Name: organ culture and whole mount immunofluorescence staining of mouse wolffian ducts
Uploaded: 2017-01-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts at JoVE.com

ونود أن نشكر أعضاء المجموعة الأورام أمراض النساء لقراءة نقدية لهذه المخطوطة. وهذا العمل في جزء يدعمها تمويل من الصحة الوطنية ومجلس البحوث الطبية، والمجلس الأسترالي للأبحاث، ومعهد السرطان في نيو ساوث ويلز (PST). عضو الكنيست هي المستفيدة من جامعة نيوكاسل الدراسات العليا زمالة أبحاث.

أجريت رعاية الحيوان والإجراءات التجريبية وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة الرعاية وأخلاقيات الحيوان من جامعة نيوكاسل، وأكد أن قانون نيو ساوث ويلز الحيوان بحوث، نيو ساوث ويلز الحيوان تنظيم البحوث، ورمز الاسترالي لرعاية و استخدام الحيوانات لأغراض علمية. تمت الموافقة على جميع الإجراءات المتخذة على الفئران عن طريق لجنة الرعاية وأخلاقيات الحيوان من جامعة نيوكاسل. 1. الوقت التزاوج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الزوج 6-8 أسابيع من العمر من الذكور وإناث الفئران فقط قبل نهاية دورة وضح النهار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق من الإناث لوجود المقابس المهبلية الصباح الباكر (في أو قبل 08:00)، كل يوم. ويعتبر اليوم من المكونات 0.5 DPC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأنثى مع المكونات المهبلية في قفص جديد (بدون ذكر) وتسمية تاريخ المكونات. </li></ol> 2. عزل الفأر الجنينية الغدد التناسلية مرتفعات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل embryon الماوسجيم التلال الغدد التناسلية من 15.5 DPC الإناث الحوامل كما هو موضح في 9، مع بعض التعديلات كما هو موضح أدناه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ تشريح قبل الظهر كما في المرة تعتبر الإناث الحوامل للدخول في اليوم التالي من الحمل بعد الظهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضحية 15.5 DPC الإناث الحوامل باستخدام خلع عنق الرحم (أو وفقا للبروتوكول المعتمد من قبل لجنة الأخلاقيات الحيوانية المؤسسية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على الماوس على ظهرها على المناديل الورقية الماصة ورش الجانب البطني من البطن مع الايثانول 70٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع جلد البطن السفلي (الجانب البطني) مع ملقط وجعل شق الوحشي باستخدام مقص جراحي، وتمتد من افتتاح البولي التناسلي حتى النهاية لالقفص الصدري. سحب الجلد نحو رأس الحيوان لفضح البطن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع عضلات البطن مع مقص جراحي لفضح التجويف البريتوني. الاستيلاء على الرحم الحامل مع ملقط فقط فوق عنق الرحم واجراء خفض. الآن رفع الرحم عن طريق الضغط على رس المثانة البولية وقطع في الرباط واسع الرحم تليها تخفيضات في تقاطعات رحمي بوقي الرحم لفصل من المرفق البريتوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الرحم في أنبوب 50 مل تحتوي على الجليد الباردة HBSS (هانك المتوازن محلول الملح). غسل الرحم الحامل بلطف مع الجليد الباردة HBSS لإزالة الدم الزائد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إبقاء الرحم في طبق بتري تحتوي على الجليد الباردة HBSS والحفاظ على الجليد. قطع جدار الرحم وإخراج الأجنة. الحفاظ على الأجنة في طبق بيتري جديدة مع HBSS على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلقاء المناديل الورقية المعقمة نظيفة ووضعها على طبق بيتري جديد. رذاذ الايثانول 70٪ على المناديل الورقية. حافظ على الجنين في هذه المناديل الورقية على الجانب الوحشي وقطع عليه من أسفل البطن باستخدام شفرة معقمة في الاتجاه كما يتضح من الخط المنقط في الشكل 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الجنين على قاعدة الإسفنج العقيمة التي تعلق في العمود الفقري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضعه تحت مجهر تشريحي تشريح وقطع بعناية على طول خط الوسط بطني. إزالة الكبد والأمعاء. نظام الماوس البولي التناسلي (الكلى، الحالب، الخصية، WD، والأسهر) الآن يجب أن تكون واضحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الخصية و WD، ونضع في طبق بتري جديدة مع HBSS، على الجليد. لإخراج WD والخصية، وقطع الأسهر قريبة من حرصه على مجرى البول وخفض الحجز على الجزء السفلي من WD من رسن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجمع الخصيتين وWDS من الأجنة من نفس المجموعة (و يمكن أن يختلف وفقا لخطة تجريبية). </li></ol> 3. ثقافة الجنينية الغدد التناسلية مرتفعات (الشكل 2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المتوسطة لزراعة التلال الغدد التناسلية الجنينية من خلال استكمال DMEM / F12 مع 10٪ FBS (مصل بقري جنيني)، 1٪ البنسلين / الستربتومايسين و 1٪ L-الجلوتامين. تدفئة وسائل الإعلام إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 300 ميكرولتر من وسائل الإعلام لكل بئر من 24 لوحة جيدا ثقافة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأخذ لوحة بيتري الطازجة ووضع قطرة صغيرة من المعقم HBSS على ذلك. وضع غشاء البولي المسار حفر (0.881؛ م) على هذا قطرة من HBSS مع سطح ساطع تواجه HBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضعت باستخدام ملقط نظيفة اثنين WDS والغدد التناسلية على الغشاء (على سطحه خشن، التي تواجه أعلى) وإزالة أكبر قدر ممكن من HBSS باستخدام مناديل معقمة / ورقة ماصة. لا تلمس الأنسجة مع ورقة ماصة للرطوبة؛ خلاف ذلك، فإنه سوف يضر الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضمان أن لا WDS ولا الغدد التناسلية ولمس بعضها البعض. خلاف ذلك، فإنها تلتصق ببعضها البعض أثناء الحضانة لاحقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الغشاء مع الأنسجة في بئر من 24 لوحة جيدا يحتوي على 300 ميكرولتر مستنبت والثقافة لهم في واجهة المتوسطة الهواء. الكثير من مستنبت على النتائج الأغشية في نمو الكيسي من WDS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحة في الحاضنة 37 درجة مئوية، في ظل وجود 5٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير ثقافة المتوسط ​​كل يوم. لتغيير المتوسطة مع ماصة، وإزالة المتوسطة من أول جيدا ثم إضافة 300 ميكرولتر من متوسطة جديدة prewarmed. ملاحظة:لدراسة تأثير مسارات الإشارات المختلفة على WD التشكل، ويمكن أن يضاف المنشطات الكيميائية و / أو مثبطات في التركيزات المطلوبة لمستنبت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة الأنسجة لمدة 3 د. خلال 3 د، WDS محلول التي تم جمعها من 15.5 DPC الجنين تتحول إلى أنابيب الملتوية للغاية (الشكل 3B). إضافة المانع WNT، IWR1، والنتائج في تثبيط WD اللف (الشكل 3C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لحصاد هذه الأنسجة تأخذ طبق بيتري مع الثلج الباردة برنامج تلفزيوني. نقل الغشاء مع الغدد التناسلية مثقف وWD إلى لوحة بيتري. فإن غشاء تطفو على برنامج تلفزيوني. اضغط على غشاء لاغراقها في برنامج تلفزيوني واخراج الغدد التناسلية و WD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الأنسجة مع بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) O / N عند 4 درجات مئوية أو لمدة 1 ساعة على RT. إذا لزم الأمر، واتخاذ الصور الحقل مشرقة من WDS قبل التثبيت. </li></ol> 4. الجامع جبل المناعي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الأنسجة الثابتة 3X مع برنامج تلفزيوني-T (PBS + 1٪تريتون X-100) مع هزاز بطيئة، 10 دقيقة لكل منهما، في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يذوى الأنسجة في سلسلة متدرجة من الايثانول (25٪، 50٪، 75٪ و 100٪)، و 10 دقيقة لكل منهما، في 4 درجات مئوية، مع بطء هزاز (~ 30 دورة في الدقيقة). في هذه الخطوة، والأنسجة ويمكن تخزينها في 4 درجة مئوية في 75٪ من الإيثانول. