We appreciate the colleagues in Taiwan Cetacean Society, Marine Biology and Cetacean Research Center of National Cheng Kung Univerisy, Farglory Ocean Park, and Animal Disease Diagnostic Center of National Chiayi Universiy for sample collection. This project was funded by grant to WCY from the Council of Agriculture of Taiwan (100AS-02.1-FB99).

<ol>
	<li>Robards, M. D., Reeves, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+extent+and+character+of+marine+mammal+consumption+by+humans:+1970-2009.">The global extent and character of marine mammal consumption by humans: 1970-2009.</a> Biol. Conserv. 144, 2770-2786 (2011).</li><li>Booth, S., Zeller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mercury,+food+webs,+and+marine+mammals:+implications+of+diet+and+climate+change+for+human+health.">Mercury, food webs, and marine mammals: implications of diet and climate change for human health.</a> Environ. Health Perspect. 113, 521-526 (2005).</li><li>Endo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+mercury,+methyl+mercury,+and+selenium+levels+in+the+red+meat+of+small+cetaceans+sold+for+human+consumption+in+Japan.">Total mercury, methyl mercury, and selenium levels in the red meat of small cetaceans sold for human consumption in Japan.</a> Environ. Sci. Technol. 39, 5703-5708 (2005).</li><li>Tryland, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pathogens+in+marine+mammal+meat.">Human pathogens in marine mammal meat.</a> Norwegian Scientific Committee for Food Safety (VKM). , (2011).</li><li>Matsunaga, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quick+and+simple+method+for+the+identification+of+meat+species+and+meat+products+by+PCR+assay.">A quick and simple method for the identification of meat species and meat products by PCR assay.</a> Meat Sci. 51, 143-148 (1999).</li><li>Dalebout, M. L., Helden, A. V., van Waerebeek, K., Baker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetic+identification+of+southern+hemisphere+beaked+whales+(Cetacea:+Ziphiidae).">Molecular genetic identification of southern hemisphere beaked whales (Cetacea: Ziphiidae).</a> Mol. Ecol. 7, 687-694 (1998).</li><li>Dalmasso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+PCR+assay+for+the+identification+of+animal+species+in+feedstuffs.">A multiplex PCR assay for the identification of animal species in feedstuffs.</a> Mol. Cell. Probes. 18, 81-87 (2004).</li><li>Kesmen, Z., Sahin, F., Yetim, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+assay+for+the+identification+of+animal+species+in+cooked+sausages.">PCR assay for the identification of animal species in cooked sausages.</a> Meat Sci. 77, 649-653 (2007).</li><li>Liu, L., Chen, F. -. C., Dorsey, J. L., Hsieh, Y. -. H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+Monoclonal+Antibody-based+Sandwich+ELISA+for+the+Detection+of+Porcine+Skeletal+Muscle+in+Meat+and+Feed+Products.">Sensitive Monoclonal Antibody-based Sandwich ELISA for the Detection of Porcine Skeletal Muscle in Meat and Feed Products.</a> J. Food Sci. 71, 1-6 (2006).</li><li>Kotoura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Sandwich+ELISA+for+the+Determination+of+Beef+Meat+Content+in+Processed+Foods.">A Sandwich ELISA for the Determination of Beef Meat Content in Processed Foods.</a> Food Sci. Techno. Res. 15, 613-618 (2009).</li><li>Hsieh, Y. H., Chen, Y. T., Gajewski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibody-based+sandwich+ELISA+for+reliable+identification+of+imported+Pangasius+catfish.">Monoclonal antibody-based sandwich ELISA for reliable identification of imported Pangasius catfish.</a> J. Food Sci. 74, 602-607 (2009).</li><li>Ross, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+surveillance:+web-based+molecular+identification+of+whales,+dolphins,+and+porpoises.">DNA surveillance: web-based molecular identification of whales, dolphins, and porpoises.</a> J.Hered. 94, 111-114 (2003).</li><li>Ngom, B., Guo, Y., Wang, X., Bi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+lateral+flow+test+strip+technology+for+detection+of+infectious+agents+and+chemical+contaminants:+a+review.">Development and application of lateral flow test strip technology for detection of infectious agents and chemical contaminants: a review.</a> Anal. Bioanal. Chem. 397, 1113-1135 (2010).</li><li>Muldoon, M. T., Onisk, D. V., Brown, M. C., Stave, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targets+and+methods+for+the+detection+of+processed+animal+proteins+in+animal+feedstuffs.">Targets and methods for the detection of processed animal proteins in animal feedstuffs.</a> Int. J. Food Sci. Technol. 39, 851-861 (2004).</li><li>Rao, Q., Hsieh, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+commercial+lateral+flow+feed+test+for+rapid+detection+of+beef+and+sheep+content+in+raw+and+cooked+meats.">Evaluation of a commercial lateral flow feed test for rapid detection of beef and sheep content in raw and cooked meats.</a> Meat Sci. 76, 489-494 (2007).</li><li>Tamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEGA5:+molecular+evolutionary+genetics+analysis+using+maximum+likelihood,+evolutionary+distance,+and+maximum+parsimony+methods.">MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods.</a> Mol. Biol. Evol. 28, 2731-2739 (2011).</li><li>Atassi, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigenic+structure+of+myoglobin:+the+complete+immunochemical+anatomy+of+a+protein+and+conclusions+relating+to+antigenic+structures+of+proteins.">Antigenic structure of myoglobin: the complete immunochemical anatomy of a protein and conclusions relating to antigenic structures of proteins.</a> Immunochemistry. 12, 423-438 (1975).</li><li>Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybridoma+technology+for+the+generation+of+monoclonal+antibodies.">Hybridoma technology for the generation of monoclonal antibodies.</a> Methods Mol. Biol. 901, 117-135 (2012).</li><li>Kao, D. J., Hodges, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+a+synthetic+peptide+immunogen+over+a+protein+immunogen+in+the+development+of+an+anti-pilus+vaccine+for+Pseudomonas+aeruginosa.">Advantages of a synthetic peptide immunogen over a protein immunogen in the development of an anti-pilus vaccine for Pseudomonas aeruginosa.</a> Chem. Biol. Drug Des. 74, 33-42 (2009).</li><li>Dolar, M. L., Suarez, P., Ponganis, P. J., Kooyman, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myoglobin+in+pelagic+small+cetaceans.">Myoglobin in pelagic small cetaceans.</a> J. Exp. Biol. 202, 227-236 (1999).</li><li>Lo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+immune+colloidal+gold+strip+for+cetacean+meat+restraining+illegal+trade+and+consumption:+implications+for+conservation+and+public+health.">Rapid immune colloidal gold strip for cetacean meat restraining illegal trade and consumption: implications for conservation and public health.</a> PLoS ONE. 8, e60704 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

