The authors thank Gilberto Morales for fish care and maintenance, and Drs. Claudia Rivera and Hector Malag&#242;n (IFC-UNAM Animal Facility) for their help in rabbit immunization. This work was supported by grants from CONACYT 131226 and PAPIIT-DGAPA-UNAM IN204916.

تمت الموافقة على جميع التجارب التي أجريت على الحيوانات من قبل لجنة رعاية الحيوان المعملية واستخدام الجامعة الوطنية المستقلة في المكسيك (UNAM)، تحت رقم CICUAL-البروتوكول: FLC40-14. (CICUAL: &quot;COMITE Institucional الفقرة شرم CUIDADO ذ الالتزام بتعميم الخدمات دي لوس Animales دي ابوراتوريو ديل معهد Fisiologìa متنقل، الجامعة الوطنية المستقلة للمكسيك&quot;). 1. إعداد استخراج الجنين البروتين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع 100-200 الأجنة لكل حالة للمقارنة (morphants مقابل النوع البري) في المرحلة المطلوبة، على سبيل المثال 72 ساعة بعد الإخصاب (HPF). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الأجنة في أطباق بتري تحتوي على أسماك المياه (انظر الجدول 1) وdechorionate أجنة باستخدام ملقط غرامة الرؤوس يدويا. تجنب استخدام pronase خلال هذه الخطوة (أو أي البروتيني الآخرين في جميع أنحاء بروتوكول) لأنها قد هضم مستقبلات المستهدفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الأجنة في أنبوب 1.5 مل microfuge وغسل الأجنة TWالجليد مع حل العازلة 1X الفوسفات (PBS) (انظر الجدول 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 500 ميكرولتر من العازلة deyolk (انظر الجدول 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إطلاق سراح أكثر من صفار قبل pipetting بلطف صعودا وهبوطا (حوالي 30 - 40 مرة) الأجنة في الحل. لمدة 72 HPF و 48 الأجنة HPF استخدام الأزرق والأصفر نصائح ماصة، على التوالي. قد تحتاج إلى خفض قليلا لتجنب تدمير الأجنة نصائح الصفراء. الإفراج صفار ناجحة يمكن التحقق من خلال مراقبة الأجنة تحت المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الأجنة عن طريق الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 15 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف بعناية باستخدام الماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الأجنة مرتين مع 500 العازلة غسل ميكرولتر (انظر الجدول 1) قبل vortexing بلطف على أقل سرعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الأجنة عن طريق الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 15 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدءا من هنا، ومواصلة الإجراء في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف بعناية باستخدام الماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأجنة resuspend في 350 ميكرولتر من تحلل العازلة (انظر الجدول 1) والتجانس باستخدام مدقة البلاستيكية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الأجنة هي lysed 30 دقيقة مع التحريض على الكرسي الهزاز أنبوب اختبار في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هي lysed الطرد المركزي الأجنة في 11000 x ج لمدة 15 دقيقة من أجل إزالة الحطام غير قابلة للذوبان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل مسح طاف باستخدام الماصة لأنبوب جديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد البروتين الكلي من قبل برادفورد البروتين فحص 4، أو غيرها من الإجراءات المناسبة. إذا تم استخدام برادفورد مقايسة، نفذ منحنى المعايرة في وجود تركيزات ما يعادل المنظفات يعرض في المخزن المؤقت تحلل، لأنها تتسبب في التقليل من البروتين القياسية 4. </li></ol> 2. الكشف عن البروتين الذاتية مستقبلات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقارب وصفها ومناعي (كل هذه الخطوات في 4 درجة مئوية) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع 400-500 ميكروغرام من البروتين الكلي الجنين في أنبوب 1.5 مل microfuge وتمييع إلى 1 ميكروغرام / ميكرولتر مع العازلة 1 (انظر الجدول 1). ملاحظة: من أجل الحصول على 500 ميكروغرام من البروتين الكلي جنين، حوالي 100-200 الأجنة يجب أن تتم معالجتها في البداية. 72 HPF الأجنة تسفر بشكل روتيني ~ 5 ميكروغرام من البروتين الكلي الجنين، وهو ما يكفي لكشف betaglycan. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى حجم ما يكفي من المسمى الأسهم TGF-β2 للوصول إلى تركيز النهائي من 150 م واحتضان مع الإثارة في أنبوب اختبار الروك 2 ساعة عند 4 درجات مئوية. يجب أن يكون المسمى TGF-β2 قبل بدء AFLIP، مع 125 أنا من طريقة تي الكلورامين كما وصفها Cheifetz وآخرون. 5. تنبيه: استخدام وقائية للحد من التعرض أثناء التعامل مع 125 أنا المسمى يجند. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى حجم ما يكفي من الأجسام المضادة غير مخفف ضد مستقبلات الفائدة من أجل التوصل إلى التخفيف 1: 100 وتستمر الحضانة لمدة 2 ساعة أخرى في 4 درجات مئوية (قد تكون حضانة O / N). هذا هو تخفيف الأمثل للمصل رقم 31، وتستخدم في هذه الدراسة، ووصف أماكن أخرى 3، ولكن هذا يتوقف على نوعية علىtibody، قد يكون تخفيف أكبر أو أصغر الأمثل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 ميكرولتر من الخرز ملزمة المناعي مناسب (على سبيل المثال، G-البروتين سيفاروز، الذي سبق معايرتها في TNTE ومعلق 1: 5 من حجمه الأصلي في TNTE)، واحتضان لمدة 50 دقيقة مع التحريض على الكرسي الهزاز أنبوب اختبار في 4 درجات C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استرداد الخرز التي microcentrifugation في 11000 x ج لمدة 20 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف في حاوية القمامة المشعة المناسبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل حبات IP ثلاث مرات مع 1 مل من غسل العازلة IP (انظر الجدول 1)، قبل vortexing وmicrocentrifugation في 11000 x ج لمدة 20 ثانية في كل مرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> و resuspend IP-الخرز في 250 ميكرولتر من غسل العازلة IP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1.5 ميكرولتر من disuccinimidyl suberate (مفاجآت صيف دبي، وحلت في DMSO في 10 ملغ / مل). إعداد الحل مفاجآت صيف دبي قبل استخدامه في هذه الخطوة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية مع الإثارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل إخماد رد فعل يشابك، إضافة 500 ميكرولتر سغسل العازلة و IP، على أن تستكمل مع ما يكفي من الأسهم تريس الكلورين ودرجة الحموضة 7.4 لتصل إلى 25 ملي تريس الكلورين. المجموعات الأمينية الحرة في تريس التقاط DSS غير المتفاعل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 11000 x ج لمدة 20 ثانية لجمع IP-الخرز وتجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> و resuspend IP-الخرز في 30 ميكرولتر من الحد عازلة Laemmli. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات يغلي مدة 5 دقائق في 94 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياريا، تحليل العينات في عداد جاما باستخدام بروتوكول الشركة الصانعة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل عينة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العينات تخضع لتغيير طبيعة SDS-PAGE. استخدام بولي أكريلاميد في نسبة ملائمة لكتلة المستقبل وتشغيل هلام تحت الإجراء العادي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج جل في حل تثبيتي (انظر الجدول 1) لمدة 30 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل هلام مع المياه المقطرة لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الجل في ورق الترشيح رطب سابقا، وتغطي مع فيلم ساران التفاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هلام الجافة في 80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فضح الجل على أفلام ا phosphorimager الأبيضأون في RT O / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مسح الشاشة يتعرض باستخدام phosphorimager باستخدام بروتوكول الشركة الصانعة. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>L&#243;pez-Casillas, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+expression+of+the+membrane+proteoglycan+betaglycan,+a+component+of+the+TGF-&#946;+receptor+system.">Structure and expression of the membrane proteoglycan betaglycan, a component of the TGF-&#946; receptor system.</a> Cell. 67 (4), 785-795 (1991).</li><li>Cheifetz, S., Andres, J. L., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transforming+growth+factor-beta+receptor+type+III+is+a+membrane+proteoglycan.+Domain+structure+of+the+receptor.">The transforming growth factor-beta receptor type III is a membrane proteoglycan. Domain structure of the receptor.</a> J. Biol. Chem. 263 (32), 16984-16991 (1988).</li><li>Kamaid, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Betaglycan+knock-down+causes+embryonic+angiogenesis+defects+in+zebrafish.">Betaglycan knock-down causes embryonic angiogenesis defects in zebrafish.</a> Genesis. 53, 583-603 (2015).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rapid+and+Sensitive+Method+for+the+Quantitation+of+Microgram+Quantities+of+Protein+Utilizing+the+Principle+of+Protein-Dye+Binding.">A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li><li>Cheifetz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+transforming+growth+factor-b+receptor+subsets+as+determinants+of+cellular+responsiveness+to+three+TGF-b+isoforms.">Distinct transforming growth factor-b receptor subsets as determinants of cellular responsiveness to three TGF-b isoforms.</a> J. Biol. Chem. 265, 20533-20538 (1990).</li><li>L&#243;pez-Casillas, F., Wrana, J. L., Massagu&#233;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Betaglycan+presents+ligand+to+the+TGF&#946;+signaling+receptor.">Betaglycan presents ligand to the TGF&#946; signaling receptor.</a> Cell. 73 (7), 1435-1444 (1993).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> PNAS USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Maccari, F., Volpi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+and+specific+recognition+of+glycosaminoglycans+by+antibodies+after+their+separation+by+agarose+gel+electrophoresis+and+blotting+on+cetylpyridinium+chloride-treated+nitrocellulose+membranes.">Direct and specific recognition of glycosaminoglycans by antibodies after their separation by agarose gel electrophoresis and blotting on cetylpyridinium chloride-treated nitrocellulose membranes.</a> Electrophoresis. 24 (9), 1347-1352 (2003).</li><li>Volpi, N., Maccari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosaminoglycan+blotting+and+detection+after+electrophoresis+separation.">Glycosaminoglycan blotting and detection after electrophoresis separation.</a> Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 1312, 119-127 (2015).</li><li>Guesdon, J. L., Ternynck, T., Avrameas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+avidin-biotin+interaction+in+immunoenzymatic+techniques.">The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques.</a> J Histochem Cytochem. 27 (8), 1131-1139 (1979).</li><li>Bratthauer, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+avidin-biotin+complex+(ABC)+method+and+other+avidin-biotin+binding+methods.">The avidin-biotin complex (ABC) method and other avidin-biotin binding methods.</a> Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 588, 257-270 (2010).</li><li>Heimer, R., Molinaro, L., Sampson, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+by+125I-cationized+cytochrome+c+of+proteoglycans+and+glycosaminoglycans+immobilized+on+unmodified+and+on+positively+charged+Nylon+66.">Detection by 125I-cationized cytochrome c of proteoglycans and glycosaminoglycans immobilized on unmodified and on positively charged Nylon 66.</a> Anal. Biochem. 165 (2), 448-455 (1987).</li><li>Das, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+radiolabeling+of+a+cell+surface+receptor+for+epidermal+growth+factor.">Specific radiolabeling of a cell surface receptor for epidermal growth factor.</a> PNAS USA. 74 (7), 2790-2794 (1977).</li><li>Massague, J., Guillette, B., Czech, M., Morgan, C., Bradshaw, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+nerve+growth+factor+receptor+protein+in+sympathetic+ganglia+membranes+by+affinity+labeling.">Identification of a nerve growth factor receptor protein in sympathetic ganglia membranes by affinity labeling.</a> J. Biol. Chem. 256 (18), 9419-9424 (1981).</li><li>Massague, J., Pilch, P. F., Czech, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+resolution+of+three+major+insulin+receptor+structures+with+unique+subunit+stoichiometries.">Electrophoretic resolution of three major insulin receptor structures with unique subunit stoichiometries.</a> PNAS USA. 77 (12), 7137-7141 (1980).</li><li>Hoosein, N. M., Gurd, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Glucagon+Receptors+in+Rat+Brain.">Identification of Glucagon Receptors in Rat Brain.</a> PNAS USA. 81, 4368-4372 (1984).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