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتغيير الإيثانول، والحفاظ على الأنسجة دون عائق لمدة 2 دقيقة، والسماح للأنسجة يستقر. إخراج أكبر قدر من طاف وقت ممكن ثم قم بإضافة تركيز أعلى المقبل من الإيثانول. لتجنب أي ضرر للأنسجة، ينبغي للطرف ماصة لا تلمس الأنسجة في أي مرحلة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وبعد الجفاف، وترطيب أنسجة في سلسلة متدرجة من الإيثانول (100٪، 75٪، 50٪ و 25٪)، و 10 دقيقة لكل منهما، في 4 درجات مئوية، مع هزاز بطيئة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الأنسجة مع PBS-T (PBS + 0.1٪ تريتون X-100)، 4X، 20 دقيقة لكل منهما، في RT، مع طيف هزاز (~ 30 دورة في الدقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منع الأنسجة لمدة 1 ساعة على RT مع عازلة تمنع (PBS + 1٪ BSA + 0.2٪ الخالي من الدسم الحليب الجاف مسحوق + 0.3٪ تريتون X-100). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد عملية الشراءص عرقلة، ونقل الأنسجة إلى حل الأجسام المضادة الأولية (المخفف في عرقلة العازلة)، واحتضان O / N عند 4 درجات مئوية مع طيف هزاز (~ 30 دورة في الدقيقة). ووصف التخفيفات من الأجسام المضادة الأولية المستخدمة في جدول المواد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي، وغسل الأنسجة مع PBS-MT (PBS + 2٪ الخالي من الدسم مسحوق الحليب الجاف + 0.5٪ توين-20)، 4X، 30 دقيقة لكل منهما، في RT، مع طيف هزاز (~ 30 دورة في الدقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وبعد هذه الخطوة الغسيل، إضافة الأجسام المضادة الثانوية في التخفيف من 1: 250 (هذه الخطوة تحتاج الأمثل لأجسام مضادة الفردية) في المخزن الحجب واحتضان لمدة 1 ساعة على RT، مع هزاز لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من الآن فصاعدا حفاظ على الأنسجة مغطاة بورق الألمنيوم لمنع التعرض للضوء كما وصفت الأجسام المضادة الثانوية مع fluorophores الحساسة للضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الأنسجة 3X مع برنامج تلفزيوني-T (PBS + 0.1٪ توين-20)، 30 دقيقة لكل منهما، مع هزاز لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الشرائح لتركيب الأنسجة الملون. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لهذا، وقطع زلات غطاء زجاجيإلى شرائح رقيقة باستخدام قلم الماس والعصا قطعتين أحدهما على الآخر على شريحة زجاجية باستخدام المينا الأظافر. جعل اثنين من الحدود والأنسجة مكان ما بين هذه الحدود البلدين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة دابي تحتوي المتوسطة المتزايدة وضعت على زلة غطاء. تطبيق المينا الأظافر في زوايا الغطاء زلة لإصلاحه إلى الشريحة. ملاحظة: الأنسجة هي الآن جاهزة للتصوير. تخزين هذه الشرائح في -20 درجة مئوية. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Joseph, A., Yao, H., Hinton, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+morphogenesis+of+the+Wolffian/epididymal+duct,+more+twists+and+turns.">Development and morphogenesis of the Wolffian/epididymal duct, more twists and turns.</a> Dev Biol. 325, 6-14 (2009).</li><li>Murashima, A., Xu, B., Hinton, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+normal+and+abnormal+development+of+the+Wolffian/epididymal+duct+by+using+transgenic+mice.">Understanding normal and abnormal development of the Wolffian/epididymal duct by using transgenic mice.</a> Asian J Androl. 17, 1-7 (2015).</li><li>Carroll, T. J., Park, J. S., Hayashi, S., Majumdar, A., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt9b+plays+a+central+role+in+the+regulation+of+mesenchymal+to+epithelial+transitions+underlying+organogenesis+of+the+mammalian+urogenital+system.">Wnt9b plays a central role in the regulation of mesenchymal to epithelial transitions underlying organogenesis of the mammalian urogenital system.</a> Dev Cell. 9, 283-292 (2005).</li><li>Kumar, M., Syed, S. M., Taketo, M. M., Tanwar, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+Wnt/&#946;catenin+signalling+is+essential+for+epididymal+coiling.">Epithelial Wnt/&#946;catenin signalling is essential for epididymal coiling.</a> Dev Biol. 412, 234-249 (2016).</li><li>Murashima, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+roles+of+androgen+signaling+in+Wolffian+duct+stabilization+and+epididymal+cell+differentiation.">Essential roles of androgen signaling in Wolffian duct stabilization and epididymal cell differentiation.</a> Endocrinology. 152, 1640-1651 (2011).</li><li>Lin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+and+limitations+of+genetically+modified+mouse+models+in+drug+discovery+and+development.">Applications and limitations of genetically modified mouse models in drug discovery and development.</a> Curr Drug Metab. 9, 419-438 (2008).</li><li>Rak-Raszewska, A., Hauser, P. V., Vainio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+In+Vitro+Culture:+What+Have+We+Learned+about+Early+Kidney+Development?.">Organ In Vitro Culture: What Have We Learned about Early Kidney Development?.</a> Stem Cells Int. 959807, 1-16 (2015).</li><li>Hirashima, T., Adachi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedures+for+the+Quantification+of+Whole-Tissue+Immunofluorescence+Images+Obtained+at+Single-Cell+Resolution+during+Murine+Tubular+Organ+Development.">Procedures for the Quantification of Whole-Tissue Immunofluorescence Images Obtained at Single-Cell Resolution during Murine Tubular Organ Development.</a> PLoS One. 10, 0135343 (2015).</li><li>Chan, W. Y., Blomberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+Development:+Methods+and+Protocols.">Germline Development: Methods and Protocols.</a> Methods Mol Biol. 825, (2012).</li><li>Karner, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tankyrase+Is+Necessary+for+Canonical+Wnt+Signaling+During+Kidney+Development.">Tankyrase Is Necessary for Canonical Wnt Signaling During Kidney Development.</a> Dev Dyn. 239, 2014-2023 (2010).</li><li>Traykova-Brauch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+and+versatile+system+for+acute+and+chronic+modulation+of+renal+tubular+function+in+transgenic+mice.">An efficient and versatile system for acute and chronic modulation of renal tubular function in transgenic mice.</a> Nat Med. 14, 979-984 (2008).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

