This work was supported by NIH Grant HL-113905

وقد وافق جميع الإجراءات الحيوانية التي أجريت لهذه الدراسة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي من جامعة جنوب شرق نوفا في اتفاق مع دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية، 8 الطبعة ال (الأكاديميات الوطنية الصحافة، واشنطن، DC، 2011 ). 1. إعداد أقسام الأنسجة لمستقبلات تصوير الإشعاع الذاتي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على التضحية، والحصاد أنسجة المخ جديدة، والتفاف في رقائق الألومنيوم وضعها في الثلاجة -20 درجة مئوية في أقرب وقت ممكن. للحفاظ على الشكل الصحيح، ووضع العقول في قالب الدماغ الذي يحاكي داخل الجمجمة، والتفاف في رقائق الألومنيوم ومكان في - 20 درجة مئوية الفريزر. بعد 30 دقيقة، والأنسجة مكان في حقيبة التخزين المجمد اغلاقها باحكام والانتقال إلى -80 درجة مئوية الثلاجة لمدة التخزين على المدى الطويل. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على عينة الأنسجة الطازجة والمجمدة من الفائدة من الفريزر -80 درجة مئوية، ونقل إلى ناظم البرد لتعيين الحد الأدنى من -10 درجة مئوية والحد الأقصى من -18 درجة مئوية، لتجنب ذوبان الجليد. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع العينة على الأنسجة جبل مع غليكول وراتنجات المتوسطة التضمين، فقط تضمين جزء صغير من العينة في المتوسط. لالدماغ، هي التي شنت الدماغ عموديا لتمكين باجتزاء في الطائرة الاكليلية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الأنسجة جبل على مشراح داخل ناظم البرد وتشديد ثابتا في مكانه. ضمان الجانب الأيسر والأيمن من الدماغ هي في الإحداثيات انتيرو-postero نفسها، وأن محور ظهراني بطني هو الأطالس الدماغ عمودي على شائعة الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبدأ خفض في سمك المطلوب (20 ميكرون موصى به) وذوبان الجليد جبل المقاطع على الشرائح المجهر في الاتجاه العمودي أن يكون لها مساحة سطح أكبر مساحة في الشريحة. جمع المقاطع على الشرائح في مجموعات متتابعة من خمسة، أي أول مجموعة من الشرائح وصفت 1-1، 1-2، 1-3، 1-4، و1-5 (الشكل 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ملء مجموعة من الشرائح مع أقسام، تسمح الشرائح للهواء الجاف لمدة تصل إلى 1 ساعة، ثم ضع سليقصر في مربع من البلاستيك الشريحة في حقيبة التخزين المجمد الختم الذاتي، ومخزن في -20 درجة مئوية. </li></ol> 2. مستقبلات تصوير الإشعاع الذاتي تنبيه: النشاط الإشعاعي. استخدام الملابس الواقية للتعامل مع النشاط الإشعاعي. ويعتمد التخلص عند إنشائها، ويجب أن تتبع مبادئ توجيهية للتسوس بشكل صحيح (نصف العمر 60 يوما) أو يتم انتقاؤها من قبل شركة معتمدة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الشرائح &quot;-1&quot; و &quot;-2&quot; من مصلحة من الثلاجة -20 درجة مئوية وجبل إلى السيطرة شريحة (الشكل 5). جبل &quot;-1&quot; الشرائح معا لتلقي العلاج &quot;غير محددة&quot;، و &quot;-2&quot; الشرائح ل&quot;مجموعه&quot; العلاج. الجرار &quot;غير محددة&quot; سيتضمن 10 ميكرومتر تركيزات النهائي من PD123319 على AT 2 R خصم، واللوسارتان على AT 1 R خصم، في المخزن فحص المتوسطة (AM5) (الجدول 1)، و &quot;المجموع&quot; سيحتوي الجرار ملزمة فقط 10 ميكرومتر PD123319 في AM5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عكس الشريحةالسيطرة على وضع الشرائح في الجرار Coplin مرحلة ما قبل الحضانة مليئة 35-40 مل من AM5، ومثبطات منها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بدء مجموعات لاحقة في حمام مرحلة ما قبل الحضانة الخاصة بهم في 4 فترات دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على الفور نقل الشرائح من الحل الحضانة قبل لبريدية حضانة الشرائح، التي تحتوي على 10 مل من AM5، بالإضافة إلى تركيز محدد سلفا من 125 I-SI-آنغ الثاني (محسوبة في الشكل 4) مع مثبطات منها، ل60-90 دقيقة في غرفة درجة الحرارة. إذا كان هناك جين مشع كاف، 10 الشرائح يمكن وضعها (العودة إلى الوراء) في السيطرة وتعديل الشرائح وحضنت مع 125 I-SI-آنغ الثاني في الجرار Coplin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الشرائح مرة أخرى إلى السيطرة الشرائح (إذا لزم الأمر)، وصمة عار، وشطف من قبل يحوم برفق لمدة 1-2 ثانية في 400 مل من الماء المقطر في حاويتين منفصلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الشرائح بالتتابع إلى أربعة الجرار Coplin تحتوي على 35-40 مل من AM5 بالضبط 1 دقيقة لكل منهما (كما هو موضح في الشكل رقم 4 &lt;/ قوي&gt;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد آخر 1 دقيقة شطف، دوامة بلطف الأقسام لمدة 1-2 ثانية في أربعة تغييرات من الجليد الباردة الماء المقطر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مجففا الشرائح مع الهواء البارد (تحذير: الهواء الساخن volatizes مجمع المشع) باستخدام أربعة مجففات الشعر اقامة من زوايا مختلفة لمدة 4 دقائق (الشكل 5)، حتى تكون جميع أقسام جافة، ثم وضع على منشفة ورقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل الشرائح مع الأنسجة التي تواجه حتى على