باستخدام الببتيد الاصطناعية مترافق إلى البروتين الناقل هو ملحوظ أكثر فعالية مقارنة مع البروتين وما شابه ذلك. لمعدات القائم على شطيرة، لأنه يتم تطوير ماب باستخدام الحواتم مع المواقع النسبية المعروفة، وMABS اثنين في هذه الدراسة من غير المحتمل أن تتداخل مع تفاعل كل منهما مع حاتمة المستضد الهدف. وعلاوة على ذلك، فإن التفاعل بين البروتين الأصلي والأجسام المضادة من الفئران تحصين مع الاصطناعية الببتيد المترافقة قد تكون أقوى من التفاعل بين البروتين الأصلي والأجسام المضادة التي تنتج من البروتين الأصلي 19. لذا ينصح استخدام تقارن الببتيد الاصطناعية لإجراءات التحصين فعالة وجيل من المناسب ماب مكافحة الببتيد. بنية البروتين ينطوي أساسا تسلسل الأحماض الأمينية في سلسلة ببتيد. كل الأحماض الأمينية يحتوي على جانب سلسلة مما يؤدي إلى خصائص معينة، وتغيير طفيف في المجلس الدولي للمطارات الأمينيةالنتائج د تسلسل في التغييرات هيكل. لأن الببتيدات بطول 10-20 الأحماض الأمينية هي مثالية لإعداد الأجسام المضادة، تم زيادة طول الببتيدات الاصطناعية (مستمنع) في المنطقة C-الطرفية لضمان أن يتم الاعتراف المنطقة مولدة الأساسية. ولذلك، فإن بقايا الأحماض الأمينية بين MBS من الحيوانات المختلفة مما أدى إلى هياكل حاتمة مختلفة يمكن تمييزها بكفاءة. على سبيل المثال، 3A الشكل يدل على تصميم الببتيد المذكورة يساهم في CGF5H9 التفاعل بقوة مع الحيتان ولكن سلبا مع الأختام. مثال آخر هو الانتماءات متميزة نحو الدجاج والكلاب من CGF5H9 على الرغم من أن الدجاج يحتوي على تسلسل متطابقة إلى أن من الكلب في الموقع المستضدية الأساسية 2. وهذا يدل على أن الفرق تسلسل في المنطقة الخارجية يمكن أن يؤدي إلى تغيير بنية وبالتالي متغير تقارب بين المستضد والأجسام المضادة ملزمة. استخدمت طخة غربية، نقطة وصمة عار، وإليسا غير مباشر فيلدينا وسيلة لفحص MABS مناسبة. يستخدم على نطاق واسع لطخة غربية للكشف عن بروتينات معينة في انتزاع الأنسجة أو جناسة. في هذه التقنية، ويستخدم الكهربائي للهلام لفصل البروتينات التشويه والتحريف من قبل طول ببتيد. لذلك، فمن الممكن للتأكد مما اذا تشير إشارة البروتين وتوقع الوزن الجزيئي. ومع ذلك، فإن نتيجة الكشف (إشارة إيجابية أو سلبية، قوية أو ضعيفة) قد لا يمثل الوضع الحقيقي للمستضد الضد ملزمة لأنه يتم استخدام البروتينات التشويه والتحريف. ونتيجة لذلك، نقطة لطخة يمكن استخدامها للكشف عن المرحلة الثانية. نقطة لطخة هو أسلوب للكشف عن البروتينات. وهو يمثل تبسيط طريقة لطخة الغربي. في لطخة نقطة، يتم تطبيق مزيج يحتوي على جزيء يتم الكشف مباشرة على غشاء بمثابة نقطة. وهذا يختلف من وصمة عار الغربية لأنه لم يتم التشويه والتحريف عينات البروتين. لاحظ أن هذا الأسلوب لا يقدم أي معلومات عن حجم جزيء حيوي الهدف، وسوف تظهر نقطة واحدة إذا كان اثنان موتم الكشف عن lecules من مختلف الأحجام. وأخيرا، يتم استخدام ELISA غير المباشرة لفحص ملزم يجند من أجل توليد إشارة التي يمكن قياسها بشكل صحيح. فإنه يوفر المزيد من المعلومات عن خصائص الإنسان والمحيط الحيوي، وبالتالي يسهل بناء القطاع. تركيزات ميغابايت في العضلات هي متغيرة تبعا لموقع المجموعة. على سبيل المثال، العضلات السباحة (العضلات محوري) في الثدييات البحرية لديها نسبة أعلى بكثير من ميغابايت مقارنة مع عضلات غير السباحة، وسوف عينات من الثدييات البحرية شابة لديها تركيز ميجا بايت أقل بسبب زيادة تركيز ميغابايت طوال حياة الحيوان 20. في البداية، CSF1H13، الذي يجسد فقط ميغابايت من الحيتان والفقمة، كان القصد منه أن يكون الغروي المسمى الذهب ويكون الكشف عن الأجسام المضادة، وCGF5H9، الذي يعترف ميغابايت من كثير من الأنواع، سيكون التقاط الأجسام المضادة على خط الاختبار. ونحن افترضنا أن الأجسام المضادة كشف ينبغي أن تكون أكثر تحديدا ويجب أن الأجسام المضادة القبضتكون أكثر عمومية. ومع ذلك، تم العثور على إشارة إيجابية ضعيفة على الخط اختبار عندما استخدمت عينات الحيتان مع تركيزات منخفضة ميجا بايت (لا تظهر البيانات). تم حل المشكلة عندما تم عكس مواقف MABS اثنين كما هو موضح في نتائج تمثيلية. وقد تبين حتى إشارة جيدة لالحيتانيات حديثي الولادة (أ تقطعت بهم السبل الحوت أومورا ل) (الشكل 4). ومن غير الواضح ما إذا كانت الخصائص وتركيز MABS تساهم في هذه الظاهرة. في هذه الدراسة، تم استخدام عينات العضلات المجمدة إذابة المتجانس مع برنامج تلفزيوني على اختبار الشريط. شروط عينة أخرى وأساليب إعداد قد تؤثر على النتيجة. على سبيل المثال، يجب أن يتم استخراج البروتين والملح للذوبان مثل ميغابايت باستخدام برنامج تلفزيوني بدلا من الماء النقي. خلاف ذلك، قد يكون استخراج كافية، الأمر الذي قد يؤدي إلى نتيجة شاذة. المناسبة استخراج العازلة: نسبة عينة اللحوم مسؤولة جزئيا عن تفسير الناجح لنتيجة القطاع. عمو كبيرالإقليم الشمالي (0.3 غرام في 1 مل العازلة) للعينات السيطرة (على سبيل المثال، الحيوانات الأليفة) يمكن أن تسبب نتيجة إيجابية وخلفية واضحة. ومع ذلك، فإن نسبة المستخدمة في هذه الدراسة (1: 0.03) تنتج النتائج الصحيحة. فقط عينات العضلات جديدة يمكن استخدامها لهذا الاختبار الشريط. البروتين يمكن أن تحلل أو التشويه والتحريف بعد العلاج معينة (مثل علاج من صلصة الصويا والغليان)، والتي يمكن أن تسبب نتائج إيجابية ليس فقط بالنسبة للعينات العضلات الحيتان ولكن أيضا عينات من الحيوانات الأخرى (لا تظهر البيانات). لذلك، يقترح أن مصادر عينة متغيرة ومختلفة خطط تصميم البناء ينبغي أن تستخدم خلال تطوير القطاع. في الختام، يصف هذا البروتوكول تطوير اثنين من MABS رد الفعل بقوة ميغابايت من الثدييات البحرية، وتطبق هذه MABS على شريط اختبار سريع للتمييز بين ميغابايت من الثدييات البحرية من ختم وغيرها من الحيوانات. على الرغم من موثوق تحليل الحمض النووي القائم على PCR لتحديد اللحوم الحوتيات متاح 12، هو أناالصورة كثيفة العمالة وتستغرق وقتا طويلا. شريط الاختبار السريع هو تقنية يمكن الاعتماد عليها والسريعة التي يمكن استخدامها في هذا المجال لتحديد اللحوم الحيتان، وهو مرغوب فيه للغاية بالنسبة للوكالات التنظيمية 21. ومن المرجح أن الشريط يمكن تطويرها للكشف عن MBS محددة من الحيوانات مثل الخيول أو الخنازير.