نظام الثقافة الجهاز لديه العديد من المزايا على خلية نظام الثقافة التقليدية. هذا النظام يحتفظ العلاقات الهيكلية الأصلية والتفاعلات بين أنواع مختلفة من الخلايا. أنه يحاكي في أنظمة الجسم الحي ويعطي معلومات أكثر دقة من دراسات ثقافة الخلية حيث العامل المتخصصة غائب. استخدام أنظمة الثقافة الجهاز حتى يكون من المزايا أكثر من استخدام كل الحيوانات. وتشمل هذه التكلفة المرتفعة لاستخدام الحيوان كله، والرعاية سهلة وصيانة نظام الجهاز ثقافة، الخ وعلاوة على ذلك، ومختلف وكلاء الدوائية أو العقاقير يمكن اختبارها على أجهزة معزولة / مثقف واستجابة مباشرة من الجهاز وليس الجسم كله يمكن أن يكون درس. هناك العديد من الخطوات الهامة التي يجب أخذها في الاعتبار لثقافة ناجحة من WDS الجنينية. يجب جمع الأنسجة بعناية دون الإضرار سلامتها، والأنسجة التالفة التي لا تنمو بشكل جيد وتصبح الكيسي. تزيد من وسائل الإعلام على قمةيؤدي مرشح أيضا لنمو الكيسي من WDS. أجرينا العزلة الأنسجة والثقافة خارج غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة من دون أي تلوث. وقد أعد ثقافة متوسطة وتضاف إلى 24 لوحات جيدة داخل نسيج الثقافة هود. لذلك، وذلك باستخدام الأسلوب السليم، والعمل بسرعة واتخاذ الاحتياطات اللازمة، WDS جمعها خارج النسيج هود الثقافة يمكن أن يكون مثقف دون أي تلوث. في حين حصد الأنسجة مثقف، ينبغي توخي الحذر لأنها هشة جدا، وينبغي ألا أمسك مباشرة مع ملقط. يجب بدلا من ذلك اختار الأنسجة حتى في طبقة رقيقة من برنامج تلفزيوني التي تشكل بين ذراعي من الملقط. وصفناها أيضا كامل إجراءات مفصلة المناعي جبل في هذه المخطوطة. Z كومة التصوير من الأنسجة بعد جبل بأكمله تلطيخ باستخدام المجهر متحد البؤر أو الاستريوسكوبية يعطي ميزة للقسم من خلال النسيج كله دون باجتزاء المسلسل وتلطيخ عدة شرائح. وهكذا، فإنه يعطي فكرة أفضل عنموقع التعبير عن البروتينات المستهدفة. اختراق الأجسام المضادة من الصعب في الأنسجة، مع الألياف عالية / محتوى المصفوفة خارج الخلية مما أدى إلى إشارة أقل. قد يكون أطول permeabilization وزيادة مدة الحضانة مع الأجسام المضادة الأولية تفيد في مثل هذه الحالات. والعيب الآخر من جبل بأكمله تلطيخ هو أن قرار على مستوى خلية واحدة من الصعب تحقيق وقد تحتاج الأهداف الخاصة / المجاهر. أجرينا كلا 1 ساعة و O / N التثبيت في 4٪ PFA وجدت أن هذه الأساليب تعمل بشكل جيد بالنسبة للغالبية من الأجسام المضادة اختباره في المختبر لدينا بما في ذلك CK8، PH3، والأجسام المضادة βcatenin النشطة. ونحن أيضا colocalized بنجاح CK8 مع PH3 أو βcatenin نشطة. لcolocalization، أضيفت الأجسام المضادة الأولية لكلا علامات في وقت واحد. يجب أن تثار هذه الأجسام المضادة في الأنواع المختلفة. أثناء إجراء المناعي جبل كله، ينبغي اتخاذ أقصى درجات الحرص عند إضافة أو إزالة الحلول مثل الأنسجة يمكن أن يكون بسهولة اكبرذ وضعت في ماصة / نقل ماصة وتتعثر في البلاستيك. لتجنب هذا الأمر، تغيير حلول مع 200 ميكرولتر ماصة تحت المجسام أو تشريح المجهر وتترك قليلا من الحل في الجزء السفلي من الأنابيب. ونحن نوصي جمع الحلول النفايات في دورق زجاجي شفاف نظيف. بعد كل تغيير الحل، والاعتماد على عدد من الأنسجة في أنابيب تحت المجسام. في حالة فقدانها من الأنسجة، ويمكن استردادها من كوب زجاجي. نصائح ماصة تستخدم لنقل الحلول ينبغي أن لا تلمس الأنسجة حيث سيؤدي ذلك إلى تلف الأنسجة وترك يجعلها غير صالحة للتصوير. لتركيب WDS الملون، كنا الشرائح تجويف كما وضع coverslips مباشرة على الجزء العلوي من WDS يمكن ضغط عليها وتشويه التشكل. وهذا يتوقف على سمك الأنسجة، وعمق تجويف يمكن التلاعب بها بسهولة من خلال تغيير عدد من شرائط ساترة المستخدمة. هذا الأسلوب من محضرات الشرائحن من الناحية الاقتصادية لأنه يتطلب زلات غطاء الوحيدة وقلم الماس. ويمكن أيضا أن يتم التصوير قبل coverslipping لأنه من السهل لتوجيه وتحريك WDS الملون قبل أن يتم إصلاحها تحت coverslips. مع جبل المناعية كله، والتصوير Z كومة يعطي صورة أفضل وتوفر المزيد من المعلومات. لأخذ الصور من مجموعات العلاج المختلفة، يجب أن تبقى التعرض نفسه.