الورق المقوى لبدل إلى فيلم الأشعة السينية باستخدام الشريط مزدوجة من جانب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل واحد على الأقل، و 125 اليود معايرة الشرائح القياسية على كل من الورق المقوى (الشكل 6). ملاحظة: المعايير معايرة تتكون من عجينة الدماغ يخلط جيدا مع 125 اليود بد أن مجمعا يضم حلقة الفينول، ضغط بواسطة الطرد المركزي في حقنة 1 مل السلين، التي هي ناظم البرد مقطوع في سمك نفس أقسام الدماغ ومحمولة على ذوبان الجليد على المجهر الشرائح. بدلا من ذلك، 125 المعايير أنا المعايرة فيراتنج البلاستيك مقطوع في 20 سماكة ميكرون يمكن الحصول تجاريا. الراتنج البلاستيكية في هذه المعايير الدروع جزئيا الفيلم من الإشعاع بحيث يجب أن تؤخذ في معادلة أنسجة ~ 40٪ في المعايرة. </li></ol> 3. التعرض السينمائي والتنمية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتقل إلى غرفة مظلمة مع حزام الظهر كاسيت الأشعة السينية والفيلم تصوير الإشعاع الذاتي. فتح الكاسيت ووضع الورق المقوى مع الشرائح داخل (الشكل 6). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل الأنوار وتشغيل safelight. بعناية فتح مربع من فيلم الأشعة السينية، وإزالة فيلم واحد، ووضع الجانب اللامع الفيلم حتى (مع حافة خشنة في الزاوية اليمنى السفلى) على رأس الشرائح في الكاسيت. بعناية إغلاق الكاسيت، وتحريف الحانات قفل لاغلاق خارج الضوء (الشكل 6). كشف الشرائح لعدة أيام إلى عدة أسابيع في -20 درجة مئوية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في غرفة مظلمة، فتح الكاسيت والمضي قدما في فيلم تطوير بروكوفاق سطيف. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الشرائح في الصواني على التوالي. مطور لمدة 2 دقيقة، الماء الذي يحتوي على 5٪ حامض الخليك الجليدي لمدة 30 ثانية، ويتدخل لمدة 5 دقائق. الأفلام هي وضعها في علبة مع المياه الجارية لمدة 20 دقيقة، ثم وضعها في Photoflo لمدة لا تتجاوز 10 ثانية، وعلق. ملاحظة: يتم تحديد وقت التعرض تجريبيا ويمكن أن تنطوي على أفلام متعددة مع أوقات التعرض مختلفة: فترة طويلة بما فيه الكفاية للحصول على إشارات قابلة للقياس من المناطق مع انخفاض ملزمة، ولكن لا طالما لتشبع الفيلم من المناطق مع ارتفاع ملزمة. مرة واحدة يتم الحصول على التعرض مقبولة، ثم انتقل إلى الخطوة التالية. </li></ol></li></ol> 4. علم الأنسجة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد وصمة عار ثيونين والكواشف تلطيخ (الجدول 2، الشكل 7). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع &quot;-3&quot; الشرائح في رف الشريحة، ونقل بالترتيب بدءا منزوع الأيونات الماء لمدة 1 دقيقة، ثم ثيونين حل وصمة عار لمدة 10 دقيقة تليها ثلاث الانخفاضات في deionمياه أوتوماتيكية، واحدة غسل 30 ثانية في الماء منزوع الأيونات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الماء، وضع رف الانزلاق الى يغسل الايثانول على النحو التالي؛ 50٪، 70٪، و 90٪ لمدة 30 ثانية، تليها اثنين من يغسل الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 1 دقيقة لكل منهما. وأخيرا، وضع رف الشريحة في الزيلين لمدة 3 دقائق، ثم نقل الى حل زيلين الثاني لمدة 5 دقائق. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة شريحة واحدة في وقت واحد من الحمام زيلين الماضي، وتغطية الحافة العلوية من الشريحة مع قاعدة الراتنج في المذيبات العضوية المتوسطة المتزايدة، ووضع 24 ملم × 60 ملم ساترة على الشريحة. تسمح الشرائح لتجف بما فيه الكفاية ل~ 48 ساعة ثم مسح في الكمبيوتر في 2400 الرمادي نقطة لكل بوصة. </li></ol> 5. تحليل صورة قياس الكثافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الجانب اللامع الفيلم إلى أسفل، مع حافة خشنة في الزاوية اليسرى السفلية والمسح الضوئي باستخدام ماسحة الملكية قادرة على نقل المعلومات كثافة الفيلم من دون أي تحريف في الكمبيوتر نظام التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح تميز الكلية الملكية التصويرتيم والاستفادة من الحانات المعايرة لوضع معايير المعايرة لتحليل قياس الكثافة في المستقبل من الصور على فيلم (أرقام 9-12). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المناطق قدر من الفائدة عن طريق إما إنشاء القالب أو تحدد تجريبيا مجالات الاهتمام. والبيانات التي تم جمعها وفصلها على أساس الفيلم، إما السيطرة أو النوع البري (قسم)، والمنطقة. تأكد من تضمين الكثافة (fmol / ز)، منطقة المسح الضوئي، ومجموع المنطقة المستهدفة في القياسات (الشكل 9). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط الحانات منطقة المسح الضوئي عن طريق ضمان أن المنطقة ذات الاهتمام يقع بين المعلمات من تسليط الضوء على (الشكل 10). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصدير البيانات إلى جدول (الجدول 4). مضاعفة مرات كثافة المساحة الإجمالية المستهدفة، ثم القسمة على منطقة المسح الضوئي من أجل الحصول على قيمة الربط في تلك المنطقة المحددة. حالما يتم ذلك لجميع القيم المقاسة، الركيزة التي أنشئت غير محددة من مجموع تسفر ع محددة ملزمةتستاء. ويمكن أيضا أن يؤديها المتوسطات لهذه القيم. </li></ol></li></ol>