Historically, cetacean meat has been consumed in many parts of the world and this consumption continues today1. Due to the trophic level of cetaceans, high levels of mercury and other toxins are known to be present in their meat2. Therefore, the consumption of cetacean meat could lead to a health problem not only for high-risk groups such as pregnant women but also for the general population3. Furthermore, the contamination of cetacean meat with zoonotic or potentially zoonotic pathogens can also occur during its processing and storage4. It is difficult even for experienced agents to identify cetacean meats by their appearance alone. Therefore, a reliable scientific method of identification is required to differentiate cetacean meat from other meats. This would help to limit the consumption of cetacean meat.
Current methods of species identification include molecular techniques and immunological methods. Molecular techniques, such as polymerase chain reaction (PCR) and DNA sequencing, can be used to identify samples not only from raw meat5 and decomposed samples6 but also from processed foods such as cooked sausage and feedstuffs7,8. Immunological methods, such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), are commonly applied in food production to detect the meat content of, for example, pork9, beef10 and catfish11. PCR-based DNA analysis for the identification of cetacean meat is available12, and has helped prevent the illegal international trade of cetacean meat in Japan, South Korea, the Philippines, Taiwan, Hong Kong, Russia, Norway, and the United States1. These methods are effective and reliable, but they can take hours or days to complete and involve laborious steps. The identification of cetacean meats is usually based on molecular techniques and there is currently no immunological method available. For regulatory agencies, it is highly desirable to develop a dependable and rapid technique that can be used in the field to identify cetacean meats. 
Immunochromatographic strips are used as detection tools with the advantage of producing rapid result via a simple protocol that is suitable for use in the field. The principles of the immunochromatographic strip and ELISA are very similar, and includes antibodies, antigens and labels. Many different labels such as colloidal gold, carbon and latex have been used in the development of immunochromatographic strips. At present, this method is commonly used for detecting antibiotics, toxin, bacteria and viruses13, but it is rarely used for identifying proteins in meat14,15. Here we propose a lateral-flow chromatographic enzyme immunoassay for rapid detection of cetacean myoglobin (Mb).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1007">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:512px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:183px;">AMRESCO</td>
			<td style="width:148px;">J373</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:512px;">Protein G HP SpinTrap&#160;</td>
			<td>GE&#160;Healthcare</td>
			<td>28-9031-34</td>
			<td>spin column containing Protein G Sepharose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:512px;">IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11493027001</td>
			<td>Isotyping Strips, precoated with subclass- and light-chain-specific anti-mouse-Ig antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini Trans-Blot</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-3935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>Z613630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibody blocker solution&#160;</td>
			<td>LTK BioLaboratories</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td>To minimize nonspecific binding interactions of nonspecific IgG in the samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:512px;">BCIP/NBT phosphatase substrate&#160;</td>
			<td>KPL</td>
			<td>50-81-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein Detector HRP Microwell Kit, Anti-Mouse</td>
			<td style="width:183px;">KPL</td>
			<td>54-62-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nunc Immunoplate MaxiSorp ELISA plate</td>
			<td>Thermo&#160;Fisher Scientific</td>
			<td>EW-01928-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multiskan&#160;EX ELISA reader&#160;</td>
			<td>Thermo&#160;Electron&#160;Corporation</td>
			<td>51118170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Colloid gold (40 nm) solution&#160;</td>
			<td>REGA biotechnology Inc.</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td>40-50 nm is appropriate for immunostrip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum albumin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15561-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rapid test immno-strip printer</td>
			<td>REGA biotechnology Inc.</td>
			<td>AGISMART RP-1000&#160;</td>
			<td>Only suited for small scale production of immunostrips for research and development purposes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:512px;">Strip components (NC membranes, sample pads (#33 glass, S&#38;S), conjugate pads (#16S, S&#38;S) and absorbent pads (CF6, Whatman))</td>
			<td>REGA biotechnology Inc.</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Freund&#8217;s adjuvant and incomplete Freund&#8217;s adjuvant&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:148px;">F5881, F5506</td>
			<td>Used to produce water-in-oil emulsions of immunogens</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:512px;">Acrylamide, gel buffer, ammonium persulfate (APS), tetramethylethylenediamine (TEMED)&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Protech</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td>Gel preparation for SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coomassie brilliant blue R-250</td>
			<td style="width:183px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:148px;">1610436</td>
			<td>Protein staining in SDS-PAGE gels</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laemmli sample buffer and &#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:183px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:148px;">1610737, 1610710</td>
			<td>Dilute protein samples before loading on SDS-PAGE gels</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of a colloidal gold-based immunochromatographic test strip for detection of cetacean myoglobin