الجهاز التناسلي الذكري يتكون أساسا من الخصية، موقع لتطوير الخلايا الجرثومية والتمايز، ونظام الأقنية معقدة ما هو مطلوب للنضوج، والنقل، وتخزين الحيوانات المنوية. البربخ هو الجهاز الأنبوبي الذي يصل الخصية مع الأسهر وتشارك بشكل رئيسي في تطوير ما بعد الخصية ونضوج الخلايا الجرثومية 1. البربخ الماوس الكبار ملفوف غاية تتطور من بسيطة ومباشرة أنبوب السلائف، قناة وولف (WD) 1. بنية معقدة وملفوف من البربخ هو ضروري للحيوانات المنوية لاكتساب القدرة على تخصيب خلايا الإناث الجرثومية 2. كيف هذا الجهاز ضروري لخصوبة الرجال يتطور ويحصل في شكل ليست مفهومة جيدا. وقد ثبت مختلف مسارات الإشارات إلى أن تشارك في تطوير WD مثل إشارات Wnt مسار 3،4 والاندروجين إشارات الطريق 5. وقد أنشأت عملنا مؤخرا شرط بالanced WNT يشير لWD اللف خلال تطوير ما قبل الولادة (4). ومع ذلك، هناك حاجة مزيد من الدراسات لفهم الآليات التي تشارك في اللف بعد الولادة بربخي، تمايز الخلايا، والاتصالات خلية إلى خلية داخل الظهارة بربخي ومع خلايا الخلالية. وقد ثبت نماذج الماوس المعدلة وراثيا ليكون أداة قوية لتحديد / التحقق من الآليات الجزيئية الكامنة وراء تطور والمرض من أجهزة الجسم المختلفة 6. وعلى الرغم من الاستخدام الواسع النطاق، وهناك قيود كبيرة من نماذج الماوس المعدلة وراثيا، بما في ذلك النمط الظاهري غير متوقع من المسوخ الماوس المستهدفة فيما يتعلق وظيفة الجين يفترض، وليس النمط الظاهري في المسوخ فارغة في بعض الموديلات، تأثير العوامل الوراثية والبيئية، والعمل المكثف و عملية تطوير نماذج الماوس تستغرق وقتا طويلا. ولذلك، فإن تفسير أهمية النتائج فقط من مودى وراثيانماذج الماوس fied ليست دائما واضحة 6. هذه القيود يمكن التغلب عليها باستخدام في نظام الثقافة الجهاز المختبر الذي يعطي لنا المرونة اللازمة لمعالجة مسارات إشارات متعددة في الوقت الحقيقي في ظروف الثقافة التي تسيطر عليها. نظام الثقافة الجهاز هو دور أساسي في فهم علم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض من أجهزة كاملة 7. وعلاوة على ذلك، والتصوير الأجهزة كلها ملطخة الأجسام المضادة fluorophore المسمى تمكننا من تصور علامات الاهتمام في سياق ثلاثي الأبعاد، كما هو موجود في الجسم الحي، وبالتالي توفير فهم أفضل لشكل الجهاز، وهيكل، وظيفة 8. هنا، التي وصفناها الطرق لعزل الماوس التلال الغدد التناسلية الجنينية، في المختبر الثقافة وجبل بأكمله المناعي التصوير WDS، التي يمكن تطبيقها للرد على مجموعة متنوعة من الأسئلة المتعلقة التشكل من أجهزة أنبوبي مثل WDS. في هذا البروتوكول، ونحنمعزولة الماوس الجنينية التلال البولي التناسلي من 15.5 يوم تال للجماع (DPC) السدود الحوامل ومثقف منهم لمدة 3 د تليها المناعية للعلامة الظهارية خلية (cytokeratin 8، CK8)، علامة تكاثر الخلايا (الفوسفات-هيستون 3، PH3) ونشطة βcatenin.

