخصاب إلى أن influenدائرة الهندسة المدنية من منتجات البروتين مشتقة من RNA حقنها في البويضة المخصبة، كما RNA قد لا يتم إنتاجها بسرعة كافية للتأثير على الأحداث الأولى من التطور الجنيني. لنفس السبب، الموسومة اندماج بروتين وأعرب عن طريق حقن مرنا في البويضة المخصبة قد لا يتم إنتاجها في الوقت المناسب لالتصور خلال دورها الفاعل في الجنين في وقت مبكر. حقن البويضات الناضجة مقذوف قبل تفعيل البيض ممكن ولكنه يترافق مع القضايا الفنية مماثلة: بالفعل هذه البيض نضجا محملة مسبقا مع البروتين الأمهات، وأنها لن تصبح نشطة translationally (أي إنتاج بروتين من محاضر الخارجية) حتى بعد البيض التنشيط. لهذه الأسباب، والتلاعب في المنتجات الجين الأم تعمل في مرحلة التطور الجنيني المبكر يحتاج عادة إلى القيام بها أثناء مراحل تكوين البويضات في البويضة تنضج. مع اقتراب موعد واحد للتغلب على هذه العقبات، في أساليب نضوج في المختبر، والتي تسمح للنضوج شركة النفط العمانيةytes من المرحلة الرابعة لتشكيل البيض، وقد تم تأسيسها في الزرد. طرق مبكرة سمحت في نضوج في المختبر، ولكن كانت البيض نضجا مما أدى يست مختصة للإخصاب 4. وفي وقت لاحق، والتلاعب في ظروف التربية من محايدة إلى درجة الحموضة 9.0، محاكاة درجة الحموضة القلوية من السائل المبيض وجدت في أنواع الأسماك 5، 6، سمح لموثوق التخصيب في المختبر (IVF) في المختبر بعد نضوج 7 و 8. في الواقع، يمكن في المختبر البويضات -matured تسفر الأجنة قابلة للحياة التي تعيش إلى مرحلة البلوغ والتي هي خصبة 3 و 8. وقد تم تكييف هذه الطريقة تحسن أبعد لتشمل التلاعب الوظيفي للجينات الأم، والتعبير عن البروتينات الموسومة خلال مراحل تكوين البويضات الزرد من خلال التعبير خارجي، وMO بوساطة ظيفية نهدم في حصيرةمرحلة أورينغ IV البويضات 3 (الشكل 1). مراحل تكوين البويضات الزرد يعرض عدد من المراحل المميزة التي أدت إلى تشكيل البويضات الناضجة 9 (انظر الجدول رقم 1 لدليل سريع إلى مراحل مختلفة في مراحل تكوين البويضات). لفترة وجيزة، وبدأ تطور البويضة بواسطة البويضات المرحلة الأولى ويتم إلقاء القبض عليه في مرحلة طور التضعف من الطور الأول من الانقسام الاختزالي. هذه البويضات تخضع النمو من خلال النسخ النشط (بدأت خلال مراحل IA وIB)، وتشكيل الحويصلات القشرية (المعروف أيضا باسم حبيبات القشرية، التي بدأت خلال المرحلة الثانية)، وتكون المح (بدأت خلال المرحلة الثالثة). اكتمال نمو البويضة خلال المرحلة الرابعة، عندما الانقسام الاختزالي يستأنف الأول، مما أدى إلى تفكك نواة بويضة، ويشار إلى الحويصلة الجرثومية (GV). وفي وقت لاحق، تم إلقاء القبض الانقسام الاختزالي مرة أخرى في الطورية II. الانتهاء من نمو البويضة واعتقال الانتصافي خلال المرحلة الرابعة يؤدي إلى مرحلة ناضجة V على سبيل المثالز 9. تحدث إزالة غشاء مسامي خلال الافراج عن البويضة في تجويف المبيض 10 و ضرورية للإخصاب وتفعيل البيض السليم. مرة واحدة تنبثق البيض من الأم أثناء التزاوج الطبيعي، فإنها تصبح تفعيلها. في الزرد، والتعرض للمياه كافية لتفعيل البيض الكامل، بغض النظر عن وجود الحيوانات المنوية 11. في ظروف المختبر يسمح حاليا للنضوج البويضات من المرحلة المبكرة IV-التي يمكن التعرف عليه بواسطة حجمها (690-730 ميكرون)، وجود GV كبير في وضع غير المتماثلة، ومظهر معتم تماما بسبب تراكم بروتينات صفار (الشكل 2B) -to ناضجة مرحلة V البيض، وتتميز GV تفكيكها تماما ومظهر شفاف المقرر أن صفار معالجة بروتين 12 (الشكل 2C). في هذا النهج، المبايض كلها تابعتتم إزالة aining البويضات في مراحل مختلفة من التنمية من الإناث. يسمح البويضات لتطوير في 17α-20β-dihydroxy-4 pregnen-3-واحد (DHP)، فعال يحفز نضوج هرمون 8. خلال هذه الفترة، البويضات النضج يمكن التلاعب بها من خلال حقن التعبير (على سبيل المثال، توج، في المختبر -transcribed من mRNAs) أو عكس علم الوراثة وكلاء (على سبيل المثال، موس). طبقة الجريبي لا يلقي عفويا في نهاية فترة النضج، لذلك يجب إزالتها يدويا. بعد defolliculation، ويتحقق التخصيب في المختبر عن طريق إحداث تنشيط البويضة من خلال التعرض للالبيض في الماء (موجودا في الجنين المتوسطة (E3)) 13، وإيجاد حل الحيوانات المنوية. وبيضات ملقحة الناتجة تخضع التطور الجنيني وتسمح لتقييم قدرة العلاجات التلاعب وظيفة الجين الأم ولتصور وتحليل المنتجات الأمهات الموسومة ( <strong&gt; الشكل 3).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Zebrafish mating boxes</td>
			<td>Aqua Schwarz</td>
			<td>SpawningBox1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4-7H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Western Chemical</td>
			<td>Tricaine-D (MS 222)</td>
			<td>FDA approved (ANADA 200-226)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td>to prepare 1 M Tris pH 9.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>920-1</td>