Robert Speth has licensed antibodies to angiotensin II receptors to a commercial vendor and receives royalties from the sale of said antibodies. The other authors have nothing to disclose.

ويحدد بروتوكول صفها التصور من &quot;مجموع&quot; و &quot;غير محددة&quot; ملزمة للجين مشع في المقاطع المتجاورة من أقسام الاكليلية من الدماغ القوارض من قبل حصادها وتخزينها في -80 درجة مئوية، ويمكن أن تكون قابلة للتطبيق بسهولة إلى كل الأنسجة التي حلت تشريحيا الأساسات التي تعرض كميات التفاضلية من المستقبلات أو مواقع لجين مشع ملزمة. الإجراءات الموضحة ضمن بروتوكول بسيطة وتحليل أمر بالغ الأهمية لتفسير النتائج بشكل صحيح. تم تحديد سماكة 20 ميكرون لتكون الأمثل. إذا كان المقطع سميكا جدا وغير محددة وملزمة وزيادة، مما يجعل من الصعب حل ملزم للجين مشع إلى هدفه. إذا تم قطع قسم أرق، يصبح من الصعب خفض بنجاح، وحفظ المقاطع متتابعة دون تحريف. ودرجة الحرارة المثلى القطع تختلف قليلا نظرا لطبيعة الأنسجة وسماكة المقاطع وأناق عادة ما تحدد تجريبيا. مرة واحدة يتم الاتصال بين النصل والأنسجة، ويمكن إعادة النظر في التوجه للعينة، وتكييفها عن طريق تحريك عينة الأنسجة تتراجع عن النصل، وإعادة توجيه الكرة في تصاعد مستمر. عندما قطع دماغ القوارض فمن الأهمية بمكان لضمان الجانب الأيسر والأيمن من الدماغ هي في الإحداثيات انتيرو-postero نفسها، وأن محور ظهراني بطني هو الأطالس الدماغ عمودي على شائعة الاستخدام. مجموعات الشرائح وقبل المسمى من أجل إجراء دراسات حول أقسام المجاورة للأنسجة. وصفت مجموعات الأولى من 5 شرائح 1-1، 1-2، 1-3، 1-4، و1-5. يذهب قسم أول خطوة من نوعها على الشريحة 1-1 في الزاوية اليسرى العليا (وهذا هو أعلى الزاوية اليمنى من الشريحة عندما يكون الجانب بلوري لأسفل). يذهب قسم ثاني خفض في الشريحة 1-2، الخ يذهب القسم قطع الخامس على الشريحة 1-5. يذهب قسم قطع السادس على الشريحة 1-1 على يسار الباب الأول. بعد شغل أول مجموعة من الشرائح، تبدأ مجموعة أخرى من 5 انزلقوفاق، وصفت 2-1، 2-2، 2-3، 2-4، و2-5. وتستمر هذه الدورة بقدر ما يعود إلى الدماغ عند الضرورة. و&quot;-4&quot; و &quot;-5&quot; وتحفظ الشرائح كنسخة احتياطية أو لradiolabel مستقبلات مختلفة. يعتمد بروتوكول مستقبلات تصوير الإشعاع الذاتي على جين مشع يستخدم وخصائص المستقبلات يجري مسح لتحديد تركيزات من مخازن والأملاح ومثبطات. لقياس النوع الفرعي AT1 مستقبلات انج الثاني في هذا الإجراء، وهي عالية تقارب اليود 125 وصفت يجند، 125 I-سار 1 إيل 8 -Ang الثاني (125 I-SI-آنغ الثاني)؛ رديولبلد التي كتبها روبرت سبيت، دكتوراه يذوب (الببتيد Radioiodination الموارد المشتركة، جامعة جورج تاون)، الذي هو أيضا المتاحة تجاريا) في المخزن AM5 (الجدول 1). منطقة عازلة فوسفات الصوديوم مع كلوريد الصوديوم، EDTA وباسيتراسين. AM5 يوفر حماية جيدة للجين مشع من metallopeptidases وpeptida الحساسة باسيتراسينإس إي إس توفير درجة الحموضة الفسيولوجية وتركيز كلوريد الصوديوم لتحسين خصائص ملزمة. مرحلة ما قبل الحضانة في AM5 تكشف المقاطع الأنسجة لببتيداز مثبطات للحد من تدهور جين مشع، وأيضا تنأى الذاتية انج الثاني من المستقبلات انج الثاني. اللوسارتان وPD123319، AT1R وAT2R الخصوم، على التوالي، التي تشبع تضاف مستقبلات هدفهم بتركيزات (10 ميكرومتر) لمنع جين مشع من ملزمة لهذه المستقبلات لتقييم غير محددة وملزمة والحد محددة ملزمة لمستقبلات AT1، على التوالي. يتم تحديد التركيز المطلوب 125 I-SI-آنغ الثاني للمقايسة ويتم تحديد التخفيف المطلوب من محلول المخزون من جدول معدل تسوس النظائر المشعة (انظر بروتوكول الجدول 3). على النحو الأمثل ويستخدم تركيز جين مشع تقارب K D التي لن تشغل 50٪ من المستقبلات الحالية. ومع ذلك، لأن radioligands يمكن أن يكون مكلفا انخفاض تركيزات ه.G. 10-20٪ من تركيز K D يمكن استخدامها. هذا له ميزة المحتملة لزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء عن طريق خفض غير محددة ملزمة أكثر من ملزمة محددة. ومع ذلك، هناك حاجة التعرض مرات أطول لوضع صورة ملزمة. كما ذكر أعلاه (القسم 3.4)، إذا تعرض عليها فوق أو تحت المكشوفة، والشرائح يمكن إعادة يتعرض لفيلم جديد للأقصر و / أو وقتا أطول لتحقيق التعرض المطلوب. ويمكن أن يتم تحليل صورة قياس الكثافة من قبل نظام التصوير الشخصية التي تقدم خلاصة واسعة من التطبيقات للتصوير الإشعاع الذاتي فضلا عن التطبيقات الأخرى. معايير المعايرة هي في fmol / غرام من الوزن الرطب الأنسجة (على افتراض الثقل النوعي واحد لالأنسجة). وسيكون لكل مجموعة قياسية، جنبا إلى جنب مع خلفية توليد منحنى القياسية. وهناك العديد من خوارزميات المناسب منحنى مع وبدون ترجيح المتاحة لتوليد منحنى قياسي من د متعلق بإخصائي النظارات النسبيensity (رود) القيم للمعايير معايرة مختلفة. ويتم اختيار منحنى الذي يمثل أفضل البيانات تجريبيا كما روتين لمنحنى المناسب لا توفر قيم الخطأ النسبية للمنحنيات قياسية مختلفة. في قضبان تصل إلى ~ 0.6، المنحنى هو معيار pseudolinear. ومع ذلك، يبدأ الفيلم لتشبع بعد هذه النقطة تشكيل منحنى أن الخطوط المقاربة حول 0،8-0،9 وحدة رود. إذا كانت المعايير التي يتم بين أقواس العينات فوق وحدات 0.9 رود، فمن المستحسن أن إعادة فضح-الفيلم لفترة أقصر من الوقت للحصول على قيم أكثر موثوقية من fmol / ز ملزم من العينات أقرب إلى مجموعة pseudolinear المعيار منحنى. والقيم المستمدة في هذا التطرف من المنحنى القياسي يؤدي إلى اختلافات صغيرة في رود الاختلافات أكبر بكثير في جين مشع ملزمة. وبالتالي القدرة على اكتشاف التغيرات في انخفاض ملزمة مع اقتراب الفيلم نقطة التشبع. لقياس مناطق معينة،التدابير الموصى بها هي &quot;الكثافة&quot; في fmol / ز، &quot;منطقة المسح الضوئي&quot; في بكسل، و &quot;إجمالي المساحة المستهدف&quot; في بكسل (الشكل 9). من المهم تعيين قيمة عتبة أقرب إلى الصفر ممكن (الشكل 10) بسبب التغيرات في الكثافة فيلم أو الجانب التعسفي من المنحنى القياسي المستمدة من المعايير معايرة يمكن أن تعطي أحيانا القيم أقل من الصفر. إذا بلغ متوسط ​​هذه القيم لجميع بكسل في منطقة المسح الضوئي انها تستمد قيمة منخفضة بشكل مصطنع. المعايير المستخدمة لتحديد المناطق التي يمكن أن تكون ملزمة ذاتية جدا، لذلك فمن الأفضل أن الزوج عن كثب مراقبة