<table><tbody><tr><td>24-well plates</td><td>Corning, USA</td><td>3524</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>GE Healthcare Life Sciences, USA</td><td>SH30031.02</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)</td><td>Sigma, USA</td><td>D8437</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Interpath,&amp;nbsp; Australia</td><td>SH30034.02</td><td>10% FBS used in culture medium</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>GE Healthcare Life Sciences, USA</td><td>SH30034.01</td><td>1% concentration used</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco, USA</td><td>15070-063</td><td>1% concentration used</td></tr><tr><td>Whatman Nuclepore Polycarbonate Track-Etch&amp;nbsp;</td><td>Whatman, USA</td><td>110409</td><td>Membrane (0.8 &amp;micro;m)</td></tr><tr><td>IWR1</td><td>Sigma, USA</td><td>10161-5mg</td><td>100 &amp;micro;M concentration used</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Electron Microscopy Sciences, USA</td><td>15710</td><td>16% stock, 4% in PBS for use. TOXIC - wear gloves and cannot&lt;br/&gt; be disposed of in the sink</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Thermo Scientific Fisher, USA</td><td>214-20L PL</td><td>Absolute, make 25, 50 and 75% with milliQ water.</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Thermo Scientific Fisher, USA</td><td>2509-500ml</td><td>Very viscous, careful while dispensing</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma, USA</td><td>T8787-50ml</td><td>Very viscous, careful while dispensing</td></tr><tr><td>Di-Sodium Hydrogen Phosphate</td><td>Thermo Scientific Fisher, USA</td><td>621-500mg</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Sodium Di-hydrogen Phosphate</td><td>Ajax Finechem, USA</td><td>4745-500g</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Thermo Scientific Fisher, USA</td><td>465-500g</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Cytokeratin8/Troma I</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank, USA (DHSB)</td><td>TROMA-I</td><td>1:250 in blocking buffer</td></tr><tr><td>active &amp;beta;catenin&amp;nbsp;</td><td>Cell Signalling Technology,&amp;nbsp; USA</td><td>D13A1</td><td>1:200 in blocking buffer</td></tr><tr><td>phospho-Histone 3</td><td>Millipore, MA, USA</td><td>06-570</td><td>1:200 in blocking buffer</td></tr><tr><td>Alexa488 Goat anti-rabbit IgG</td><td>Jackson ImmunoResearchLabs,&amp;nbsp; USA</td><td>111-545-047</td><td>1:250 in blocking buffer</td></tr><tr><td>Alexa594 Goat anti-Rat IgG</td><td>Jackson ImmunoResearchLabs,&amp;nbsp; USA</td><td>112-585-072</td><td>1:250 in blocking buffer</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>242-500ml</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>n-Propyl galate</td><td>Sigma, USA</td><td>2370</td><td>-</td></tr><tr><td>2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine (DAPI)</td><td>Sigma, USA</td><td>D9564-10mg</td><td>Use to stain nucleic acids (DNA)</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>2225-500ml</td><td>Solvent</td></tr><tr><td>Cover Slips (24 x 50 mm)</td><td>Lomb Scientific</td><td>CS24501GP</td><td>-</td></tr></tbody></table>

organ culture and whole mount immunofluorescence staining of mouse wolffian ducts

التشكل البوق هو شرط أساسي لتنمية معظم أجهزة الثدييات، بما في ذلك الجهاز التناسلي الذكري. البربخ، جزءا لا يتجزأ من الجهاز التناسلي الذكري، هو المسؤول عن تخزين الحيوانات المنوية، والنضج، والنقل. البربخ الكبار هو أنبوب ملفوف جدا أن يتطور من السلائف الجنينية بسيطة ومباشرة والمعروفة باسم قناة وولف (WD). اللف السليم من البربخ هو ضروري لخصوبة الرجال، كما الحيوانات المنوية في الخصية غير قادرين على تخصيب بويضة. ومع ذلك، فإن الآلية المسؤولة عن التنمية بربخي واللف لا تزال غير واضحة، ويرجع ذلك جزئيا إلى عدم وجود طرق الثقافة الجهاز والتصوير كله. في هذه الدراسة، ونحن تصف نظام الثقافة في المختبر، وكله بروتوكول المناعي جبل لتصور أفضل لعملية WD اللف والتنمية، والتي يمكن أيضا أن تطبق على دراسة أجهزة الأنبوبية الأخرى.