This protocol describes the development of a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format that can be used to differentiate the myoglobin (Mb) of cetaceans from that of seals and other animals. The strip provides rapid and on-the-spot screening for cetacean meat, thereby restraining its illegal trade and consumption. Two monoclonal antibodies (mAbs) with reactivity toward the Mb of cetaceans were developed. The amino acid sequences of Mb antigenic reactive regions from various animals were analyzed in order to design two synthetic peptides (a general peptide and a specific peptide) and thereafter raise the mAbs (subclass IgG1). The mAbs were selected from hybridomas screened by indirect ELISA, western blot and dot blot. CGF5H9 was specific to the Mbs of rabbits, dogs, pigs, cows, goats, and cetaceans while it showed weak to no affinity to the Mbs of chickens, tuna and seals. CSF1H13 can bind seals and cetaceans with strong affinity but showed no affinity to other animals. Cetacean samples from four families (Balaenopteridae, Delphinidae, Phocoenidae and Kogiidae) were used in this study, and the results indicated that these two mAbs have broad binding ability to Mbs from different cetaceans. These mAbs were applied on a sandwich-type colloidal gold immunochromatographic test strip. CGF5H9, which recognizes many species, was colloid gold-labeled and used as the detection antibody. CSF1H13, which was coated on the test zone, detected the presence of cetacean and seal Mbs. Muscle samples from tuna, chicken, seal, five species of terrestrial mammals and 15 species of cetaceans were tested in triplicate. All cetacean samples showed positive results and all the other samples showed negative results.