			<td>to prepare 1 M Tris pH 9.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish net (fine mesh) (4-5 in)</td>
			<td>PennPlax</td>
			<td>(ThatFishThatPlace # 212370)</td>
			<td>available in ThatFishThatPlace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic spoon</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>available in most standard stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14091-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>SS</td>
			<td>available from Fine Science Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting stereoscope (with transmitted light source)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ645</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reflective light source (LED arms)</td>
			<td>Fostec</td>
			<td>KL1600 LED</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plates 10 cm diameter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes 1.5 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow spatula</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depression glass plate</td>
			<td>Corning Inc</td>
			<td>722085 (Fisher cat. No 13-748B)</td>
			<td>available from Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>06-666-11</td>
			<td>available from Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer stop watch</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash bottle</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>24020500</td>
			<td>available from Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beakers, 250 ml (2)</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>1000250</td>
			<td>available from Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;z L-15 medium</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221465</td>
			<td>for pH&#39;ing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>17alph-20beta-dihyroxy-4-pregnen-3-one (DHP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection Apparatus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>FemtoJet</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Tubing for injection needles</td>
			<td>FHC</td>
			<td>30-30-1</td>
			<td>or equivalent, Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID with fiber, 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>Model P-87</td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipetor (1-20 &#181;l range) with tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipetor (20 - 200 &#181;l range) with tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipetor (100 - 1000 &#181;l range) with tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes 15ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes 50ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic pipette 10 ml with bulb</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic pipette 20 ml with bulb</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope stage Calibration Slide 0.01 mm</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>MR095</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents for fish water:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Ocean Salt</td>
			<td>Drs. Foster &#38; Smith</td>
			<td>&#160;CD-116528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (cell culture tested)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents for E3 medium:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2, dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4, heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63138-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene Blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9140-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish Food:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frozen brine shrimp</td>
			<td>Brine Shrimp Direct</td>
			<td>FBSFKG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramin Flakes</td>
			<td>Drs. Foster &#38; Smith</td>
			<td>16623</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional manipulation of maternal gene products using in vitro oocyte maturation in zebrafish