خلال التنمية، وWD يخضع لتغيرات كبيرة حيث يتم تحويل أنبوب بسيط ومستقيم إلى قناة معقدة للغاية وملفوف. استخدام الأساليب المذكورة أعلاه، WDS يخضع لعملية تحول مماثل في ظروف الثقافة. هنا نحن أظهرت النتائج من WDS تربيتها لمدة 3 د (الشكل 3). لتشريح الآليات الجزيئية المشاركة في WD التشكل، مستنبت يمكن أن تستكمل مع مثبطات ومنشطات تستهدف مسارات الإشارات المختلفة. ويبين الشكل 3C محلول WD بعد 3 د للثقافة في وجود إشارات Wnt المانع محددة، IWR1 10. السهام نحتفل ملفات (الشكل 3B) ومحلول WDS (أرقام 3A و C) مما يدل على أن قمع النتائج إشارات WNT في تثبيط WD اللف (الشكل 3C). وبالتالي، فإن هذا النظام يمكن استخدام الثقافة لتشريح الآليات الجزيئية المعنية خلال جمعةاإلمنائية من WDS (أو أجهزة أخرى). لتسمية أنواع مختلفة من الخلايا، أجرينا جبل بأكمله المناعية على WDS (الشكل 4). نحن هنا تقديم بيانات التحقق من صحة استخدام هذا البروتوكول لوضع العلامات هيكل الخلية، حشوية، والبروتينات النووية. يمثل الشكل 4A cytokeratin 8 (CK8، وهو علامة من الخلايا الظهارية) المناعية من WDS (تميزت سهم) مثقف لمدة ثلاثة أيام. لقد طبقنا أيضا نفس البروتوكول لتقييم انتشار الخلايا المناعية التي كتبها لPH3 (الفوسفات-هيستون 3، علامة تكاثر الخلايا). ويبين الشكل 4B صورة ممثل PH3 جبل بأكمله المناعية. النقاط الخضراء تميزت سهم تمثل PH3 إيجابية الخلايا وبالتالي المتكاثرة. الشكل 4C يظهر المناعية لالنشط β-كاتينين على WDS المعزولة حديثا من 18.5 أجنة الفئران شركة ظفار. سيطرة سلبية (مراقبة مفتش) في الشكل 4D تظهر أي تلطيخ. هذه النتائج الضوءمتانة هذا كله بروتوكول جبل المناعية، والتي يمكن أن تستخدم أيضا لكثير من الأجسام المضادة المختلفة. <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/55134/55134fig1.jpg" /> الشكل 1. رسم توضيحي لموقع شق لعزل الغدد التناسلية الجنينية من 15.5 DPC الجنين. يمثل خط منقط أبيض الموقع لإجراء شق في جنين 15.5 شركة ظفار لعزل التلال البولية التناسلية. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55134/55134fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/55134/55134fig2.jpg" /> الشكل 2. مخطط تدفق يصف إجراءات التدريجية للثقافة الجهاز. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55134/55134fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لالسادس</a>EW نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/55134/55134fig3.jpg" /> الرقم 3. عادي WD التشكل في ظروف الثقافة. (أ) خصية وWD معزولة عن 15.5 DPC الجنين. (ب) ملفوف WD بعد 3 الثقافة د بحضور DMSO (مراقبة). وقد لوحظ (C) لا WD اللف مع العلاج IWR1 (مثبط WNT). يمثل السهم WD. ر، يمثل الخصية. الحانات تساوي 100 ميكرون. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55134/55134fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/55134/55134fig4.jpg" /> الشكل 4. الجامع جبل immunolabeling من WDS. (A - B) كامل جبل المناعية من WDS ايزولاتيد من 15.5 الأجنة DPC وتربيتها لمدة 3 د لCK8 (A) وPH3 (B). (C) أحدث βcatenin جبل بأكمله المناعي على WD عزل من 18.5 DPC الجنين. (D) السيطرة السلبية (مراقبة مفتش) لβcatenin نشطة على 18.5 DPC WD تظهر أي تلطيخ. السهم علامات ملفوف WD. ر، يمثل الخصية. الحانات تساوي 100 ميكرون. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55134/55134fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts at JoVE.com

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

ونحن نقدم وسيلة لعزل وثقافة قناة وولف الماوس (WD). نحن أيضا يبرهن على وجود إجراءات مفصلة لجبل بأكمله المناعية من WDS مثقف / المعزولة حديثا مع الأجسام المضادة الموسومة fluorescently. معا، وتمكن هذه التقنيات دراسة التطور WD، اللف، والتمايز.

هيئة الثقافة والجامع جبل المناعي تلون ماوس وولف القنوات

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

organ-culture-whole-mount-immunofluorescence-staining-mouse-wolffian

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.7K Views.  University of Newcastle.  ونحن نقدم وسيلة لعزل وثقافة قناة وولف الماوس (WD). نحن أيضا يبرهن على وجود إجراءات مفصلة لجبل بأكمله المناعية من WDS مثقف / المعزولة حديثا مع الأجسام المضادة الموسومة fluorescently. معا، وتمكن هذه التقنيات دراسة التطور WD، اللف، والتمايز. 

Video: Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop within the uterus. A newly developed ex vivo upright droplet culture method provides an attractive alternative to studies performed in utero. The ex vivo droplet culture provides the ability to examine and manipulate cellular interactions and diverse signaling pathways through use of various blocking and activating compounds; additionally, the effects of various pharmacological reagents on the development of specific organs can be studied without unwanted side effects of systemic drug delivery in utero. As compared to other in vitro systems, the droplet culture not only allows for the ability to study three-dimensional morphogenesis and cell-cell interactions, which cannot be reproduced in mammalian cell lines, but also requires significantly less reagents than other ex vivo and in vitro protocols. This paper demonstrates proper mouse fetal organ dissection and upright droplet culture techniques, followed by whole organ immunofluorescence to demonstrate the effectiveness of the method. The ex vivo droplet culture method allows the formation of organ architecture comparable to what is observed in vivo and can be utilized to study otherwise difficult-to-study processes due to embryonic lethality in in vivo models. As a model application system, a small-molecule inhibitor will be utilized to probe the role of vascularization in testicular morphogenesis. This ex vivo droplet culture method is expandable to other fetal organ systems, such as lung and potentially others, although each organ must be extensively studied to determine any organ-specific modifications to the protocol. This organ culture system provides flexibility in experimentation with fetal organs, and results obtained using this technique will help researchers gain insights into fetal development.

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

The&#160;ex vivo&#160;upright droplet culture is an alternative to current&#160;in vitro&#160;and&#160;in vivo&#160;experimental techniques. This protocol is easy to perform and requires smaller amounts of reagent, while permitting the ability to manipulate and study fetal vascularization, morphogenesis, and organogenesis.

باستخدام<em&gt; السابقين فيفو</em&gt; الثقافات تستقيم القطرة من الجامعة الجنين هيئات لدراسة العمليات التنموية خلال الماوس توالد

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate cancer (PCa). Understanding the anatomy and histology of the mouse prostate is important for the efficient use and proper characterization of such animal models. The mouse prostate has four distinct pairs of lobes, each with their own characteristics. This article demonstrates the proper method of dissection and identification of mouse prostate lobes for disease analysis. Post-dissection, the prostate cells can be further cultured in vitro for mechanistic understanding. Since mouse prostate primary cells tend to lose their normal characteristics when cultured in vitro, we outline here a method for isolating the cells and growing them as 3D spheroid cultures, which is effective for preserving the physiological characteristics of the cells. These 3D cultures can be used for analyzing cell morphology and behavior in near-physiological conditions, investigating altered levels and localizations of key proteins and pathways involved in the development and progression of a disease, and looking at responses to drug treatments.