والعقول التجريبية قدر الإمكان للحد من وقوع أخطاء غير موضوعية. وهناك تحد آخر هو أن تقرر عدد الأقسام في المتوسط ​​للحصول على القراءة النهائية. ومؤشرا جيدا لأقسام لتحليل يمكن تحديد باتباع أطلس دماغ الفئران المقبولة، جنبا إلى جنب مع شرائح الأنسجة الملون. حجم منطقة أخذ العينات ويمكن أيضا أن يكونمشكلة. من أجل التعويض، يمكن إنشاء قالب لتصحيح أي اختلافات الحجم. علاج المقاطع يمكن أن تؤثر أيضا على منطقة من الهيكل الذي ملزمة عالية وسوف يتم بحثها خلال التحليل. ويتطلب ذلك استخدام بديل من أداة &quot;العتبة&quot; في نظام التصوير الملكية لتحديد مدى كثافة تتجاوز قيمة التعسفية وذلك لتمثيل الخصائص التشريحية للمنطقة في الدماغ يتم أخذ عينات مثل نواة مجاور للبطين من منطقة ما تحت المهاد في أداة أخذ العينات التي تشمل المنطقة من اهتمام (الشكل 11، لوحة C). ومن الممكن أيضا أن تشمل قياس المنطقة إلى تحديد كمية ملزمة. ويمكن القيام بذلك عن طريق ضرب قيمة مرات محددة ملزمة عدد البكسل التي تم قياسها. يمكن تحويلها إلى وحدات بكسل متري عن طريق التصوير الحاكم في طائرتين، أو مستطيل الأبعاد المعروفة. عدد البكسل التي تتوافق معويمكن بعد ذلك أعرب طول أو مساحة المستطيل في وحدات متري. في 2400 نقطة في البوصة، ~ 9000 بكسل = 1 ملم 2 في نظامنا. على الرغم من أن استخدام بروابط المشعة لم يعد أسلوب يستخدم على نطاق واسع. وهي واحدة من عدد قليل من الطرق لتصور التوزيع المادي من المستقبلات داخل أنسجة العينات أنفسهم وظيفية (قادرة على الربط يجند لها الفطري). بالإضافة إلى ذلك، فإنه يمكن quantitate عدد مستقبلات لتمكين تقييم التغيرات في التعبير مستقبلات الوظيفي بين مجموعات العلاج، بين مناطق الدماغ المختلفة أو غيرها من الهياكل، بين سلالات مختلفة من الحيوانات، أو الحيوانات من مختلف الأعمار، وما هي الطرق البديلة المتاحة للتميز جوانب تشريحي عصبي التعبير مستقبلات AT 1، ومع ذلك، لديهم قيمة محدودة. في الموقع التهجين مرنا لشركة AT 1 مستقبلات لا تتوافق دائما مع AT 1 مستقبلات التعبير أو التوزيع فيالدماغ. في حين التقنيات المناعية يمكن أن تقارب الاختلافات في التعبير مستقبلات استنادا إلى كثافة تلطيخ أقسام الأنسجة، فإنه ليس من الممكن لتوليد منحنى القياسية لتلطيخ للسماح لتقرير العددي للتعبير مستقبلات. يوفر مستقبلات تصوير الإشعاع الذاتي أيضا مستوى من الدقة لمستقبلات (أو غيرها من الأهداف التي تربط تحديدا radioligands) التي لا يمكن أن تكون مضمونة باستخدام التقنيات المناعية. في عام 2009، ونشرت سلسلة من المقالات 37-43 تشكك في صحة 49 الأجسام المضادة التي كانت تستخدم لتقييم 18 مختلفة G مستقبلات البروتين يقترن وقناة عابرة إمكانات مستقبلات (TRP). في جوهرها، والأجسام المضادة وصفت العصابات متطابقة حول البقع الغربية من النوع البري والفئران خروج المغلوب للمستقبلات في السؤال. وفي وقت لاحق، جعلت العديد من الجماعات ملاحظات مماثلة باستخدام المتاحة تجاريا AT 1 وايه 2 الأجسام المضادة لمستقبلات 44-49. استخدام البكترياآل الكروموسوم الاصطناعي الذي يولد جزيء مراسل، على سبيل المثال، البروتين الفلوري الأخضر، مدفوعا AT 1 المروج وسيلة غير مباشرة لتحديد وجود أو عدم وجود AT 1 الخلايا التعبير عن مستقبلات في الماوس (ولكن ليس فأر) العقول على أساس وجود لها وظيفية AT 1 مستقبلات المروج 50. فمن الممكن لحساب &quot;خلايا إيجابية&quot; في مناطق الدماغ التي تم تحديدها مجهريا، ولكن ليس ل quantitate التغيرات في كثافة التعبير عن مستقبلات AT 1 في هذه المناطق. وهكذا في هذا الوقت تقنيات فقط التحقق من صحة تلك المتوفرة لقياس مباشرة تعبير مستقبلات انج الثانية هي لجين مشع أساليب ملزمة. وإذا كانت هناك حاجة قرار تشريحية وظيفية AT 1 مستقبلات البروتين في المستوى المجهري، مستقبلات تصوير الإشعاع الذاتي هو الأسلوب الوحيد المتاح لمثل هذا القياس المباشر. مستقبلات تصوير الإشعاع الذاتي لا يخلو من القيود. هذا القلق الرئيسيn غير ذلك من تلبية متطلبات استخدام المواد المشعة في إعداد البحوث. ومن الضروري أن يكون لديك برنامج السلامة من الإشعاع مع المبادئ التوجيهية صارمة لضمان سلامة من الباحثين الذين يعملون مع المواد المشعة والتصرف الآمن للمواد المشعة. هذا تصاعد تكلفة الابحاث التي تستخدم المواد المشعة إلى النقطة التي تحول دون استخدامها في العديد من إعدادات البحث. بالإضافة إلى ذلك، فإن تكلفة radioligands يمكن أن تكون كبيرة. وهكذا تجربة مستقبلات تصوير الإشعاع الذاتي الذي يتم تحضين عدد كبير من أقسام الأنسجة محمولة على الشرائح في حاويات من جين مشع يمكن استخدام المئات إن لم يكن الآلاف من الدولارات من جين مشع. الحد الآخر هو أن الأنسجة يجب أن تجمد قبل باجتزاء على ناظم البرد وتخزينها لفترة من الوقت، وسرعان ما تشطف وتجفف بعد الحضانة مع لجين مشع، والتي يمكن أن تنال من قدرة المستقبلات أو البروتين من الاهتمام لربط جين مشع . لبروابط أن يكون الحمار السريعociation حركية / التفكك، فإنه قد لا يكون من الممكن الإبقاء على الملزم للجين مشع لمستقبلات خلال الوقت اللازم لشطف بعيدا جين مشع ملزمة غير وجه التحديد. أيضا، مع كميات قليلة من جين مشع ملزمة فترات طويلة من التعرض فيلم - شهر واحد أو أكثر - قد يكون مطلوبا قبل صورة قابلة للقياس يمكن أن تشكل على الفيلم. وهناك تحد آخر هو أن إضافة اليود 125 ليجند قد تضعف قدرة يجند لربط مستقبلات البروتين المستهدف أو بسبب عائق الفراغية. استخدام جزيء أصغر، على سبيل المثال، التريتيوم (3 H) يلغي مشكلة الإعاقة الفراغية، ولكن التريتيوم لديه هذه الطاقة المنخفضة والنشاط النوعي المنخفض (نسبة إلى اليود 125) أنه من الصعب للغاية لتوليد صورة الفيلم لأكثر السكان مستقبلات. في ضوء هذه القضايا، وهناك العديد من الحالات التي مستقبلات تصوير الإشعاع الذاتي غير قادر على تحديد مستقبلات أو الهياكل الجزيئية الأخرى ذات الاهتمام. وعلى الرغم من لى لmitations، مستقبلات تصوير الإشعاع الذاتي يمكن تحديد هياكل محددة داخل الأنسجة، وعلى سبيل المثال، مناطق الدماغ تتغير استجابة للمتغيرات التجريبية مقارنة إلى عنصر تحكم الدماغ العادي. هذه المعرفة يمكن أن تساعد في تحديد دور R AT 1 لانج الثاني أو غيرها من مستقبلات أو الإنزيمات في علم الأمراض من الأمراض. هذه المعرفة لها آثار الدوائية قيمة، لأنه يشير إلى المناطق المستهدفة لعلاجات محتملة.