استخدام البقع الغربية مع الأجسام المضادة المحددة ضد بروتين من الفائدة هو أداة قيمة لدراسة التعبير عنها 7 خلال مرحلة التطور الجنيني. ومع ذلك، لم يكن immunoblotting من البروتينات عالية الغليكوزيلاتي ناجحة للغاية نظرا لنقلهم عدم الكفاءة وضعف ملزم لالنيتروسليلوز أو PVDF الأغشية 8،9. البروتيوغليكان هي مثال جيد على هذا القصور، بسبب قيودهم تعلق تساهمي جلايكان (GAG) التي يتم سالبة الشحنة ولا تربط جيدا إما السطوح البوليسترين أو الأغشية النشاف مسعور. أيضا، حجم تجانس السلاسل GAG &quot;ينتشر&quot; البروتين أكثر من قطاع من هلام، والحد بشكل فعال مبلغها في منطقة وصمة عار. وبالإضافة إلى ذلك، إذا كان البروتين من الفائدة لديها مستويات منخفضة من التعبير، وكشف من خلال البقع الغربية العادية هي مهمة صعبة. عامل النمو التحويلي النوع الثالث β مستقبلات (TGFBR3) أو betaglycan(BG)، ومستقبلات الغشاء مع موقعين مرفق GAG في الثدييات (1) واحد في الزرد 3، لديه كل هذه الخصائص. وعلى الرغم من بروتوكولات للتغلب على هذه العقبات وقد وضعت، مثل الكشف عن طريق معقد (ABC) نظام أفيدين البيوتين 10،11 أو immunobloting بروتيوغليكان على الأغشية موجبة 12، فإنها لا يمكن حل المشاكل على حد سواء في نفس البروتوكول. الاستفادة من قابلية عالية للBG لليجند الطبيعي TGFβ2 وتوافر الأجسام المضادة المحددة، AFLIP، وهي تقنية تجمع بين مزايا وضع العلامات تقارب ومناعي، والتي نوقشت أعلاه يمكن التغلب على القيود المفروضة على الكشف عن لطخة غربية. وضع العلامات تقارب مستقبلات غشاء محدد مع بروابط بهم رديولبلد هو أداة تستخدم جيدا أن قامت بدور فعال لتحديد وتوصيف العديد من نمو المهم العوامل المستقبلات في الخلايا المستزرعة 13-16.في حين تقارب التقليدية وصفها أحادي الطبقة من الخلايا تخضع لالتساهمية وضع العلامات يجند على طبق زراعة الأنسجة ومن ثم هي lysed، في AFLIP تتشكل المجمعات يجند مستقبلات لأول مرة في لست] الجنين، ثم تنقيته بواسطة مناعي وأخيرا، تساهميا عبر ربط. بسبب استخدامها للبروابط رديولبلد، AFLIP حساس جدا ومن حيث المبدأ يمكن تكييفها لعوامل النمو الأخرى أو السيتوكينات مستقبلات الذي يجند وصفت والأجسام المضادة جيدة متوفرة. وهذا من شأنه إمكانات AFLIP تساعد في الكشف عن هذه الجزيئات ذات الصلة المنخفضة وفيرة ولكن الفسيولوجية. بسبب التنوع الكامن في خطوة عبر ربط لوضع العلامات تقارب، AFLIP لا يمكن أن تستخدم لتحديد كمي لمستويات المستقبلات قياسها. ومع ذلك، إذا أجريت مع وجود ضوابط موازية كافية، فإنه يمكن توفير المقايسة دقيقة جدا من المستويات النسبية للتعبيرها. كما AFLIP استخدام مجموع مقتطفات من البروتين، فإنه لا restriالمديرية إلى موقع خلوي واحد محدد للمستقبل، فإنه يكشف عن التعبير عنها في الفرد كله أو الجهاز، إذا ما طبق على عينة الكبار تشريح. وأخيرا، إذا كان من الممكن ربط AFLIP اللازمة لبروتوكولات الحيوية الأخرى، مثل الهضم الأنزيمية من الكربوهيدرات، لمزيد من تميز مستقبلات المصالح. على غرار وضع العلامات تقارب التقليدي، يوصى بشدة ليجند حديثا 125 I المسمى. ونظرا لنصف عمر قصير من 125 الأول، يجب استخدام يجند في غضون الأسابيع الأولى 2 بعد وضع العلامات مع النظائر جديدة. على الرغم من أن معظم التحذيرات من بروتوكول تم ذكرها في الخطوات المقابلة، يجب أن تعطى اهتماما خاصا واحدة لإزالة متأنية للصفار، والتي يجب أن تكون كاملة وموحدة ممكن. ان ترك كميات متفاوتة من صفار البيض يؤدي إلى الكميات غير صحيحة النية بروتين الجنين النية في لست].