Genetically engineered mice are useful models for investigating prostate cancer mechanisms. Here we present a protocol to identify and dissect prostate lobes from a mouse urogenital system, differentiate them based on histology, and isolate and culture the primary prostate cells in vitro as spheroids for downstream analyses.

تحديد وتوصيف النسيجي، وتشريح للماوس الفصوص البروستاتا لفي المختبر كروي 3D نماذج الثقافة

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate ...

Cancer Research

Three-Dimensional Imaging of Organoids to Study Primary Ciliogenesis During ex vivo Organogenesis

Organoids are stem cell-derived three-dimensional structures that reproduce ex vivo the complex architecture and physiology of organs. Thus, organoids represent useful models to study the mechanisms that control stem cell self-renewal and differentiation in mammals, including primary ciliogenesis and ciliary signaling. Primary ciliogenesis is the dynamic process of assembling the primary cilium, a key cell signaling center that controls stem cell self-renewal and/or differentiation in various tissues. Here we present a comprehensive protocol for the immunofluorescence staining of cell lineage and primary cilia markers, in whole-mount mouse mammary organoids, for light sheet microscopy. We describe the microscopy imaging method and an image processing technique for the quantitative analysis of primary cilium assembly and length in organoids. This protocol enables a precise analysis of primary cilia in complex three-dimensional structures at the single cell level. This method is applicable for immunofluorescence staining and imaging of primary cilia and ciliary signaling in mammary organoids derived from normal and genetically modified stem cells, from healthy and pathological tissues, to study the biology of the primary cilium in health and disease.

Three-Dimensional Imaging of Organoids to Study Primary Ciliogenesis During ex vivo Organogenesis

Stem cell-derived organoids facilitate the analysis of molecular and cellular processes that regulate stem cell self-renewal and differentiation during organogenesis in mammalian tissues. Here we present a protocol for the analysis of the biology of the primary cilium in mouse mammary organoids.

Organoids are stem cell-derived three-dimensional structures that reproduce ex vivo the complex architecture and physiology of organs. Thus, organoids ...

Genetics

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ovarian fitness is often assessed by visualizing and quantifying follicles and oocytes. Because the ovary is an opaque three-dimensional tissue, traditional approaches require laboriously slicing the tissue into numerous serial sections in order to visualize cells throughout the entire organ. Furthermore, because quantification by this method typically entails scoring only a subset of the sections separated by the approximate diameter of an oocyte, it is prone to inaccuracy. Here, a protocol is described that instead utilizes whole organ tissue clearing and immunofluorescence staining of mouse ovaries to visualize follicles and oocytes. Compared to more traditional approaches, this protocol is advantageous for visualizing cells within the ovary for numerous reasons: 1) the ovary remains intact throughout sample preparation and processing; 2) small ovaries, which are difficult to section, can be examined with ease; 3) cellular quantification is more readily and accurately achieved; and 4) the whole organ imaged.

Here, we present a protocol to quantify follicles in cultured ovaries of young mice without serial sectioning. Using whole organ immunofluorescence and tissue clearing, physical sectioning is replaced with optical sectioning. This method of sample preparation and visualization maintains organ integrity and facilitates automated quantification of specific cells.

كله جبل الفلورة وتقدير جريب المبايض الماوس مثقف

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed in order to create testicular organoids. Many of these methods rely upon extracellular matrix (ECM) to promote de novo tissue assembly, however, there are differences between methods in terms of biomimetic morphology and function of tissues. Moreover, there are few direct comparisons of published methods. Here, a direct comparison is made by studying differences in organoid generation protocols, with provided outcomes. Four archetypal generation methods: (1) 2D ECM-free, (2) 2D ECM, (3) 3D ECM-free, and (4) 3D ECM culture are described. Three primary benchmarks were used to assess the testicular organoid generation. These are cellular self-assembly, inclusion of major cell types (Sertoli, Leydig, germ, and peritubular cells), and appropriately compartmentalized tissue architecture. Of the four environments tested, 2D ECM and 3D ECM-free cultures generated organoids with internal morphologies most similar to native testes, including the de novo compartmentalization of tubular versus interstitial cell types, the development of tubule-like-structures, and an established long-term endocrine function. All methods studied utilized unsorted, primary murine testicular cell suspensions and used commonly accessible culture resources. These testicular organoid generation techniques provide a highly accessible and reproducible toolkit for research initiatives into testicular organogenesis and physiology in vitro.

Here, four methods for generating testicular organoids from primary neonatal murine testicular cells are described i.e., extracellular matrix (ECM) and ECM-free 2D and 3D culture environments. These techniques have multiple research applications and are especially useful for studying testicular development and physiology in vitro.

إضافية الخلوية مصفوفة المستندة إلى و اضافية الخلية مصفوفة خالية جيل من الخصية مورين

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed ...

Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses

Spermatogenesis is a unique differentiation process that ultimately gives rise to one of the most distinct cell types of the body, the sperm. Differentiation of germ cells takes place in the cytoplasmic pockets of somatic Sertoli cells that host 4 to 5 generations of germ cells simultaneously and coordinate and synchronize their development. Therefore, the composition of germ cell types within a cross-section is constant, and these cell associations are also known as stages (I&#8211;XII) of the seminiferous epithelial cycle. Importantly, stages can also be identified from intact seminiferous tubules based on their differential light absorption/scatter characteristics revealed by transillumination, and the fact that the stages follow each other along the tubule in a numerical order. This article describes a transillumination-assisted microdissection method for the isolation of seminiferous tubule segments representing specific stages of mouse seminiferous epithelial cycle. The light absorption pattern of seminiferous tubules is first inspected under a dissection microscope, and then tubule segments representing specific stages are cut and used for downstream applications. Here we describe immunostaining protocols for stage-specific squash preparations and for intact tubule segments. This method allows a researcher to focus on biological events taking place at specific phases of spermatogenesis, thus providing a unique tool for developmental, toxicological, and cytological studies of spermatogenesis and underlying molecular mechanisms.