خصائص الأجسام المضادة وحيدة النسيلة وضعنا اثنين مفتش 1 MABS (CGF5H9 وCSF1H13) الاعتراف اثنين من الببتيدات الاصطناعية (MKASEDLKKHGNTVLC وAIIHVLHSRHPAEFGC)، على التوالي، من الحوتيات ميغابايت، وكانت تستخدم هذه لبناء شطيرة من نوع الذهب الغروية شريط الاختبار المناعي للكشف السريع ميغابايت الحيتان. ويبين الشكل 2 أن CGF5H9 بالكشف عن الحيتان والثدييات الأخرى والفرقة الملون واحدة في الوزن الجزيئي وتوقع من تقريبي 17 كيلو دالتون. وحوت المنك المشترك (هركول acutorostrata) يظهر الفرقة خفوتا نسبيا من العصابات الثدييات البحرية الأخرى. العصابات غائبة عن سمك التونة والدجاج والأختام، في حين لوحظ الفرقة في حوالي 50 كيلو دالتون للخنازير. بالرغم من وجود عصابات غير محددة متعددة للخنازير والتونة، CSF1H13 غير محددة للغاية لأنه يتفاعل فقط مع الحيتان والفقمة والفرقة في الوزن الجزيئي وتوقع من تقريبي 17 كدا. حوت المنك يظهر سوى إشارة قوية في 01:10 (لا تظهر البيانات) مع عدم وجود إشارة لوحظ في 01:25. ويبين الشكل 2 نتائج متطابقة في وصمة عار نقطة. ويبين الشكل 3A أن CGF5H9 يدل إشارة إيجابية عن الحيتان والأرانب والكلاب والماعز، والأبقار (قيمة OD&gt; 3.0)؛ ضعف إشارة إيجابية للخنازير (قيمة OD = 1.5)؛ إشارة سلبية لأختام والدجاج والتونة. ويبين الشكل 3B أن CSF1H13 عن قابلية عالية تجاه الحيتان والفقمة (قيمة OD&gt; 3.0). كلا CSF1H13 وCGF5H9 يمكن أن تتفاعل بقوة مع كل أنواع الحيتان الأربعة. هذه الأنواع الأربعة هي من عائلات مختلفة (حوت المنك: Balaenopteridae، الدلفين: Delphinidae، قزم حوت العنبر: Kogiidae، finless خنزير البحر: Phocoenidae)، مما يدل على التفاعل واسع لأنواع الحيتان متنوعة. لبناء قطاع، CGF5H9، الذي يعترف رانه MBS الثدييات البحرية والثدييات الأخرى، غير الغروي وتستخدم الأجسام المضادة الكشف لربط الميوجلوبين، والمغلفة CSF1H13 على خط الاختبار فقط لالتقاط MBS من الحيتان والفقمة وصفت الذهب. لذلك تم تصميم خط اختبار لإظهار إشارة إيجابية عندما كشف كل من MABS ميغابايت الحيتان. لأن ميغابايت من الحيوانات غير الحيتان يمكن الكشف عنها إلا من خلال واحدة من هذه MABS، وهما خط اختبار يظهر نتيجة سلبية عندما يتم اختبار عينات العضلات من الحيوانات الأخرى. خط السيطرة يظهر دائما نتيجة ايجابية لأرنب لمكافحة فأر مفتش يربط الغروانية المسمى الذهب CGF5H9. ونتيجة فشل في خط السيطرة تشير إلى أن نوعية المواد على الشريط رديئة. اختبار الشريط ويبين الشكل 4 العصابات إشارة في كل خط الاختبار وخط السيطرة عند استخدام عينات العضلات الحيتان. عندما العينة ليست من الثدييات البحرية، لا يوجد سوى فرقة واحدة في واي خط السيطرةث غياب الفرقة عند خط الاختبار. نتيجة ناجحة يمكن ملاحظتها مباشرة في 5-10 دقيقة بعد المجانسة 0.03 غرام من العضلات مع 10 مل PBS تحتوي على 0.1٪ BSA باستخدام البلاستيك أو عصا الخيزران وتمرغ الشريط في الخليط. بعد اختبار 15 نوعا الحيتان وثمانية أنواع غير الثدييات البحرية في ثلاث نسخ، والنوعية (نسبة العينات غير الحيتان التعرف بشكل صحيح) والحساسية (النسبة المئوية للعينات الحيتان التي تم تحديدها بشكل صحيح) على حد سواء بنسبة 100٪. <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/53433/53433fig1.jpg" /> والطبقات الشكل 1. تصميم الشريط المناعي. جميع المكونات بعناية إلى بطاقة بدعم من البلاستيك بحيث تتداخل. وهذا يسمح للالكواشف وعينة تدفق حتى من خلال الغشاء ولوحة ماصة. T: منطقة الاختبار. C: المنطقة السيطرة. وقد تم استنساخ هذا الرقم من لو، C. وآخرون السريع المناعة قطاع الذهب الغرويةلالحوتيات اللحوم تقييد التجارة غير المشروعة والاستهلاك: الآثار المترتبة على حفظ والصحة العامة بلوس وان 8، e60704 (2013). دوى:. 10،1371 / journal.pone.0060704 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53433/53433fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/53433/53433fig2.jpg" /> الشكل 2. وصمة عار الغربية وتحليل لطخة دوت باستخدام supernatants هجين. (A) CGF5H9، (ب) CSF1H13. ويمكن لكل من supernatants هجين كشف الحيتان والفرقة الملون واحدة في الوزن الجزيئي وتوقع من تقريبي 17 كيلو دالتون. ميغاواط: حوت المنك، BND: الدلفين، إدارة الرعاية الاجتماعية: حوت العنبر القزم، FP: خنزير البحر finless، PKW: الأقزام حوت قاتل، N: برنامج تلفزيوني (مراقبة سلبية). وقد تم استنساخ هذا الرقم من لو، C. وآخرون السريع المناعة قطاع الذهب الغروية لجetacean اللحوم تقييد التجارة غير المشروعة والاستهلاك: الآثار المترتبة على حفظ والصحة العامة بلوس وان 8، e60704 (2013). دوى:. 10،1371 / journal.pone.0060704 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53433/53433fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/53433/53433fig3.jpg" /> الشكل 3. ELISA غير المباشرة مقتطفات العضلات من الأنواع المختلفة باستخدام MABS النقاء. (A) CGF5H9، (ب) CSF1H13. يمكن الثدييات البحرية الوحيدة تنتج إشارات إيجابية قوية في كل من MABS. وقد تم استنساخ هذا الرقم من لو، C. وآخرون السريع المناعة الغروية قطاع الذهب لحوم الحوتيات تقييد التجارة والاستهلاك غير المشروع:.. الآثار المترتبة على حفظ والصحة العامة بلوس وان 8، e60704 (2013). دوى: 10.1371 / journal.pone.0060704. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53433/53433fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/53433/53433fig4.jpg" /> الشكل 4. خصوصية قطاع الذهب الغروية المناعة T: خط الاختبار. C: خط السيطرة. فقط عند استخدام عينات العضلات الحيتان، نتائج ناجحة (العصابات إشارة في كل خط الاختبار وخط السيطرة) يمكن ملاحظتها. (A) عينات غير الحيتان: 1: البقرة. 2: الماعز. 3: الخنزير. 4: الكلب. 5: الأرنب. 6: سمك التونة. 7: الدجاج. 8: هاربور ختم (PHOCA vitulina). (ب) عينات الحيتان: 1: المنك المشترك الحوت (هركول acutorostrata). 