Specific detection of proteins expressed during embryonic development is required to validate expression profiles obtained by measuring their cognate mRNAs with RT-PCR or in situ hybridization (ISH). This is commonly achieved by a western blot of embryo extracts followed by detection with specific antibodies. However, this approach is hard to apply to proteins that are in very low abundance, or that have properties that hamper their quantitative transfer during their blotting. Betaglycan, also known as the type III transforming growth factor &#946; (TGF-&#946;) receptor (TGFBR3), is an example of these difficulties. TGFBR3 is a part time membrane proteoglycan that binds TGF-&#946; through its core protein1, with notably higher affinity for the isoform TGF-&#946;2, a property that distinguishes it from any other TGF-&#946; binding protein2. TGFBR3 in the zebrafish is expressed from 8 hpf on, reaching a maximum by 72 hpf, as detected by RT-PCR of its mRNA3. 
However, despite the availability of a very specific antibody3, every attempt to detect its translated product by western blot proved unsuccessful. Reckoning that TGFBR3's proteoglycan nature, as well as putative low abundance may be accountable for this failure, a detection method, AFLIP, which takes advantage of TGFBR3 high affinity for TGF-&#946;2 was devised. In this method a protein extract from pooled embryos is allowed to specifically bind 125I-labeled TGF-&#946;2 and the receptor-ligand complexes are purified by immunoprecipitation and cross-linked before separation by SDS-PAGE. The migration patterns observed by autoradiography of the gels revealed the presence and nature of the labeled receptor species. This approach combines the ligand specificity of affinity labeling with immunoprecipitation by specific antibodies, increasing detection range, avoiding the inefficient transfer blotting of TGFBR3. Due to its inherent properties, the AFLIP assay is not a quantitative assay but can be used to confidently gauge relative experimental differences in the analyzed receptor.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="670">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Disuccinimidyl suberate (DSS)</td>
			<td style="width:168px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">21555</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Protein G Sephraose 4 Fast Flow</td>
			<td style="width:168px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">17-0618-01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Gel Dryer Model 583&#160;</td>
			<td style="width:168px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:119px;">1651745</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Typhoon 9400</td>
			<td style="width:168px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">63-0055-78</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Cobra II Auto gamma counter</td>
			<td style="width:168px;">Packard</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Exposure Cassette</td>
			<td style="width:168px;">Molecular Dynamics</td>
			<td style="width:119px;">63-0035-44</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:168px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:119px;">3624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:168px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:119px;">3040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:168px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:119px;">3828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">K2HPO4</td>
			<td style="width:168px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:119px;">3246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CH4O</td>
			<td style="width:168px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:119px;">9070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">C2H4O2</td>
			<td style="width:168px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:119px;">9508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CH2O</td>
			<td style="width:168px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:119px;">2106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SDS</td>
			<td style="width:168px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L4509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:168px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">ED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:168px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CaCl2</td>
			<td style="width:168px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:168px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PMSF</td>
			<td style="width:168px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Crystal Sea Marine Mix</td>
			<td style="width:168px;">Marine Enterprises International</td>
			<td style="width:119px;">http://www.meisalt.com/Crystal-Sea-Marinemix</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