لا يزال مرض القلب والأوعية الدموية هي السبب الرئيسي للوفاة والعجز في الولايات المتحدة، مما تسبب في أكثر من 30٪ من الوفيات في الولايات المتحدة في عام 2011 1. إن الإحصاءات التي صدرت مؤخرا عن جمعية القلب الأمريكية تشير إلى أن أكثر من شخص واحد من كل ثلاثة لديها واحد أو أكثر من نوع من مرض القلب والأوعية الدموية. يستمر البحث القلب والأوعية الدموية لاتخاذ خطوات واسعة ضد فهم هذا المرض، ولكن عندما تبدأ الأجيال الحصول على كبار السن لا بد من مواصلة هذه الجهود. نظام رينين أنجيوتنسين (RAS) يلعب دورا مركزيا في تنظيم نظام القلب والأوعية الدموية في المقام الأول من خلال تعزيز تصلب الشرايين، والتهاب، تضيق الأوعية النظامية، وتفعيل الجهاز العصبي الودي (الشكل 1) 2-8. وRAS هو نظام الهرموني الذي يتم تفعيلها عند الخلايا المجاورة للكبيبة الكلى تفرز الرينين في مجرى الدم استجابة لانخفاض ضغط الدم، وزيادة sympatالتحفيز hetic، أو انخفاض تدفق الصوديوم البقعة الكثيفة. الرينين يتأيض مولد الأنجيوتنسين (تصنيعه في الكبد) لتشكيل أنجيوتنسين الأول (آنغ لي). آنج لي ثم يتم استقلاب من قبل المحول للأنجيوتنسين انزيم (ACE)، وهو إنزيم خارجي على الجانب اللمعية من خلايا بطانة الأوعية الدموية، وخاصة في الرئتين والكليتين، لتشكيل أنجيوتنسين الثاني (آنج الثاني)، والببتيد المستجيب الرئيسي للRAS. آنج الثاني قادر على تفعيل نوعين مستقبل. مستقبلات نوع 1 (AT 1 R) ومستقبلات نوع 2 (AT 2 R)، على حد سواء التي تنظم نظام القلب والأوعية الدموية، والحفاظ على السوائل والكهارل التوازن وتعتبر الآن أن تؤثر على الوظيفة المعرفية والأمراض العصبية التنكسية العمليات 8،9. وتفيد التقارير ان، RAS في الدماغ محددة المحلي لتجميع مستقل انج الثاني. في الدماغ، ويتم تصنيعه في مولد الأنجيوتنسين البروتين السلائف في دبق نجمي الخلايا 10 تحويلها إلى آنغ لي من قبل مثل الرينين انزيم 3، ربما ملزمة prorenin لمستقبلات prorenin11، وبعد ذلك تحويلها إلى آنغ الثاني بواسطة انزيم المحول للأنجيوتنسين وهو ما يعبر عنه بكثرة على سطح الخلية من الخلايا العصبية في الدماغ (12). هذا intrabrain ولدت آنغ الثاني هو ناهض للدماغ AT 1 وايه 2 المستقبلات التي يتم عزل من المنقولة عن طريق الدم انج الثاني. في حين أن AT 1 R تلعب دورا هاما الفسيولوجية، وأفضل المعروف للآثار المرضية في جميع أنحاء الجسم، مما يؤثر في المقام الأول على نظام القلب والأوعية الدموية والكلى (الشكل 2). عندما يربط انج الثاني لAT 1 R، فإنه يتسبب تضيق الأوعية. زيادة المقاومة لتدفق الدم ورفع ضغط الدم. كما أنها تشجع على تخليق وإفراز الألدوستيرون وفاسوبريسين، مما يؤدي إلى زيادة الصوديوم واحتباس الماء. ويمكن لهذه الآثار أيضا لحث تلف في الدماغ الإقفاري وإدراكيا ويرتبط مرض باركنسون ومرض الزهايمر، وتنظيم السكرقسم التدريب والامتحانات، وكذلك يجري تحديدها مؤخرا أن تؤثر على التعلم والذاكرة 13-15. هناك حلقة مفرغة في RAS في هذا AT 1 R على الخلايا المجاورة للكبيبة في الكلى يحول دون إفراز الرينين. ومن المثير للاهتمام، وAT 2 R عموما مكافحة ينظم عمل AT 1 R، مما تسبب توسع الأوعية، ثمرة neurite، تجدد المحاور، ومكافحة انتشار الأسلحة النووية، وcerebroprotection ضمن أشياء أخرى كثيرة 16-20. كما تم تحديد AT 2 R كهدف لمكافحة ارتفاع ضغط الدم ومؤخرا، الأدوية المضادة للسرطان 21. تحديد توطين وكثافة من مستقبلات انج الثاني في الأنسجة المختلفة، وكيف تتأثر من قبل مختلف العلاجات والحالات المرضية باستخدام الكمي قياس الكثافة تصوير الإشعاع الذاتي مستقبلات سوف تساعد في الكشف عن الدور الذي لعبته RAS في أمراض معينة. وقد استخدم مستقبلات تصوير الإشعاع الذاتي لأكثر من 30 عاما في وسيلة فعالة لتشير إلى وجود أنجيوتنسين الأولأنا مستقبلات وغيرها من مكونات RAS في الدماغ وغيرها من أنسجة الجرذان والفئران، خنزير غينيا، والكلب والإنسان في إطار مجموعة من الظروف التجريبية 22-34. أهمية تحديد مستقبلات انج الثاني داخل الدماغ هو أن واحدة يمكن تطبيقها التشريح الوظيفي لتصرفات انج الثاني في الدماغ، على سبيل المثال، فإن وجود AT 1 R في النواة مجاور للبطين من منطقة ما تحت المهاد (PVN) يشير إلى وجود وظيفة من آنغ الثاني في الدماغ لتحفيز فاسوبريسين، الأوكسيتوسين أو الإفراج القشرية الافراج عن هرمون (CRH)، أو تفعيل الجهاز العصبي الودي. وهكذا، والأدوية التي تعمل على منع AT 1 R قد يقلل من بعض هذه الآثار بوساطة PVN المرتبط مع أكثر نشاط RAS الدماغ. التقدم في العمل يشير إلى أن استخدام AT 1 الخصوم R يمكن أن تقلل ما بعد الصدمة الإجهاد اضطراب (PTSD) الإفراج -induced من CRH ويخفف من أعراض اضطراب ما بعد الصدمة (هيرت وآخرون، قدم للنشر). وPVN، تحت القبوومن المعروف جهاز (SFO)، واللوزة لتنظيم التوازن، شهية / العطش والنوم والذاكرة، وردود الفعل العاطفية، وهي المناطق المستهدفة من هذه الدراسة مظاهرة. تم فحص هذه المناطق من خلال جمع أقسام الاكليلية من الدماغ على شرائح المجهر، وعلاج المقاطع مع مثبطات محددة جنبا إلى جنب مع لجين مشع معين لمستقبلات انج الثاني. في هذه الدراسة، يتم سرد، واستخدام كافة المواد والكواشف جنبا إلى جنب مع البائعين اقترح اليود 125 إلى radiolabel على مستقبلات انج الثاني، ساركوزين 1، آيسولوسين 8 انج الثاني (SI انج الثاني)، الذي كان آنذاك وتنقيته كما أحادية 125 I -SI انج الثاني باستخدام أساليب HPLC كما هو موضح سابقا (35). استخدام هذا جين مشع نشاط معين مرتفع يسمح التصور من مناطق منخفضة، متوسطة وعالية الكثافة مستقبلات بعد التعرض للأقسام رديولبلد إلى فيلم الأشعة السينية. من خلال معايرة الفيلم مع المعايير عجينة الدماغ التي تحتوي على كميات معروفة من اليود 125، ومبلغ محددمن آنغ الثاني مستقبلات ملزم في منطقة يمكن قياسها كميا. في الدراسات التجريبية، ومستقبلات انج الثاني ملزمة في أدمغة الاشخاص الخاضعين للتجارب يمكن مقارنة ذلك في أدمغة الأشخاص الخاضعين للمراقبة. يمكن أن تشير إلى هذا سواء يتم تغيير تصرفات انج الثاني ردا على حالة وراثية، شذوذ المظهري، دولة المرض أو العلاج من تعاطي المخدرات. ومن ثم يمكن تطبيق هذه المعرفة لتطوير علاجات لعلاج الأمراض المرتبطة ديسريغولاتيون من RAS. التقنيات البديلة التي تحدد مستقبل مواقع الربط، ولكن مع قرار خفض التشريحية، ملزمة المقايسات التي تستخدم الاستعدادات غشاء الأنسجة المستمدة من الخليط الأنسجة، والتي يتم تحضين مع لجين مشع على مجموعة من تركيزات لتقييم جين مشع تقارب ملزمة كما ثابت التفكك (K D ) وقدرة ملزمة القصوى (ماكس ب) من الأنسجة من الاهتمام. بروتوكول صفها هنا يمكن تقسيمها إلى 5 المشارك الرئيسيmponents: إعداد أقسام الأنسجة لمستقبلات تصوير الإشعاع الذاتي. مستقبلات تصوير الإشعاع الذاتي. تعرض فيلم والتنمية؛ علم الانسجة؛ وقياس الكثافة تحليل الصور.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>500ml Plastic Beakers</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-591-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24mm x 60mm Coverslips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-050-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoradiography Imaging Film 24x30cm</td>
			<td>Carestream-Biomax MR Film</td>
			<td>891-2560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacitracin (from Bacillus licheniformis)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-0125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardboard Sheet 8x11</td>
			<td>Crescent Illustration Board #201</td>
			<td>201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin Jars</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E94</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial hair dryers</td>
			<td>Conair</td>
			<td>Model SD6X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Culture Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-961-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Disodium salt, Dihydrate)</td>
			<td>USB Corporation</td>
			<td>15-699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>16-100-210&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formulary Substitute for D-19 Developer</td>
			<td>Photographers Formulary, Inc.&#160;</td>
			<td>01-0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A38 SI-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoprep / OCT</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SH75-125D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Film Fixer</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>5160320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo flo</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>1464502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Losartan</td>
			<td>Fisher/Tocris</td>
			<td>37-985-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCID&#8482; Core 7.0</td>
			<td>MCID</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peel-A-Way slide grips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48440-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SP15-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD123319</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-615-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium Charged Slides , Fine Ground Edge</td>
			<td>Premiere Microscope Slides</td>
			<td>9308W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125I Ligands</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEX- 248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125SI-Ang II&#160;</td>
			<td>George Washington University</td>
			<td>Radioiodinated by Dr. Speth</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Mailers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>HS15986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dibasic Phosphate Anhydrous (Na2PO4)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>RDCS0750500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate (Anhydrous)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP333-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thionin&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>T409-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Ray Casette (10 x 12)</td>
			<td>Spectronics Corporation</td>
			<td>Four Square</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>X3P-1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