2: أومورا والحوت (هركول omurai). 3: الدلفين الأنف (Tursiops aduncus). 4: الدلفين (T. ترنكيتس). 5: الدلفين فريزر (Lagenodelphis hosei &lt;/ م&gt;). 6: المحيطين الهندي والهادئ الدولفين الأحدب (سوزا تشينينسيس). 7: دلفين ريسو في (غرامبوس سنجابي). 8: Pantropical رصدت شركة دولفين للطاقة (Stenella attenuata). 9: الدلفين ذو أسنان خشنة (bredanensis ستينو). 10: الأقزام حوت قاتل (Feresa attenuata). 11: قصير الزعانف الحوت الرائد (Globicephala macrorhynchus). 12: يرأس البطيخ الحوت (Peponocephala إليكترا). 13: القزم حوت العنبر (Kogia سيما). 14: حوت العنبر القزمي (breviceps ك). 15: خنزير البحر Finless (phocaenoides Neophocaena). وقد تم استنساخ هذا الرقم من لو، C. وآخرون السريع المناعة الغروية قطاع الذهب لحوم الحوتيات تقييد التجارة والاستهلاك غير المشروع:.. الآثار المترتبة على حفظ والصحة العامة بلوس وان 8، e60704 (2013). دوى:. 10،1371 / journal.pone.0060704 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53433/53433fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم</a>. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> أنواع الحيتان </td><td> الأنواع غير الحيتان </td></tr><tr><td> حوت العنبر القزمي (breviceps Kogia) </td><td> ميناء ختم (PHOCA vitulina) </td></tr><tr><td> قزم حوت العنبر (Kogia سيما) </td><td> كلب (كلب familiaris الذئبة) </td></tr><tr><td> قصير الزعانف التجريبية الحوت (Globicephala macrorhynchus) </td><td> أرنب (النقبة Oryctolagus) </td></tr><tr><td> التي ترأسها البطيخ الحوت (Peponocephala إليكترا) </td><td> خنزير (scrofa سوس) </td></tr><tr><td> حوت قاتل قزم (Feresa attenuata) </td><td> الماعز (شعر الإبط كابرا) </td></tr><tr><td> رصدت Pantropical شركة دولفين للطاقة (Stenella attenuata) </td><td> الماشية (بوس الثور) </td></tr><tr><td> الدلفين (توrsiops ترنكيتس) </td><td> الدجاج (جالوس جالوس) </td></tr><tr><td> الدلفين (aduncus Tursiops) </td><td> التونة صفراء الزعانف (Thunnus albacares) </td></tr><tr><td> الدلفين فريزر (Lagenodelphis hosei) </td><td></td></tr><tr><td> المحيطين الهندي والهادئ الدولفين الأحدب (سوزا تشينينسيس) </td><td></td></tr><tr><td> شركة دولفين للطاقة الخام ذو أسنان (bredanensis ستينو) </td><td></td></tr><tr><td> دولفين ريسو في (غرامبوس سنجابي) </td><td></td></tr><tr><td> خنزير البحر Finless (phocaenoides Neophocaena) </td><td></td></tr><tr><td> المشترك حوت المنك (acutorostrata هركول) </td><td></td></tr><tr><td> الحوت أومورا في (هركول أومورا ط) </td><td></td></tr></tbody></table> الجدول 1. الأنواع التي كانت العضلات كوليالإدارة التنفيذية واختبارها في هذه الدراسة، وتشمل الأنواع التونة، الدجاج، ختم، 5 أنواع من الثدييات الأرضية، و 15 نوعا من الثدييات البحرية (4 أسرة). <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> نوع </td><td> الانضمام لا. </td></tr><tr><td> المشترك حوت المنك (acutorostrata هركول) </td><td> P02179 </td></tr><tr><td> الأقزام برايد وحوت (هركول edeni) </td><td> Q0KIY2 </td></tr><tr><td> الحوت الأحدب (novaeangliae Megaptera) </td><td> P02178 </td></tr><tr><td> الحوت الرمادي (Eschrichtius المتين) </td><td> P02177 </td></tr><tr><td> حوت العنبر (Physeter macrocephalus) </td><td> P02185 </td></tr><tr><td> حوت العنبر القزمي (breviceps Kogia) </td><td> Q0KIY5 </td></tr><tr><td> قزم حوت العنبر (Kogia سيما) </td><td> P02184 </td></tr><tr><td> قصيرة beakeد الدلفين الشائع (DELPHIS دلفين) </td><td> P68276 </td></tr><tr><td> منذ فترة طويلة الزعانف التجريبية الحوت (ميلاس Globicephala) </td><td> P02174 </td></tr><tr><td> الحوت القاتل (Orcinus أرك) </td><td> P02173 </td></tr><tr><td> التي ترأسها البطيخ الحوت (Peponocephala إليكترا) </td><td> Q0KIY3 </td></tr><tr><td> رصدت Pantropical شركة دولفين للطاقة (Stenella attenuata) </td><td> Q0KIY6 </td></tr><tr><td> الدلفين الأنف (Tursiops ترنكيتس) </td><td> P68279 </td></tr><tr><td> ميناء خنزير البحر (Phocoena phocoena) </td><td> P68278 </td></tr><tr><td> الأمازون دولفين نهر (أينيا geoffrensis) </td><td> P02181 </td></tr><tr><td> الحوت ذو المنقار لونجمان ل(pacificus Indopacetus) </td><td> Q0KIY9 </td></tr><tr><td> هوبز &quot;الحوت ذو المنقار (Mesoplodon carlhubbsi) </td><td> P02183 </td></tr><tr><td> حوت كوفييه ذو المنقار (زيphius cavirostris) </td><td> P02182 </td></tr><tr><td> ميناء ختم (PHOCA vitulina) </td><td> P68080 </td></tr><tr><td> الماشية (بوس الثور) </td><td> P02192 </td></tr><tr><td> الماعز (شعر الإبط كابرا) </td><td> B7U9B5.3 </td></tr><tr><td> الحصان (ايكوس الحصانية) </td><td> P68082 </td></tr><tr><td> خنزير (scrofa سوس) </td><td> P02189 </td></tr><tr><td> كلب (كلب familiaris الذئبة) </td><td> P63113 </td></tr><tr><td> الدجاج (جالوس جالوس) </td><td> P02197 </td></tr><tr><td> النعام (camelus Struthio) </td><td> P85077 </td></tr><tr><td> التونة صفراء الزعانف (Thunnus albacares) </td><td> P02205 </td></tr></tbody></table> الجدول 2. تسلسل الميوجلوبين المستخدمة في هذه الدراسة مع الأرقام انضمام بنك الجينات المعنية. وتشمل الأنواع التونة،الدجاج والنعام والثدييات المحلية، وختم و 18 نوعا من الثدييات البحرية (7 أسر). وقد تم استنساخ هذا الجدول من لو، C. وآخرون السريع المناعة الغروية قطاع الذهب لحوم الحوتيات تقييد التجارة والاستهلاك غير الشرعية: الآثار المترتبة على حفظ والصحة العامة بلوس وان 8، e60704 (2013). دوى: 10.1371 / journal.pone.0060704.