affinity labeling detection of endogenous receptors from zebrafish embryos

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish embryos has been implemented. This technique takes advantage of the selectivity and sensitivity conferred by affinity labeling of a given receptor by its ligand with the specificity of the immunoprecipitation. We have used AFLIP to detect the type III TGF-&#946; receptor (TGFBR3), also know as betaglycan, during early zebrafish development. AFLIP was instrumental in validating the efficacy of a TGFBR3 morphant zebrafish phenotype. In the first step, embryo protein extracts are prepared and used to generate 125I-TGF-&#946;2-TGFBR3 complexes that are purified by immunoprecipitation. Later, these complexes are covalently cross-linked and revealed using SDS-PAGE separation and autoradiography detection. This technique requires the availability of a labeled ligand for, and a specific antibody against, the receptor to be detected, and shall be easily adapted to identify any growth factor or cytokine receptor that meets these requirements.

ويبين الشكل 1 نتيجة ممثل حصلت مع AFLIP. إشارات في حارة 1 تأتي من 125 I-يجند مرتبطة تساهميا إما إلى الزرد البروتين betaglycan الأساسية (BG الأساسية، تحت علامة كيلو دالتون 150) أو جوهر BG التي تم تجهيزها لشكله بروتيوغليكان عن طريق الحجز من الجليكوسامينوجليكان (GAG، لطخة تتراوح بين 170 كيلو دالتون إلى الجزء العلوي من هلام). هذا النمط من الهجرة، وهو بروتين الأساسية حاد بالإضافة إلى بروتيوغليكان طخت (بسبب عدم التجانس في طول السلاسل GAG)، هو سمة من TGFBR3 2. منذ مفاجآت صيف دبي لا ربط تساهمي كل واحد مجمع يجند مستقبلات تشكيل، هناك حرة 125 I-يجند تظهر في الجبهة الهجرة من هلام (125 I-TGF-β2). وكان من شأن ذلك يجند مجانا لمستقبلات، وبقي ملتزما خلال مناعي، ولكن منذ ولم تعلق تساهمي، فصل أثناء إجراء SDS-PAGE. لاnetheless، وقوة إشارة ما زال يرتبط إلى احد نظرا لمستقبلات المسمى. وهذا يمكن أن يكون موضع تقدير من خلال مقارنة الممرات 2 و 3. في 48 HPF الأجنة الزرد يحمل كميات أقل من BG من 72 الأجنة HPF 3، وهو ما يمكن ملاحظته من خلال إشارات باهتة في GAG وBG الأساسية، التي تتوافق مع شدة الإشارات التي قدمها يجند الحرة التي تظهر في الجزء الأمامي من هلام (حارة 2). وبالنظر إلى أن الأجسام المضادة ضد الفئران BG 6 لا عبر تتفاعل مع ZF BG، الأجسام المضادة عند استخدامها في AFLIP لم يعط إشارة لذلك، بمثابة سيطرة سلبية (حارة 3). وتم الحصول على نتائج سلبية مماثلة مع المصل قبل المناعي للأجسام المضادة لمكافحة ZF BG 3. ويبين الشكل 2 كيف AFLIP يمكن استخدامها لقياس مستويات التعبير عن مستقبلات معينة في الأجنة يتعرضون للتلاعب التجريبية، في هذه الحالة، انخفاض betaglycan بسبب morpholino فيjection 3. لين 1 يبين مستوى TGFBR3 في 72 HPF نوع الجنين البرية، في حين لين 2 يبين تأثير إدارة 7 نانوغرام من morpholino توجه إلى الحدود-exon2 intron2 من النسخة الأولية ZF BG. لاحظ أن BG أسفل اللائحة التي تم الحصول عليها مع هذا morpholino لا تتكرر من قبل لمراقبة سوء يقابل (حارة 3). وأكدت هذه النتائج أن النمط الظاهري تم الحصول عليها مع هذا morpholino كان محددا لضربة قاضية للTGFBR3 كما هو موضح قبل 3. <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/54405/54405fig1.jpg" /> تعرضوا الشكل 1. كشف AFLIP من BG في الزرد الأجنة. مجموع استخراج البروتين من أجنة في 72 ساعة بعد الإخصاب (HPF) (حارات 1 و 3) و 48 HPF (حارة 2) إلى وضع العلامات تقارب 125 I-TGF-β2 يتبع بواسطة IP مع الأرنب مكافحة الزرد BG (حارات 1 و 2، ZBG) أو أرنب مكافحة الفئران BG (لين 3، RBG<html> ) كمجموعة تحكم. في تصوير الإشعاع الذاتي يمكن أن يتم الكشف عن BG دون GAG (BG الأساسية) أو في شكل BG جلايكان المعدلة (GAG). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54405/54405fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/54405/54405fig2.jpg" /> الشكل 2. BG Morpholino ضربة قاضية التي كشفتها AFLIP 125 I-TGF-β2 تقارب وسم BG من الأجنة غير المعالجة WT (lane1)، microinjected مع BG محدد morpholino (حارة 2) أو عنصر تحكم فمنها (حارة 3). التهم لكل مليون (CPM) تعافت بعد أشار مناعي وخطوة عبر ربط. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54405/54405fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-w</html style=";text-align:right;direction:rtl">إيث-next.within صفحة = &quot;دائما&quot;&gt; <tbody><tr><td> عازلة </td><td> تركيب </td></tr><tr><td> عازلة 1 </td><td> 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك 7.5 درجة الحموضة، 150 مم كلوريد الصوديوم، 0.1٪ تريتون X-100 </td></tr><tr><td> عازلة Deyolk </td><td> 55 ملي مول كلوريد الصوديوم، 1.8 ملي بوكل، 1.25 ملم NaHCO 3 </td></tr><tr><td> أسماك المياه </td><td> انظر المواد الجدول </td></tr><tr><td> حل تثبيتي </td><td> 50٪ CH 3 OH، 12٪ CH 3 COOH، 0.185٪ HCHO </td></tr><tr><td> غسل العازلة IP </td><td> 10 ملي نا 2 هبو 4، 2 مم KH 2 PO 4، 137 مم كلوريد الصوديوم، 2.7 ملي بوكل، 0.1٪ تريتون X-100، 0.02٪ SDS، ودرجة الحموضة 7.4 </td></tr><tr><td> عازلة Laemmli </td><td> 2٪ SDS، 10٪ الجلسرين، و 100 ملي DTT و 60 ملي تريس (الرقم الهيدروجيني 6.8)، 0.001٪ برومفينول الأزرق. </td></tr><tr><td> تحلل العازلة </td><td> 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك pH7.4، 150 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA، 1 ملم PMSF، 0.5٪ تريتون X-100، 0.1٪ SDS، و 0.5٪ صوديوم Deoxycholate </td></tr><tr><td> برنامج تلفزيوني </td><td> 137 مم كلوريد الصوديوم، 2.7 ملي بوكل، 10 ملي نا 2 هبو 4، 2 مم KH 2 PO 4، pH7.4 </td></tr><tr><td> TNTE </td><td> 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك pH7.4، 150 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA، 0.1٪ تريتون X-100 </td></tr><tr><td> غسل العازلة </td><td> 110 مم كلوريد الصوديوم، 3.5 ملي بوكل، 2.7 ملي CaCl 2 و 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.5 </td></tr></tbody></table> الجدول 1: المخزن المؤقت التراكيب

Watch this Scientific Journal Video about Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos at JoVE.com

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

A novel technique for the detection of low abundance endogenous receptors present in zebrafish embryos is described. We have named it AFLIP because it consists of affinity labeling of the receptor by its ligand linked to immunoprecipitation.

تقارب كشف وسمها الذاتية المستقبلات من الزرد الأجنة

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

affinity-labeling-detection-endogenous-receptors-from-zebrafish

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

5.6K Views.  Universidad Nacional Autónoma de México. A novel technique for the detection of low abundance endogenous receptors present in zebrafish embryos is described. We have named it AFLIP because it consists of affinity labeling of the receptor by its ligand linked to immunoprecipitation.

Video: Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes. External development and optical transparency make these embryos especially amenable to microscopy, and numerous transgenic lines that label specific cell types with fluorescent proteins are available, making the zebrafish embryo an ideal system for visualizing the interaction of vascular, hematopoietic, and other cell types during injury and repair in vivo. Forward and reverse genetics in zebrafish are well developed, and pharmacological manipulation is possible. We describe a mechanical vascular injury model using micromanipulation techniques that exploits several of these features to study responses to vascular injury including hemostasis and blood vessel repair. Using a combination of video and timelapse microscopy, we demonstrate that this method of vascular injury results in measurable and reproducible responses during hemostasis and wound repair. This method provides a system for studying vascular injury and repair in detail in a whole animal model.