receptor autoradiography protocol for the localized visualization of angiotensin ii receptors

يصف هذا البروتوكول مستقبلات أنماط ملزمة للأنجيوتنسين الثاني (آنغ الثاني) في الدماغ الفئران باستخدام جين مشع معين لمستقبلات انج الثاني لأداء مستقبلات رسم الخرائط autoradiographic. ويتم حصاد عينات الأنسجة وتخزينها في -80 درجة مئوية. ويستخدم ناظم البرد إلى قسم coronally النسيج (الدماغ) وذوبان الجليد يشن المقاطع على الشرائح المشحونة. يتم تحضين المقاطع الأنسجة محمولة على الشرائح في 125 I-SI-آنغ الثاني لradiolabel مستقبلات انج الثاني. يتم فصل الشرائح المجاورة إلى مجموعتين: &quot;غير محددة ملزمة&quot; (اس بي) في وجود مستقبلات تشبع تركيز غير رديولبلد انج الثاني، أو AT 1 آنغ الثاني مستقبلات النوع الفرعي (AT 1 R) انتقائية انج الثاني مستقبلات و&#39;توتال ملزمة &quot;مع عدم وجود AT 1 R خصم. وهناك تركيز تشبع من AT 2 انج الثاني مستقبلات النوع الفرعي (AT 2 R) خصم (PD123319، 10 ميكرومتر) موجود أيضا في incubatiعلى عازلة للحد 125 I-SI-آنغ الثاني ملزما للR النوع الفرعي AT 1. خلال 30 دقيقة قبل الحضانة في ~ 22 درجة مئوية، وتتعرض الشرائح برنامج الفضاء الوطني إلى 10 ميكرومتر PD123319 واللوسارتان، في حين أن &#39;توتال ملزمة &quot;يتعرض الشرائح إلى 10 ميكرومتر PD123319. ثم يتم تحضين الشرائح مع 125 I-SI-آنغ الثاني في وجود PD123319 ل &#39;مجموع ملزمة &quot;، وPD123319 واللوسارتان لبرنامج الفضاء الوطني في المخزن الفحص، تليها عدة&quot; يغسل &quot;في المخزن، والماء لإزالة الملح وغير ملزمة لجين مشع على وجه التحديد. يتم تجفيفها الشرائح باستخدام ضربة المجففات، ثم تتعرض لفيلم تصوير الإشعاع الذاتي باستخدام فيلم المتخصصة والكاسيت. تم تطوير الفيلم ويتم تفحص الصور إلى جهاز كمبيوتر لقياس كثافة بصرية والكمية باستخدام نظام التصوير الملكية والبيانات. مجموعة إضافية من الشرائح وثيونين-ملطخة للمقارنات النسيجية. وميزة استخدام مستقبلات تصوير الإشعاع الذاتي هو القدرة على تصورآنج مستقبلات الثاني في الموقع، في قسم من عينة الأنسجة، وتشريحيا تحديد منطقة الأنسجة عن طريق مقارنتها إلى قسم المراجع النسيجي المجاور.