هي التي تحرك الأحداث الخلوية التي تحدث أثناء المراحل الأولى من التطور الجنيني الحيوانية من المنتجات الجينات المستمدة أمهات المودعة في البويضة النامية. لأن هذه الأحداث تعتمد على المنتجات الأمهات التي تعمل عادة في وقت قريب جدا بعد الإخصاب التي preexist داخل البيضة، نهجا موحدة للتعبير والحد من ظيفية تنطوي على حقن الكواشف داخل البويضة المخصبة غير فعالة عادة. بدلا من ذلك، يجب إجراء هذه المناورات خلال مراحل تكوين البويضات، قبل أو أثناء تراكم المنتجات الأمهات. توضح هذه المقالة بالتفصيل بروتوكول لنضوج البويضات في المختبر من الزرد غير ناضجة والتسميد في وقت لاحق في المختبر، مما أسفر عن أجنة قابلة للحياة التي تعيش إلى سن البلوغ. هذا الأسلوب يسمح للتلاعب وظيفي للمنتجات الأمهات أثناء مراحل تكوين البويضات، مثل التعبير من المنتجات لإنقاذ المظهرية والمعلمة والتصور بناء، وكذلك لق الحد من وظيفة الجين من خلال وكلاء عكس علم الوراثة.

لتحديد ما إذا كان الإجراء هو موضح أعلاه ناجحا، الأجنة يمكن ملاحظتها خلال مراحل الانقسام لتأكيد ظهور النمطية نمط الانقسام المبكر الجنينية 18، وكذلك في 24 ساعة بعد الإخصاب (HPF) لتأكيد التنمية السليمة خطة الجسم الأساسية. يسمح هذا الإجراء للتلاعب من المنتجات الأمهات للدراسات وظيفية من خلال حقن الكواشف، مثل من mRNAs والمنظمات الأعضاء، خلال تطوير بويضة. التلاعب في المنتجات الأمهات للدراسات وظيفية: مرنا الترميز لمن النوع البري ومنتجات تحور يمكن حقن البويضات في المختبر تنضج لاختبار تأثير من التلاعب وظيفة الجين الأمهات أثناء الانقسام الاختزالي والمراحل الجنينية المبكرة. على سبيل المثال، من النوع البري الأجنة يمكن حقنها مع وايدينار من نوع مرنا لاختبار تأثير overexpression المنتج، أو مع RNA متحولة لاختبار المحتملة المهيمنة (على سبيل المثال، والحصول على وظيفة، ومضاد للشكل) الآثار في هذه العمليات. البويضات في المختبر في الثقافة قادرة على إنتاج البروتين من مرنا خارجي طوال تطوير بويضة، كما يتضح من التعبير عن GFP من مرنا حقن، على الرغم فقط البويضات التي تبدأ الظروف والثقافة في المرحلة الرابعة من مراحل تكوين البويضات يمكن أن تتطور إلى البويضات مرحلة V الناضجة (الشكل 2B -2D، وانظر أيضا ناير وآخرون. 3). التعبير البرية من نوع المنتج من خلال مرنا حقن أيضا دور فعال من أجل إنقاذ الطفرات تأثير الأمهات لتأكيد هوية الجينات خلال استنساخ الموضعية 3 و 24. في هذه الحالة، يتم حقن من النوع البري مرنا في البويضات من الإناث متحولة متماثل لاختبار ما إذا كان من النوع البري المنتجات يمكن انقاذ النمط الظاهري متحولة. ويتضح هذا الإنقاذ الوراثي في ​​&lt;يتم عرض قوي&gt; الشكل 3A-3C، حيث حقن AurB مرنا لإنقاذ آثار المظهري من طفرة في الجين المقابلة لها، جزيرة الخلوية (المبادرة) (الشكل 3A-3C). يسمح للأجنة من مجموعة السيطرة أيضا على تطوير لإظهار النمط الظاهري متحولة الموافق 3. ويمكن أيضا أن يتم حقن الحمض النووي الريبي متحولة إلى البويضات متحولة لاختبار ما إذا كان المنتج تحور يحتفظ ظيفة جزئية بمقارنة مدى الإنقاذ التي تسببت من قبل المنتج من النوع البري. يبدو تعبير البروتين من مرنا حقنها في البويضات النامية لتحدث مع تأخير ضئيلة أو معدومة. ويلاحظ التعبير GFP قوي داخل 2 ساعة من حقن مرنا المقابلة، بغض النظر عن المرحلة التنموية للبويضة 3 (الشكل 2B-2D؛ انظر أيضا ناير وآخرون 3). منتجات مثل mCherry:Sas6 وBirc5b (ثوب المهرج): GFP يمكن ملاحظتها مباشرة بعد التسميد وخلال أول دورة الخلية الجنينية 3 و 25. حقن مرنا أثناء مراحل تكوين البويضات ويؤدي أيضا إلى إنتاج البروتين الذي، بغض النظر عن شاردة الموسومة تنصهر، هو وظيفي على الفور بعد الإخصاب، كما هو مبين في حالة المنتجات الأمهات للجزيرة الخلوية / aurB 3، دورة عقيمة / lrmp 24، و متنافرة / bir5b 25. الترجمة منع المنظمات الأعضاء أيضا أن يكون له تأثير على الفور بعد