This article describes a method for creating a mechanical vessel injury in zebrafish embryos. This injury model provides a platform for studying hemostasis, injury-related inflammation, and wound healing in an organism ideally suited for real-time microscopy.

إصابة سفينة الميكانيكية في الزرد الأجنة

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos

Methyl green has long been known as a histological stain with a specific affinity for DNA, although its fluorescent properties have remained unexplored until recently. In this article, we illustrate the method for preparing a methyl green aqueous stock solution, that when diluted can be used as a very convenient fluorescent nuclear label for fixed cells and tissues. Easy procedures to label whole zebrafish and chick embryos are detailed, and examples of images obtained shown. Methyl green is maximally excited by red light, at 633 nm, and emits with a relatively sharp spectrum that peaks at 677 nm. It is very inexpensive, non-toxic, highly stable in solution and very resistant to photobleaching when bound to DNA. Its red emission allows for unaltered high resolution scanning confocal imaging of nuclei in thick specimens. Finally, this methyl green staining protocol is compatible with other cell staining procedures, such as antibody labeling, or actin filaments labeling with fluorophore-conjugated phalloidin.

A method for fluorescent staining of fixed biological material with the specific DNA label methyl green is described. Methyl green is used in a diluted aqueous solution and is very resistant to photobleaching. Its far-red emission allows for deep specimen imaging, making it particularly adequate for whole embryos.

تطبيق للDNA محددة وصمة عار الميثيل الأخضر في بطاقات المواد الفلورية الأجنة

Methyl green has long been known as a histological stain with a specific affinity for DNA, although its fluorescent properties have remained unexplored ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

عزل وتوصيف الخلايا واحدة من اسماك الزرد الأجنة

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for candidate genes of interest, migratory behaviors of cells, and secreted signals in distinct genetic settings. Because parabiotic animals share a common circulation, any blood or blood-borne factor from one animal will be exchanged with its partner and vice versa. Thus, cells and molecular factors derived from one genetic background can be studied in the context of a second genetic background. Parabiosis of adult mice has been &#160;used extensively to research aging, cancer, diabetes, obesity, and brain development. More recently, parabiosis of zebrafish embryos has been used to study the developmental biology of hematopoiesis. In contrast to mice, the transparent nature of zebrafish embryos permits the direct visualization of cells in the parabiotic context, making it a uniquely powerful method for investigating fundamental cellular and molecular mechanisms. The utility of this technique, however, is limited by a steep learning curve for generating the parabiotic zebrafish embryos. This protocol provides a step-by-step method on how to surgically fuse the blastulae of two zebrafish embryos of different genetic backgrounds to investigate the role of candidate genes of interest. In addition, the parabiotic zebrafish embryos are tolerant to heat shock, making temporal control of gene expression possible. This method does not require a sophisticated set-up and has broad applications for studying cell migration, fate specification, and differentiation in vivo during embryonic development.

This protocol provides step-by-step instruction on how to generate parabiotic zebrafish embryos of different genetic backgrounds. When combined with the unparalleled imaging capabilities of the zebrafish embryo, this method provides a uniquely powerful means to investigate cell-autonomous versus non-cell-autonomous functions for candidate genes of interest.

جيل من التعايش الالتصاقي الزرد الأجنة التي كتبها فيوجن الجراحي لتطوير الأريمات

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, specifically the generation of homozygous gynogenetic diploids is useful in genetic analysis because it allows the direct production of homozygotes from a single heterozygous mother. This article describes a modified protocol for ploidy duplication based on a heat pulse during the first cell cycle, Heat Shock 2 (HS2). Through inhibition of centriole duplication, this method results in a precise cell division stall during the second cell cycle. The precise one-cycle division stall, coupled to unaffected DNA duplication, results in whole genome duplication. Protocols associated with this method include egg and sperm collection, UV treatment of sperm, in vitro fertilization and heat pulse to cause a one-cell cycle division delay and ploidy duplication. A modified version of this protocol could be applied to induce ploidy changes in other animal species.

A modified protocol for ploidy manipulation uses a heat shock to induce a one-cycle stall in cytokinesis in the early embryo. This protocol is demonstrated in the zebrafish but may be applicable to other species.