This protocol describes transillumination-assisted microdissection of segments of adult mouse seminiferous tubules representing specific stages of seminiferous epithelial cycle, and cell types therein, and subsequent immunostaining of squash preparations and intact tubule segments.

التسلخ المُساعد للتنقية في مراحل محددة من دورة الظهارة الظهارية شبه المائلة للماوس لتحليلات المناعة المصبية

Spermatogenesis is a unique differentiation process that ultimately gives rise to one of the most distinct cell types of the body, the sperm. ...

Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells entering meiotic prophase I are eliminated during Fetal Oocyte Attrition (FOA) and the first week of postnatal life. Three major mechanisms regulate the number of oocytes that survive during development and establish the ovarian reserve in females entering puberty. In the first wave of oocyte loss, 30-50% of the oocytes are eliminated during early FOA, a phenomenon that is attributed to high Long interspersed nuclear element-1 (LINE-1) expression. The second wave of oocyte loss is the elimination of oocytes with meiotic defects by a meiotic quality checkpoint. The third wave of oocyte loss occurs perinatally during primordial follicle formation when some oocytes fail to form follicles. It remains unclear what regulates each of these three waves of oocyte loss and how they shape the ovarian reserve in either mice or humans.
Immunofluorescence and 3D visualization have opened a new avenue to image and analyze oocyte development in the context of the whole ovary rather than in less informative 2D sections. This article provides a comprehensive protocol for whole ovary immunostaining and optical clearing, yielding preparations for imaging using multiphoton microscopy and 3D modeling using commercially available software. It shows how this method can be used to show the dynamics of oocyte attrition during ovarian development in C57BL/6J mice and quantify oocyte loss during the three waves of oocyte elimination. This protocol can be applied to prenatal and early postnatal ovaries for oocyte visualization and quantification, as well as other quantitative approaches. Importantly, the protocol was strategically developed to accommodate high-throughput, reliable, and repeatable processing that can meet the needs in toxicology, clinical diagnostics, and genomic assays of ovarian function.

Here, we present an optimized protocol for imaging entire ovaries for quantitative and qualitative analyses using whole-mount immunostaining, multiphoton microscopy, and 3D visualization and analysis. This protocol accommodates high-throughput, reliable, and repeatable processing that is applicable for toxicology, clinical diagnostics, and genomic assays of ovarian function.

التألق المناعي للمبيض الكامل ، والمقاصة ، والمجهر متعدد الفوتونات للتحليل الكمي 3D لاحتياطي المبيض النامي في الفأر

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

جبل كله تشريح والمناعي من الكبار ماوس القوقعة

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Neuroscience

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

نظام الثقافة الماوس الجنين الأمعاء الجامعة ل<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; التلاعب في مسارات إشارات وتصوير لايف ثلاثي الأبعاد التنمية الزغبة

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

Biology

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal architecture. Here, a small pocket below the skin was created using Mayo scissors, allowing separation of the glands within the subcutaneous tissue from the underlying peritoneum. Visualization of the glands was aided by the use of 3.5x-R surgical micro loupes. The pelt was inverted and pinned back allowing identification of the intact mammary fat pads. Each of the #4 abdominal glands was bluntly dissected by sliding the scalpel blade laterally between the subcutaneous layer and the glands. Immediately post-harvest, glands were placed in 10% neutral buffered formalin for subsequent tissue processing. Excision of the entire gland is advantageous because it primarily eliminates the risk of excluding important tissue-wide interactions between ductal epithelial cells and other microenvironmental cellular populations that could be missed in a partial biopsy. One drawback of the methodology is the use of serial sections from fixed tissues which limits analyses of ductal morphogenesis and protein expression to discrete locations within the gland. As such, changes in ductal architecture and protein expression in 3 dimensions (3D) is not readily obtainable. Overall, the technique is applicable to studies requiring whole intact murine mammary glands for downstream investigations such as developmental ductal morphogenesis or breast cancer.

Here, we present a protocol for the isolation of whole, intact mouse mammary glands to investigate extracellular matrix (ECM) expression and ductal morphology. Mouse #4 abdominal glands were extracted from 8-10 week old female nulliparous mice, fixed in neutral buffered formalin, sectioned and stained using immunohistochemistry for ECM proteins.

عزل الغدد الثديية الماوس سليمة، وكلها لتحليل التعبير المصفوفة خارج الخلية ومورفولوجية الغدة

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

هيئة الثقافة والجامع جبل المناعي تلون ماوس وولف القنوات

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

باستخدام

تحديد وتوصيف النسيجي، وتشريح للماوس الفصوص البروستاتا لفي المختبر كروي 3D نماذج الثقافة

Three-Dimensional Imaging of Organoids to Study Primary Ciliogenesis During ex vivo Organogenesis

كله جبل الفلورة وتقدير جريب المبايض الماوس مثقف

إضافية الخلوية مصفوفة المستندة إلى و اضافية الخلية مصفوفة خالية جيل من الخصية مورين

التسلخ المُساعد للتنقية في مراحل محددة من دورة الظهارة الظهارية شبه المائلة للماوس لتحليلات المناعة المصبية

التألق المناعي للمبيض الكامل ، والمقاصة ، والمجهر متعدد الفوتونات للتحليل الكمي 3D لاحتياطي المبيض النامي في الفأر

جبل كله تشريح والمناعي من الكبار ماوس القوقعة

نظام الثقافة الماوس الجنين الأمعاء الجامعة ل

عزل الغدد الثديية الماوس سليمة، وكلها لتحليل التعبير المصفوفة خارج الخلية ومورفولوجية الغدة