الإخصاب، كما هو مبين لدورة عقيمة / Lrmp 3 و في مراحل لاحقة من التطور الجنيني، كما في حالة مهمة مستحيلة / dhx16 3. لصق حجب المنظمات الأعضاء، عندما تم حقنها في البويضات النضج، قد لا يكون لها تأثير على وظيفة الأمومة، من المحتمل بسبب بالفعل الحالية النصوص الأمهات الناضجة في البويضات المرحلة الرابعة &lt;سوب الطبقة = &quot;XREF&quot;&gt; 3. جيل من morphants: عند استخدام MO المقابلة لجين مع الطفرة التي تم تحديدها بالفعل، ومن المتوقع أن تحاكي النمط الظاهري متحولة النمط الظاهري morphant. تتم مقارنة Morphants إلى الأجنة uninjected ولتلك حقن مع مستوى، والسيطرة MO. وحقن morpholino حجب الترجمة يمكن أن نسخة مظهرية بنجاح النمط الظاهري متحولة المعروف 3، كما هو مبين من قبل حقن Lrmp MO في البويضات، الذي يحاكي النمط الظاهري متحولة من الطفرة المقابلة، دورة عقيمة (الشكل 3D-F). خصوصية المنظمات الأعضاء يمكن تحديد من خلال نفس الأساليب المستخدمة عند حقن المنظمات الأعضاء في الأجنة (مراجعة سابقا) 19، 20. التعبير عن fluorescently المسمى البروتينات الانصهار: مرنا الترميز للمنتجات الجين تنصهر البروتينات الفلورية (على سبيل المثال، GFP وmCherry) كما يمكن حقنها إما من النوع البري أو البويضات متحولة إلى تصور المنتجات المناظرة داخل الجنين في وقت مبكر (أي، والتي تعكس نمط توطين التحت خلوية، الشكل الجيل الثالث 3G و3H). من mRNAs الترميز للاندماج مماثلة لكنها تنطوي على أليل متحولة يمكن التعبير على نحو مماثل لاختبار ما إذا كان طفرة تؤثر أي تعريب التحت خلوية المحتملة. <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/55213/55213fig1.jpg" /> الشكل 1: في المختبر سيت النضج. رسم تخطيطي يبين الخطوات المختلفة التي ينطوي عليها في المختبر بويضة النضج. وقبل اختيار-الإناث البالغات لقبل 8 أيام لهذا الإجراء، لتطهير لهم من البيض التي سبق نضجت والمؤيدة للوضع البيضقذى تطوير بويضة جديدة. المبايض، التي تحتوي على البويضات النامية، تتم إزالة من الإناث ونقل إلى المتوسط تحتوي على هرمون DHP للحث على بويضة نضوج في المختبر. بعد إزالة من الإناث ومباشرة قبل أو أثناء نضوج البويضة، البويضات يمكن حقنها مع منتجات RNA والكواشف أخرى للتلاعب وظيفي من العوامل الأمهات. وdefolliculated البويضات الناضجة يدويا وإخصابها في المختبر مع حل الحيوانات المنوية لانتاج مخصبة والأجنة قابلة للحياة. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55213/55213fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/55213/55213fig2.jpg" /> الشكل 2: في المختبر سيت النضج والتعبير من المنتجات من مرنا المصبوبة. (A) البويضات في مراحل I-III، لوحظ في المبيض منالإناث 4 أيام بعد تطهير (النيابة العامة). (B) البويضات في المرحلة الرابعة، التي لوحظت في المبايض من الإناث 8 النيابة العامة. الحويصلة الجرثومية (GV، رأس السهم) واضحة للعيان وتحتل موقعا غريب الأطوار. وIII البويضات مرحلة في (A) أيضا يحمل على GV اضحة وضوح الشمس، ولكن تم العثور على مركزه في البويضة. البويضات المرحلة الرابعة في (B) لديها الحجم الذي هو بالقرب القصوى مقارنة بما كان عليه من البويضات الناضجة في (C). (C و D) البويضات في مرحلة V (تنضج البويضات) بعد 2 ساعة في المختبر في ظروف النضج بدأت في المرحلة الرابعة، كما هو الحال في (B)، وحقن أثناء النضج مع GFP ترميز، كتب في المختبر مرنا (C، الضوء المرئي فقط؛ D، تراكب الضوء المرئي ومضان GFP). وGV لم يعد واضحا في البويضات V المرحلة، التي هي أيضا أقل غموضا من البويضات المرحلة الرابعة. البويضات حقن تعبر عن البروتين GFP (D). Defolliculation ناضجة البويضات المرحلة الرابعة هي ديcribed في قسم البروتوكول. شريط مقياس = 300 ميكرون. استنسخت كل اللوحات، بإذن، من نير آخرون 3. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55213/55213fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/55213/55213fig3.jpg" /> الشكل (3): التلاعب والتخيل من المنتجات الأم من خلال في المختبر سيت النضج. (A - C) إنقاذ النمط الظاهري تأثير الأمهات الناجمة عن طفرة في جزيرة الخلوية / الشفق B من خلال حقن من النوع البري aurB مرنا في المرحلة الرابعة المبادرة البويضات / aurB. الصور المدمجة التي تبين وجهات النظر الحيوان من 65 blastodiscs الثابتة MPF، تصور مع أضداد ß-كاتينين لتسليط الضوء على الأغشية (الأخضر)، والأجسام المضادة لمكافحة α-تويولين للإشارة الأنابيب الدقيقة (أحمر)، ودابي لتعيين DNA (الأزرق). (A) تراكم β-كاتينين في البرية من نوع الأجنة، مما يدل على نضوج ثلم العادي. (B) A المبادرة / aurB الجنين من المبادرة / aurB المرحلة الرابعة بويضة uninjected يظهر جزئية، الأخاديد بدائية لا تتراكم بيتا كاتينين. (C) والمبادرة أنقذت / aurB الجنين من المبادرة / aurB بويضة حقن من النوع البري aurB مرنا تظهر قوية تراكم β-كاتينين في الأخاديد. (D - F) نسخة مظهرية للتأثير الأمهات الناجمة عن طفرة في دورة غير مجدية / lrmp من حقن Lrmp morpholino في المرحلة الرابعة البويضات. الصور المدمجة التي تبين وجهات النظر الحيوان من 70 blastodiscs الثابتة MPF، تصور مع أضداد γ-تويولين للإشارة جسيم مركزي (أحمر) ودابي لتعيين DNA (الأزرق). (D) في الأجنة من النوع البري، كل نواة الزميلة مع γ تويولين، علامة للمواد centrosomal. (E) في المسوخ الحويصلة تأثير الأمهات، فشل اندماج pronuclear، مما أدى إلى 2-3 بقع من علامات الحمض النووي المقابلة لغير مدمجة الوالدين المؤيدة للنوى والجسم القطبي لالانقسام الاختزالي الثاني. (F) في morphants Lrmp، حيث تحول دون وظيفة Lrmp الأمهات، ونوى ترفض أيضا تقسيم، وبالإضافة إلى ذلك، تفشل لربط مع γ تويولين. (G و H) تصور المنتجات المنتجة للأمهات في الجنين في وقت مبكر. البروتين Sass6-mCherry من مرنا خارجي حقنه في المرحلة الرابعة البويضات يموضع إلى مريكز. الصور المدمجة التي تبين وجهات النظر الحيوان من 40 blastodiscs الثابتة MPF، تصور مع أضداد γ-تويولين لتسليط الضوء جسيم مركزي (الأخضر)، mCherry مضان تشير إلى Sass6 (الحمراء)، ودابي لتعيين DNA (الأزرق). (G) أعربت عن بروتين Sass6-mCherry يموضع إلى بؤر وصفت من قبل الجسيم المركزي علامة γ تويولين في مواقع المرافقة النواة (السهام). (H </stرونغ&gt;) نفس الصورة، تظهر فقط Sass6-mCherry ودابي لوضوح. يتم إصلاح الأجنة في (G و H)، ولكن مضان من المنتجات أعرب، مثل اندماج mCherry، ويمكن أيضا أن تراعى في الأجنة الحية (لا يظهر). استنسخت شريط مقياس = 100 ميكرون في AF و 10 ميكرون في G وH. جميع الألواح، بإذن، من نير آخرون 3. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55213/55213fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> مراحل مراحل تكوين البويضات </td><td> قطر البويضة (ميكرون) </td><td> معلما رئيسيا (ق) </td></tr><tr><td> 1A - السابقة للجريبات </td><td> 7-20 </td><td> بدء النسخ نشط، وتراكم نويات </td></tr><tr><td> 1B - جريب </stroنانوغرام&gt; </td><td> 20-140 </td><td> Decondensation من الكروموسومات </td></tr><tr><td> II - سنخ القشرية </td><td> 140-340 </td><td> إنتاج الحويصلات الهوائية القشرية </td></tr><tr><td> III - تكون المح </td><td> 340-690 </td><td> سواد من هيولى البيضة عن تراكم صفار السلائف البروتين والدهون </td></tr><tr><td> IV المبكر - نضوج البويضة </td><td> 690-730 (أقل المدى) </td><td> تعريب غير المتماثلة من حويصلة جرثومي </td></tr><tr><td> IV المبكر - نضوج البويضة </td><td> 690-730 (النطاق العلوي) </td><td> يختفي حويصلة جرثومي، القبض على الطورية II </td></tr><tr><td> V - الناضجة بويضة </td><td> 750 ~ </td><td> هيولى البيضة / صفار يصبح شفاف </td></tr></tbody></table> الجدول 1: معالم التنمية البويضة في زيبراسمك.