Watch this Scientific Journal Video about Receptor Autoradiography Protocol for the Localized Visualization of Angiotensin II Receptors at JoVE.com

Receptor Autoradiography Protocol for the Localized Visualization of Angiotensin II Receptors

Here we present a protocol to describe the localization of angiotensin II Type 1 receptors in the rat brain by quantitative, densitometric, in vitro receptor autoradiography using an iodine-125 labeled analog of angiotensin II.

بروتوكول تصوير الإشعاع الذاتي مستقبلات للالتصور المترجمة من أنجيوتنسين الثاني المستقبلات

This protocol describes receptor binding patterns for Angiotensin II (Ang II) in the rat brain using a radioligand specific for Ang II receptors to ...

receptor-autoradiography-protocol-for-localized-visualization

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.8K Views.  Nova Southeastern University. Here we present a protocol to describe the localization of angiotensin II Type 1 receptors in the rat brain by quantitative, densitometric, in vitro receptor autoradiography using an iodine-125 labeled analog of angiotensin II. 

Video: Receptor Autoradiography Protocol for the Localized Visualization of Angiotensin II Receptors

The NeuroStar TMS Device: Conducting the FDA Approved Protocol for Treatment of Depression

The Neuronetics NeuroStar Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) System is a class II medical device that produces brief duration, pulsed magnetic fields. These rapidly alternating fields induce electrical currents within localized, targeted regions of the cortex which are associated with various physiological and functional brain changes.1,2,3
In 2007, O'Reardon et al., utilizing the NeuroStar device, published the results of an industry-sponsored, multisite, randomized, sham-stimulation controlled clinical trial in which 301 patients with major depression, who had previously failed to respond to at least one adequate antidepressant treatment trial, underwent either active or sham TMS over the left dorsolateral prefrontal cortex (DLPFC). The patients, who were medication-free at the time of the study, received TMS five times per week over 4-6 weeks.4
The results demonstrated that a sub-population of patients (those who were relatively less resistant to medication, having failed not more than two good pharmacologic trials) showed a statistically significant improvement on the Montgomery-Asberg Depression Scale (MADRS), the Hamilton Depression Rating Scale (HAMD), and various other outcome measures. In October 2008, supported by these and other similar results5,6,7, Neuronetics obtained the first and only Food and Drug Administration (FDA) approval for the clinical treatment of a specific form of medication-refractory depression using a TMS Therapy device (FDA approval K061053).
In this paper, we will explore the specified FDA approved NeuroStar depression treatment protocol (to be administered only under prescription and by a licensed medical profession in either an in- or outpatient setting).

In this article, we examine the methodology and considerations relevant to the FDA approved depression treatment protocol using the Neuronetics NeuroStar TMS device.

وافق إجراء بروتوكول ادارة الاغذية والعقاقير لعلاج الاكتئاب : جهاز TMS NeuroStar

The Neuronetics NeuroStar Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) System is a class II medical device that produces brief duration, pulsed magnetic ...