Watch this Scientific Journal Video about Development of a Colloidal Gold-based Immunochromatographic Test Strip for Detection of Cetacean Myoglobin at JoVE.com

Development of a Colloidal Gold-based Immunochromatographic Test Strip for Detection of Cetacean Myoglobin

This protocol describes the development of two IgG class monoclonal antibodies (mAbs) strongly reactive to myoglobin of cetaceans. These mAbs are applied on a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format to differentiate the Mb of cetaceans from seal and other animals.

تطوير المناعي اختبار قطاع تستند الذهب الغروية عن الكشف عن الحيتان الميوجلوبين

This protocol describes the development of a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format that can be used to ...

development-colloidal-gold-based-immunochromatographic-test-strip-for

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

14.1K Views.  National Chiayi University. This protocol describes the development of two IgG class monoclonal antibodies (mAbs) strongly reactive to myoglobin of cetaceans. These mAbs are applied on a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format to differentiate the Mb of cetaceans from seal and other animals. 

Video: Development of a Colloidal Gold-based Immunochromatographic Test Strip for Detection of Cetacean Myoglobin

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

والخلايا العصبية ونجمية المشارك الثقافة الفحص لتحليل محتوى عال من العصبية

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. They include ubiquitin-activating enzyme E1, ubiquitin-conjugating enzyme E2, and ubiquitin ligase E3. Unlike to E1 and E2, E3 ubiquitin ligases display substrate specificity. On the other hand, numerous deubiquitylating enzymes have roles in processing polyubiquitinated proteins. Ubiquitination can result in change of protein stability, cellular localization, and biological activity. Mutations of genes involved in the ubiquitination/deubiquitination pathway or altered ubiquitin system function are associated with many different human diseases such as various types of cancer, neurodegeneration, and metabolic disorders. The detection of altered or normal ubiquitination of target proteins may provide a better understanding on the pathogenesis of these diseases. &nbsp;Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro. These protocols are also useful to detect other ubiquitin-like small molecule modification such as sumolyation and neddylation.

Ubiquitination is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. Mutations of genes involved in this modification are associated with many different human diseases. Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro.

اكتشاف بروتين Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Preparation of Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron and Glia Development Studies

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) would provide a powerful platform for neuroscientists to investigate axo-glial interactions, properties and differentiation of multipotent progenitors, and progression of oligodendroglial lineage cells at the cellular and molecular level.  We describe here a CNS aggregate culture system from embryonic rat forebrains, which can be maintained in a serum-free medium up to 3-4 weeks and is used in our laboratory as a model to study neuron-glia interaction and CNS myelination.  This video clip will demonstrate how to isolate and grow these CNS aggregate cultures from E16 rat brain.  Furthermore, from the same brain dissection, highly enriched regular dissociated neuronal cultures can be readily obtained and used for various studies on CNS neurons or used for co-cultures with other cells. 

A protocols for an embryonic rat brain aggregate culture system is described. Multipotent progenitors in the aggregates can develop and differentiate into neurons, astrocytes and oligodendrocytes.

التحضير للثقافات الجرذ الحصى الدماغ العصبية للتنمية والدراسات الدبقية

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) ...

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. 

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK pathway in zebrafish embryos. The zebrafish embryo is an ideal system for in vivo high-content chemical screens. The 1-day old embryo is approximately 1mm in diameter and can be easily arrayed into 96-well plates, a standard format for high throughput screening. During the first day of development, embryos are transparent with most of the major organs present, thus enabling visualization of tissue formation during embryogenesis. The complete automation of zebrafish chemical screens is still a challenge, however, particularly in the development of automated image acquisition and analysis. We previously generated a transgenic reporter line that expresses green fluorescent protein (GFP) under the control of FGF activity and demonstrated their utility in chemical screens 1. To establish methodology for high throughput whole organism screens, we developed a system for automated imaging and analysis of zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in 96-well plates 2. In this video we highlight the procedures for arraying transgenic embryos into multiwell plates at 24hpf and the addition of a small molecule (BCI) that hyperactivates FGF signaling 3. The plates are incubated for 6 hours followed by the addition of tricaine to anesthetize larvae prior to automated imaging on a Molecular Devices ImageXpress Ultra laser scanning confocal HCS reader. Images are processed by Definiens Developer software using a Cognition Network Technology algorithm that we developed to detect and quantify expression of GFP in the heads of transgenic embryos. In this example we highlight the ability of the algorithm to measure dose-dependent effects of BCI on GFP reporter gene expression in treated embryos.

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

We report the development of a system for automated imaging and analysis of zebrafish transgenic embryos in multiwell plates. This demonstrates the ability to measure dose dependent effects of a small molecule, BCI, on Fibroblast Growth Factor reporter gene expression and provide technology for establishing high-throughput zebrafish chemical screens.

تطوير التصوير والتحليل الآلي للشاشات الكيميائية الزرد.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel electrophoresis to separate native or denatured proteins by the length of the polypeptide (denaturing conditions) or by the 3-D structure of the protein (native/ non-denaturing conditions). The proteins are then transferred to a membrane (typically nitrocellulose or PVDF), where they are probed (detected) using antibodies specific to the target protein.

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract.