Watch this Scientific Journal Video about Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish at JoVE.com

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

ويرد بروتوكول الأمثل لنضوج البويضات في المختبر من الزرد تستخدم للتلاعب من المنتجات الجينات الأمهات هنا.

التلاعب وظيفي من الأم جين المنتجات التي تستخدم<em&gt; في المختبر</em&gt; نضوج البويضة في الزرد

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into ...

functional-manipulation-maternal-gene-products-using-vitro-oocyte

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

11.3K Views.  University of Wisconsin-Madison.  ويرد بروتوكول الأمثل لنضوج البويضات في المختبر من الزرد تستخدم للتلاعب من المنتجات الجينات الأمهات هنا. 

Video: Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during oogenesis. In order to study roles of such maternal factors in early embryonic development, it is desirable to manipulate their functions from the very beginning of embryonic development. Conventional ways of gene interference are achieved by injection of antisense oligonucleotides (oligos) or mRNA into fertilized eggs, enabling under- or over-expression of specific proteins, respectively. However, these methods normally require more than several hours until protein expression is affected, and, hence, the interference of gene functions is not effective during early embryonic stages. Here, we introduce an experimental system in which expression levels of maternal proteins can be altered before fertilization. Xenopus laevis oocytes obtained from ovaries are defolliculated by incubating with enzymes. Antisense oligos or mRNAs are injected into defolliculated oocytes at the germinal vesicle (GV) stage. These oocytes are in vitro matured to eggs at the metaphase II (MII) stage, followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). By this way, up to 10% of ICSI embryos can reach the swimming tadpole stage, thus allowing functional tests of specific gene knockdown or overexpression. This approach can be a useful way to study roles of maternally stored factors in early embryonic development.

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.

التلاعب و<em&gt; في المختبر</em&gt; نضوج<em&gt; القيطم المورق</em&gt; البويضات، تلاه سهم داخل الهيولى حقن الحيوانات المنوية، لدراسة التطور الجنيني

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers. To robustly and efficiently identify oncogenic &#8220;drivers&#8221; among these tumors and define their complex relationships with concurrent genetic alterations during tumor pathogenesis remains a daunting task. Recently, zebrafish have emerged as an important animal model for studying human diseases, largely because of their ease of maintenance, high fecundity, obvious advantages for in vivo imaging, high conservation of oncogenes and their molecular pathways, susceptibility to tumorigenesis and, most importantly, the availability of transgenic techniques suitable for use in the fish. Transgenic zebrafish models of cancer have been widely used to dissect oncogenic pathways in diverse tumor types. However, developing a stable transgenic fish model is both tedious and time-consuming, and it is even more difficult and more time-consuming to dissect the cooperation of multiple genes in disease pathogenesis using this approach, which requires the generation of multiple transgenic lines with overexpression of the individual genes of interest followed by complicated breeding of these stable transgenic lines. Hence, use of a mosaic transient transgenic approach in zebrafish offers unique advantages for functional genomic analysis in vivo. Briefly, candidate transgenes can be coinjected into one-cell-stage wild-type or transgenic zebrafish embryos and allowed to integrate together into each somatic cell in a mosaic pattern that leads to mixed genotypes in the same primarily injected animal. This permits one to investigate in a faster and less expensive manner whether and how the candidate genes can collaborate with each other to drive tumorigenesis. By transient overexpression of activated ALK in the transgenic fish overexpressing MYCN, we demonstrate here the cooperation of these two oncogenes in the pathogenesis of a pediatric cancer, neuroblastoma that has resisted most forms of contemporary treatment.