التلاعب الصيغة الصبغية من الزرد الأجنة مع الحرارة صدمة 2 العلاج

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the cells are located. Specifically, they have been developed to analyze the electrical activity of excitable cells, such as spinal neurons. In such a scenario, it is crucial to preserve the integrity of the spinal cell, but it is also important to preserve the anatomy and physiological shape of the systems involved. Indeed, the comprehension of the manner in which the nervous system-and other complex systems-works must be based on a systemic approach. For this reason, the live zebrafish embryo was chosen as a model system, and the spinal neuron membrane voltage changes were evaluated without interfering with the physiological conditions of the embryos. 
Here, an approach combining the employment of zebrafish embryos with a FRET-based biosensor is described. Zebrafish embryos are characterized by a very simplified nervous system and are particularly suited for imaging applications thanks to their transparency, allowing for the employment of fluorescence-based voltage indicators at the plasma membrane during zebrafish development. The synergy between these two components makes it possible to analyze the electrical activity of the cells in intact living organisms, without perturbing the physiological state. Finally, this non-invasive approach can co-exist with other analyses (e.g., spontaneous movement recordings, as shown here).

Protocols described here allow for the study of the electrical properties of excitable cells in the most non-invasive physiological conditions by employing zebrafish embryos in an in vivo system together with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based genetically encoded voltage indicator (GEVI) selectively expressed in the cell type of interest.

بيوسنسينغ موتور الخلايا العصبية الغشاء المحتملة في الأجنة الزرد الحية

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and zebrafish embryos. Our system comprises a chamber featuring a simple setup that is nevertheless robust to induce and maintain a specific oxygen concentration and temperature in any experimental solution of choice. The presented system is very cost-effective but highly functional, it allows induction and sustainment of hypoxia for direct experiments in vivo and for various time periods up to 48 h.
To monitor and study the effects of hypoxia, we have employed two methods - measurement of levels of hypoxia-inducible factor 1alpha (HIF-1&#945;) in whole embryos or specific tissues and determination of retinal stem cell proliferation by 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU) incorporation into the DNA. HIF-1&#945; levels can serve as a general hypoxia marker in the whole embryo or tissue of choice, here embryonic retina. EdU incorporation into the proliferating cells of embryonic retina is a specific output of hypoxia induction. Thus, we have shown that hypoxic embryonic retinal progenitors decrease proliferation within 1 h of incubation under 5% oxygen of both frog and zebrafish embryos.
Once mastered, our setup can be employed for use with small aquatic model organisms, for direct in vivo experiments, any given time period and under normal, hypoxic or hyperoxic oxygen concentration or under any other given gas mixture.

We introduce a novel hypoxic chamber system for use with aquatic organisms such as frog and zebrafish embryos. Our system is simple, robust, cost-effective and allows the induction and sustainment of hypoxia in vivo and for up to 48 h. We present 2 reproducible methods to monitor the effectiveness of hypoxia.

تحريض نقص الأكسجة في الضفدع الحي والأجنة الزرد

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling processes of excitable neuronal and muscular cells and many other biological processes, such as embryonic developmental patterning. However, there is a need for in vivo electrical activity monitoring in vertebrate embryogenesis. The advances of genetically encoded fluorescent voltage indicators (GEVIs) have made it possible to provide a solution for this challenge. Here, we describe how to create a transgenic voltage indicator zebrafish using the established voltage indicator, ASAP1 (Accelerated Sensor of Action Potentials 1), as an example. The Tol2 kit and a ubiquitous zebrafish promoter, ubi, were chosen in this study. We also explain&#160;the processes of Gateway site-specific cloning, Tol2 transposon-based zebrafish transgenesis, and the imaging process for early-stage fish embryos and fish tumors using regular epifluorescent microscopes. Using this fish line, we found that there are cellular electric voltage changes during zebrafish embryogenesis, and fish larval movement. Furthermore, it was observed that in a few zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors, the tumor cells were generally polarized compared to the surrounding normal tissues.

Here, we show the process of creating a cellular electric voltage reporter zebrafish line to visualize embryonic development, movement, and fish tumor cells in vivo.

التصور للنشاط الكهربائي الخلوية في الزرد الأجنة في وقت مبكر، والأورام

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues or cells. A difficulty with imaging whole embryo development is that zebrafish embryos grow substantially in length. When mounted as regularly done in 0.3-1% low melt agarose, the agarose imposes growth restriction, leading to distortions in the soft embryo body. Yet, to perform confocal time-lapse microscopy, the embryo must be immobilized. This article describes a layered mounting method for zebrafish embryos that restrict the motility of the embryos while allowing for the unrestricted growth. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations. To demonstrate the usability of this method, whole embryo vascular, neuronal and muscle development was imaged in transgenic fish for 55 consecutive hours. This mounting method can be used for easy, low-cost imaging of whole zebrafish embryos using inverted microscopes without requirements of molds or special equipment.

This article describes a method to mount fragile zebrafish embryos for extended time-lapse confocal microscopy. This low-cost method is easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on any inverted microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

طريقه تركيب طبقات لتمديد المجهر البؤري المجهري لأجنه الزبرافيش الكاملة بفواصل زمنيه طويلة

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

كامل جبل المناعة الكيمياء في الأجنة حمار وحشي واليرقات

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...