Automated Interactive Video Playback for Studies of Animal Communication

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, parameter-based computer animation offers the opportunity to independently manipulate any number of behavioral, morphological, or spectral characteristics in the context of realistic, moving images of animals on screen. A major limitation of conventional playback, however, is that the visual stimulus lacks the ability to interact with the live animal. Borrowing from video-game technology, we have created an automated, interactive system for video playback that controls animations in response to real-time signals from a video tracking system. We demonstrated this method by conducting mate-choice trials on female swordtail fish, Xiphophorus birchmanni. Females were given a simultaneous choice between a courting male conspecific and a courting male heterospecific (X. malinche) on opposite sides of an aquarium. The virtual male stimulus was programmed to track the horizontal position of the female, as courting males do in the wild. Mate-choice trials on wild-caught X. birchmanni females were used to validate the prototype's ability to effectively generate a realistic visual stimulus.

Video playback is a widely used technique in animal behavior. We created and evaluated a program that applies rules-based, interactive playback of 3-D computer animations in response to real-time, automated data on subject behavior.

المؤتمتة عرض الفيديو التفاعلي للدراسات الاتصالات الحيوانية

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, ...

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

الحبل الشوكي الكهربية ثانيا : خارج الخلية التصنيع الكهربائي شفط

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

تصور في Proprioceptors<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; يرقات وشرانق

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

كله من جبل Immunolabeling الشم مستقبلات الخلايا العصبية في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الهوائي

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

High-throughput Analysis of Mammalian Olfactory Receptors: Measurement of Receptor Activation via Luciferase Activity

Odorants create unique and overlapping patterns of olfactory receptor activation, allowing a family of approximately 1,000 murine and 400 human receptors to recognize thousands of odorants. Odorant ligands have been published for fewer than 6% of human receptors1-11. This lack of data is due in part to difficulties functionally expressing these receptors in heterologous systems. Here, we describe a method for expressing the majority of the olfactory receptor family in Hana3A cells, followed by high-throughput assessment of olfactory receptor activation using a luciferase reporter assay. This assay can be used to (1) screen panels of odorants against panels of olfactory receptors; (2) confirm odorant/receptor interaction via dose response curves; and (3) compare receptor activation levels among receptor variants. In our sample data, 328 olfactory receptors were screened against 26 odorants. Odorant/receptor pairs with varying response scores were selected and tested in dose response. These data indicate that a screen is an effective method to enrich for odorant/receptor pairs that will pass a dose response experiment, i.e. receptors that have a bona fide response to an odorant. Therefore, this high-throughput luciferase assay is an effective method to characterize olfactory receptors&#8212;an essential step toward a model of odor coding in the mammalian olfactory system.

Olfactory receptor activation patterns encode odor identity, but the lack of published data identifying odorant ligands for mammalian olfactory receptors hinders the development of a comprehensive model of odor coding. This protocol describes a method to facilitate high-throughput identification of olfactory receptor ligands and quantification of receptor activation.

تحليل الإنتاجية العالية من الثدييات شمي المستقبلات: قياس مستقبلات التنشيط عبر luciferase المراسل آخر

Odorants create unique and overlapping patterns of olfactory receptor activation, allowing a family of approximately 1,000 murine and 400 human receptors ...

Direct Visualization of the Murine Dorsal Cochlear Nucleus for Optogenetic Stimulation of the Auditory Pathway

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. Few studies have examined gene transfer to the central auditory system. The dorsal cochlear nucleus (DCN) of the brainstem, which contains second order neurons of the auditory pathway, is a potential site for gene transfer. In this protocol, a technique for direct and maximal exposure of the murine DCN via a posterior fossa approach is demonstrated. This approach allows for either acute or survival surgery. Following direct visualization of the DCN, a host of experiments are possible, including injection of opsins into the cochlear nucleus and subsequent stimulation by an optical fiber coupled to a blue light laser.&#160;Other neurophysiology experiments, such as electrical stimulation and neural injector tracings are also feasible.&#160;The level of visualization and the duration of stimulation achievable make this approach applicable to a wide range of experiments.

The goal of this protocol is to outline a surgical approach to provide direct access to the dorsal cochlear nucleus in a murine model.

التصور المباشر من الفئران الظهرية القوقعة نواة لOptogenetic تحفيز من المسار السمعي

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. ...

Protocol for Isolating the Mouse Circle of Willis

The cerebral arterial circle (circulus arteriosus cerebri) or circle of Willis (CoW) is a circulatory anastomosis surrounding the optic chiasma and hypothalamus that supplies blood to the brain and surrounding structures. It has been implicated in several cerebrovascular disorders, including cerebral amyloid angiopathy (CAA)-associated vasculopathies, intracranial atherosclerosis and intracranial aneurysms. Studies of the molecular mechanisms underlying these diseases for the identification of novel drug targets for their prevention require animal models. Some of these models may be transgenic, whereas others will involve isolation of the cerebro-vasculature, including the CoW.The method described here is suitable for CoW isolation in any mouse lineage and has considerable potential for screening (expression of genes, protein production, posttranslational protein modifications, secretome analysis, etc.) studies on the large vessels of the mouse cerebro-vasculature. It can also be used for ex vivo studies, by adapting the organ bath system developed for isolated mouse olfactory arteries.

We describe here a reproducible protocol for isolating the mouse circle of Willis.

بروتوكول لعزل الدائرة ماوس ويليس

The cerebral arterial circle (circulus arteriosus cerebri) or circle of Willis (CoW) is a circulatory anastomosis surrounding the optic chiasma and ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory neurons (VSNs) express a specific type of G protein-coupled receptor (GPCR) from at least three different chemoreceptor gene families allowing sensitive and specific detection of chemosensory cues. These families comprise the V1r and V2r gene families as well as the formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) family of putative chemoreceptor genes. In order to understand the physiology of vomeronasal receptor-ligand interactions and downstream signaling, it is essential to identify the biophysical properties inherent to each specific class of VSNs.
The physiological approach described here allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons using a transgenic mouse line (Fpr-rs3-i-Venus). The use of this protocol, however, is not restricted to this specific line and thus can easily be extended to other genetically modified lines or wild type animals.

Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings.

في التحليل المتعمق الفسيولوجية لبالسكان خلية المعرفة في الحادة الأنسجة شرائح من الميكعي الجهاز ماوس

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

وبسيطة خطوة واحدة بروتوكول تشريح لجبل لالجامع إعداد الكبار<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; أدمغة

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...