The goal of this study is to demonstrate how the mosaic transgenesis strategy can be used in zebrafish to rapidly and efficiently assess the relative contributions of multiple oncogenes in tumor initiation and progression in vivo.

فسيفساء اسماك الزرد Transgenesis لتحليل الجينوم الوظيفي للجينات التعاونية المرشح لورم إمراض

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers.  To robustly and efficiently ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

تحليل الزرد اليرقات الهيكل العظمي النزاهة العضلات مع ايفانز الأزرق صبغ

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in abundance, may not be secreted but tethered to the signaling cell(s), or may require the presence of binding partners or upstream regulatory molecules. Thus in a search for gene products capable of eliciting an early lens-inductive response in competent ectoderm, we utilized an expression cloning system that would allow identification of paracrine or juxtacrine factors as well as transcriptional or other regulatory proteins. Pools of mRNA were injected into Xenopus oocytes, and responding tissue placed directly on the oocytes and co-cultured. Following functional cloning of ldb1 from a neural plate stage cDNA library based on its ability to elicit the expression of the early lens placode marker foxe3 in lens-competent animal cap ectoderm, we characterized the mRNA expression pattern, and assayed developmental progression following overexpression or knockdown of ldb1. This system is suitable in a very wide variety of contexts where identification of an inducer or its upstream regulatory molecules is sought using a functional response in competent tissue.

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

We describe a Xenopus oocyte and animal cap system for the expression cloning of genes capable of inducing a response in competent ectoderm, and discuss techniques for the subsequent analysis of such genes. This system is useful in the functional identification of a wide range of gene products.

الاستنساخ وظيفية باستخدام<em&gt; القيطم</em&gt; نظام التعبير البويضة

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, specifically the generation of homozygous gynogenetic diploids is useful in genetic analysis because it allows the direct production of homozygotes from a single heterozygous mother. This article describes a modified protocol for ploidy duplication based on a heat pulse during the first cell cycle, Heat Shock 2 (HS2). Through inhibition of centriole duplication, this method results in a precise cell division stall during the second cell cycle. The precise one-cycle division stall, coupled to unaffected DNA duplication, results in whole genome duplication. Protocols associated with this method include egg and sperm collection, UV treatment of sperm, in vitro fertilization and heat pulse to cause a one-cell cycle division delay and ploidy duplication. A modified version of this protocol could be applied to induce ploidy changes in other animal species.

A modified protocol for ploidy manipulation uses a heat shock to induce a one-cycle stall in cytokinesis in the early embryo. This protocol is demonstrated in the zebrafish but may be applicable to other species.

التلاعب الصيغة الصبغية من الزرد الأجنة مع الحرارة صدمة 2 العلاج

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, ...

Maturation of Human Stem Cell-derived Cardiomyocytes in Biowires Using Electrical Stimulation

Human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CMs) have been a promising cell source and have thus encouraged the investigation of their potential applications in cardiac research, including drug discovery, disease modeling, tissue engineering, and regenerative medicine. However, cells produced by existing protocols display a range of immaturity compared with native adult ventricular cardiomyocytes. Many efforts have been made to mature hPSC-CMs, with only moderate maturation attained thus far. Therefore, an engineered system, called biowire, has been devised by providing both physical and electrical cues to lead hPSC-CMs to a more mature state in vitro. The system uses a microfabricated platform to seed hPSC-CMs in collagen type I gel along a rigid template suture to assemble into aligned cardiac tissue (biowire), which is subjected to electrical field stimulation with a progressively increasing frequency. Compared to nonstimulated controls, stimulated biowired cardiomyocytes exhibit an enhanced degree of structural and electrophysiological maturation. Such changes are dependent upon the stimulation rate. This manuscript describes in detail the design and creation of biowires.

The cardiac biowire platform is an in vitro method used to mature human embryonic and induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CM) by combining three-dimensional cell cultivation with electrical stimulation. This manuscript presents the detailed setup of the cardiac biowire platform.