الغربية التنشيف : إعداد نموذج لكشف

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

نظام ل<em&gt; خارج الجسم</em&gt; التثقيف البنكرياس الجنينية

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Tangential Flow Ultrafiltration: A  &ldquo;Green&rdquo; Method for the Size Selection and Concentration of Colloidal Silver Nanoparticles

Nowadays, AgNPs are extensively used in the manufacture of consumer products,1 water disinfectants,2 therapeutics,1, 3 and biomedical devices4 due to their powerful antimicrobial properties.3-6 These nanoparticle applications are strongly influenced by the AgNP size and aggregation state. Many challenges exist in the controlled fabrication7 and size-based isolation4,8 of unfunctionalized, homogenous AgNPs that are free from chemically aggressive capping/stabilizing agents or organic solvents.7-13 Limitations emerge from the toxicity of reagents, high costs or reduced efficiency of the AgNP synthesis or isolation methods (e.g., centrifugation, size-dependent solubility, size-exclusion chromatography, etc.).10,14-18 To overcome this, we recently showed that TFU permits greater control over the size, concentration and aggregation state of Creighton AgNPs (300 ml of 15.3 &mu;g ml-1 down to 10 ml of 198.7 &mu;g ml-1) than conventional methods of isolation such as ultracentrifugation.19
TFU is a recirculation method commonly used for the weight-based isolation of proteins, viruses and cells.20,21 Briefly, the liquid sample is passed through a series of hollow fiber membranes with pore size ranging from 1,000 kD to 10 kD. Smaller suspended or dissolved constituents in the sample will pass through the porous barrier together with the solvent (filtrate), while the larger constituents are retained (retentate). TFU may be considered a "green" method as it neither damages the sample nor requires additional solvent to eliminate toxic excess reagents and byproducts. Furthermore, TFU may be applied to a large variety of nanoparticles as both hydrophobic and hydrophilic filters are available.
The two main objectives of this study were: 1) to illustrate the experimental aspects of the TFU approach through an invited video experience and 2) to demonstrate the feasibility of the TFU method for larger volumes of colloidal nanoparticles and smaller volumes of retentate. First, unfuctionalized AgNPs (4 L, 15.2 &mu;g ml-1) were synthesized using the well-established Creighton method22,23 by the reduction of AgNO3 with NaBH4. AgNP polydispersity was then minimized via a 3-step TFU using a 50-nm filter (460 cm2) to remove AgNPs and AgNP-aggregates larger than 50 nm, followed by two 100-kD (200 cm2 and 20 cm2) filters to concentrate the AgNPs. Representative samples were characterized using transmission electron microscopy, UV-Vis absorption spectrophotometry, Raman spectroscopy, and inductively coupled plasma optical emission spectroscopy. The final retentate consisted of highly concentrated (4 ml, 8,539.9 &mu;g ml-1) yet lowly aggregated and homogeneous AgNPs of 1-20 nm in diameter. This corresponds to a silver concentration yield of about 62%.

Tangential flow ultrafiltration (TFU) is a recirculation method used for the weight-based separation of biosamples. TFU was adapted to size-select (1-20 nm diameter) and highly concentrate a large volume of polydisperse silver nanoparticles (4 L of 15.2 &mu;g ml-1 down to 4 ml of 8,539.9 &mu;g ml-1) with minimal aggregation.

عرضية الترشيح الفائق التدفق: A &quot;الخضراء&quot; طريقة لاختيار الحجم وتركيز الجسيمات النانوية الفضة الغروية

Nowadays, AgNPs are extensively used in the manufacture of consumer products,1 water disinfectants,2 therapeutics,1, 3 and biomedical devices4 due to ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of genetically-encoded fluorescent proteins has proven a valuable strategy for elucidating dynamic morphogenetic processes as they occur in the intact organism. During the past decade, the development of photoactivatable and photoconvertible fluorescent proteins has opened the possibility to investigate the fate of discrete subpopulations of tagged proteins1. Unlike photoactivatable proteins, photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) are readily tracked and imaged in their native emission state prior to photoconversion, making it easier to identify and select regions by optical inspection. PCFPs, such as Kaede2, KikGR3, Dendra4 and EosFP5, can be shifted from green to red upon exposure to UV or blue light due to a His-Tyr-Gly tripeptide sequence which forms a green chromophore that can be photoconverted to a red one by a light-catalyzed &beta;-elimination and subsequent extension of a &pi;-conjugated system3. PCFPs and their monomeric variants are useful tools for tracking cells6-10 and studying protein dynamics11-14, respectively. During recent years, PCFPs have been expressed in different animal model, such as zebrafish6, chicken7,8 and mouse9,10 for cell fate tracking. Here we report a protocol for cell-specific photoconversion of PCFPs in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted proteins at later developmental stages. This methodology allows studying, in a tissue-specific manner, cell biological events underlying morphogenesis in the zebrafish animal model.

Here, we present a method for the photoactivated switch of photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted protein at specific time points during development. This methodology allows monitoring of cell biological events underlying different developmental processes in a live vertebrate organism.

تتبع الخلية عن طريق البروتينات Photoconvertible خلال التنمية اسماك الزرد

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal which tissues descend from each cell of the embryo. Although fate maps are very useful for identifying the precursors of an organ and for elucidating the developmental path by which the descendant cells populate that organ in the normal embryo, they do not illustrate the full developmental potential of a precursor cell or identify the mechanisms by which its fate is determined. To test for cell fate commitment, one compares a cell's normal repertoire of descendants in the intact embryo (the fate map) with those expressed after an experimental manipulation. Is the cell's fate fixed (committed) regardless of the surrounding cellular environment, or is it influenced by external factors provided by its neighbors? Using the comprehensive fate maps of the Xenopus embryo, we describe how to identify, isolate and culture single cleavage stage precursors, called blastomeres. This approach allows one to assess whether these early cells are committed to the fate they acquire in their normal environment in the intact embryo, require interactions with their neighboring cells, or can be influenced to express alternate fates if exposed to other types of signals.

The fate of an individual embryonic cell can be influenced by inherited molecules and/or by signals from neighboring cells. Utilizing fate maps of the cleavage stage Xenopus embryo, single blastomeres can be identified for culture in isolation to assess the contributions of inherited molecules versus cell-cell interactions.

إإكسبلنتس قسيم أرومي لاختبار الالتزام مصير الخلايا أثناء التطور الجنيني

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

الكشف عن لايف<em&gt; كولاي</em&gt; O157: H7 من قبل خلايا PMA-QPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...