نضوج الجذعية البشرية العضلية المشتقة من الخلايا في Biowires باستخدام التنبيه الكهربائي

Human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CMs) have been a promising cell source and have thus encouraged the investigation of their ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled by multiple mechanisms that include the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). The SAC is part of a complex feedback system that is responsible for prevention of a cell progress through mitosis unless all chromosomal kinetochores have attached to spindle microtubules. Chromosomal lagging and abnormal chromosome segregation is an indicator of dysfunctional cell cycle control checkpoints and can be used to measure the genomic stability of dividing cells. Deregulation of the SAC can result in the transformation of a normal cell into a malignant cell through the accumulation of errors during chromosomal segregation. Implementation of the SAC and the formation of the kinetochore complex are tightly regulated by interactions between kinases and phosphatase such as Protein Phosphatase 2A (PP2A). This protocol describes live cell imaging of lagging chromosomes in mouse embryonic fibroblasts isolated from mice that had a knockout of the PP2A-B56&#947; regulatory subunit. This method overcomes the shortcomings of other cell cycle control imaging techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry that only provide a snapshot of a cell cytokinesis status, instead of a dynamic spatiotemporal visualization of chromosomes during mitosis.

This protocol describes an easy and convenient method to label and visualize live chromosomes in mitotic cells using Histone2B-GFP BacMam 2.0 label and a spinning disc confocal microscopy system.

تصوير الخلايا الحية لفصل الكروموسومات أثناء الانقسام

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell types include enzyme-secreting acinar cells, an arborized ductal system responsible for the transportation of enzymes to the gut, and hormone-producing endocrine cells. 
Endocrine beta-cells are the sole cell type in the body that produce insulin to lower blood glucose levels. Diabetes, a disease characterized by a loss or the dysfunction of beta-cells, is reaching epidemic proportions. Thus, it is essential to establish protocols to investigate beta-cell development that can be used for screening purposes to derive the drug and cell-based therapeutics. While the experimental investigation of mouse development is essential, in vivo studies are laborious and time-consuming. Cultured cells provide a more convenient platform for screening; however, they are unable to maintain the cellular diversity, architectural organization, and cellular interactions found in vivo. Thus, it is essential to develop new tools to investigate pancreatic organogenesis and physiology.
Pancreatic epithelial cells develop in the close association with mesenchyme from the onset of organogenesis as cells organize and differentiate into the complex, physiologically competent adult organ. The pancreatic mesenchyme provides important signals for the endocrine development, many of which are not well understood yet, thus difficult to recapitulate during the in vitro culture. Here, we describe a protocol to culture three-dimensional, cellular complex mouse organoids that retain mesenchyme, termed pancreatoids. The e10.5 murine pancreatic bud is dissected, dissociated, and cultured in a scaffold-free environment. These floating cells self-assemble with mesenchyme enveloping the developing pancreatoid and a robust number of endocrine beta-cells developing along with the acinar and the duct cells. This system can be used to study the cell fate determination, structural organization, and morphogenesis, cell-cell interactions during organogenesis, or for the drug, small molecule, or genetic screening.

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Here, we present a protocol to generate insulin expressing 3D murine pancreatoids from free-floating e10.5 dissociated pancreatic progenitors and the associated mesenchyme.

جيل بانكريتويدس التعبير عن الأنسولين خالية من السقالة، ثلاثي الأبعاد من الماوس المتكفل البنكرياس في المختبر

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart after apex resection or cryoinjury, making it an important model organism for heart regeneration study. However, the lack of loss-of-function methods for adult organs has restricted insights into the mechanisms underlying heart regeneration. RNA interference via different delivery systems is a powerful tool for silencing genes in mammalian cells and model organisms. We have previously reported that siRNA-encapsulated nanoparticles successfully enter cells and result in a remarkable gene-specific knockdown in the regenerating adult zebrafish heart. Here, we present a simple, rapid, and efficient protocol for the dendrimer-mediated siRNA delivery and gene-silencing in the regenerating adult zebrafish heart. This method provides an alternative approach for determining gene functions in adult organs in zebrafish and can be extended to other model organisms as well.

It remains a major challenge to develop conditional gene-knockout or effective gene-knockdown in adult zebrafish organs. Here we report a protocol for performing nanoparticle-mediated siRNA gene-silencing in adult zebrafish heart, thus providing a new loss-of-function method for studying adult organs in zebrafish and other model organisms.

SiRNA نانوحبيبات بوساطة إسكات الجينات في قلب الزرد الكبار

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

تصور بالعقدة ولوحة نوتوتشوردال في جاسترولاتينج الأجنة الماوس باستخدام الميكروسكوب الإلكتروني المسح وكله جبل الفلورة

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...