The authors were supported by: a CancerFree KIDS Research Grant, a March of Dimes Basil O&#8217;Connor Starter Scholar Award (#5-FY14-32), a Cincinnati Children&#8217;s Hospital Medical Center (CCHMC) Trustee Grant Award; a CCHMC Research Innovation and Pilot Funding Award; and CCHMC developmental funds. Authors also acknowledge the Capel laboratory for the initial optimization of this technique.

<ol>
	<li>Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+embryonic+development+in+a+serum-free+whole+embryo+culture+system.">Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system.</a> J. Vis. Exp. (85), e50803 (2014).</li><li>Maatouk, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+beta-catenin+in+XY+gonads+causes+male-to-female+sex-reversal.">Stabilization of beta-catenin in XY gonads causes male-to-female sex-reversal.</a> Hum. Mol. Genet. 17, 2949-2955 (2008).</li><li>DeFalco, T., Bhattacharya, I., Williams, A. V., Sams, D. M., Capel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yolk-sac-derived+macrophages+regulate+fetal+testis+vascularization+and+morphogenesis.">Yolk-sac-derived macrophages regulate fetal testis vascularization and morphogenesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, E2384-E2393 (2014).</li><li>Coveney, D., Cool, J., Oliver, T., Capel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-dimensional+analysis+of+vascularization+during+primary+development+of+an+organ,+the+gonad.">Four-dimensional analysis of vascularization during primary development of an organ, the gonad.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 7212-7217 (2008).</li><li>Walton, K. D., Kolterud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+fetal+whole+intestine+culture+system+for+ex+vivo+manipulation+of+signaling+pathways+and+three-dimensional+live+imaging+of+villus+development.">Mouse fetal whole intestine culture system for ex vivo manipulation of signaling pathways and three-dimensional live imaging of villus development.</a> J. Vis. Exp. (91), e51817 (2014).</li><li>Delmarcelle, A. S., Villacorte, M., Hick, A. C., Pierreux, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ex+vivo+culture+system+to+study+thyroid+development.">An ex vivo culture system to study thyroid development.</a> J. Vis. Exp. (88), e51641 (2014).</li><li>Costantini, F., Watanabe, T., Lu, B., Chi, X., Srinivas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+embryonic+mouse+kidney,+culture+in+vitro,+and+imaging+of+the+developing+organ.">Dissection of embryonic mouse kidney, culture in vitro, and imaging of the developing organ.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2011, (2011).</li><li>Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+for+ex+vivo+culturing+of+embryonic+pancreas.">A system for ex vivo culturing of embryonic pancreas.</a> J. Vis. Exp. (66), e3979 (2012).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids.">A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> J. Vis. Exp. (51), e2720 (2011).</li><li>Combes, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.Endothelial+cell+migration+directs+testis+cord+formation.">et al.Endothelial cell migration directs testis cord formation.</a> Dev. Biol. 326, 112-120 (2009).</li><li>Bott, R. C., McFee, R. M., Clopton, D. T., Toombs, C., Cupp, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+and+kinase+domain+region+receptor+are+involved+in+both+seminiferous+cord+formation+and+vascular+development+during+testis+morphogenesis+in+the+rat.">Vascular endothelial growth factor and kinase domain region receptor are involved in both seminiferous cord formation and vascular development during testis morphogenesis in the rat.</a> Biol. Reprod. 75, 56-67 (2006).</li><li>Cool, J., DeFalco, T. J., Capel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular-mesenchymal+cross-talk+through+Vegf+and+Pdgf+drives+organ+patterning.">Vascular-mesenchymal cross-talk through Vegf and Pdgf drives organ patterning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 167-172 (2011).</li><li>Clapcote, S. J., Roder, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplex+PCR+assay+for+sex+determination+in+mice.">Simplex PCR assay for sex determination in mice.</a> BioTechniques. 38, 702, 704-706 (2005).</li><li>Nel-Themaat, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.Morphometric+Analysis+of+Testis+Cord+Formation+in.">et al.Morphometric Analysis of Testis Cord Formation in.</a> Dev. Dyn. 238, 1100-1110 (2009).</li><li>Kent, J., Wheatley, S. C., Andrews, J. E., Sinclair, A. H., Koopman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+male-specific+role+for+SOX9+in+vertebrate+sex+determination.">A male-specific role for SOX9 in vertebrate sex determination.</a> Development. 122, 2813-2822 (1996).</li><li>Morais da Silva, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.Sox9+expression+during+gonadal+development+implies+a+conserved+role+for+the+gene+in+testis+differentiation+in+mammals+and+birds.">et al.Sox9 expression during gonadal development implies a conserved role for the gene in testis differentiation in mammals and birds.</a> 14, 62-68 (1996).</li><li>Rockich, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox9+plays+multiple+roles+in+the+lung+epithelium+during+branching+morphogenesis.">Sox9 plays multiple roles in the lung epithelium during branching morphogenesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, E4456-E4464 (2013).</li><li>Si-Tayeb, K., Lemaigre, F. P., Duncan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+and+development+of+the+liver.">Organogenesis and development of the liver.</a> Dev. Cell. 18, 175-189 (2010).</li><li>Brennan, J., Capel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+tissue,+two+fates:+Molecular+genetic+events+that+underlie+testis+versus+ovary+development.">One tissue, two fates: Molecular genetic events that underlie testis versus ovary development.</a> Nat. Rev. Genet. 5, 509-521 (2004).</li><li>Martineau, J., Nordqvist, K., Tilmann, C., Lovell-Badge, R., Capel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male-specific+cell+migration+into+the+developing+gonad.">Male-specific cell migration into the developing gonad.</a> Curr. Biol. 7, 958-968 (1997).</li><li>Yokonishi, T., Sato, T., Katagiri, K., Ogawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+spermatogenesis+using+an+organ+culture+technique.">In vitro spermatogenesis using an organ culture technique.</a> Methods Mol. Biol. 927, 479-488 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+production+of+functional+sperm+in+cultured+neonatal+mouse+testes.">In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes.</a> Nature. 471, 504-507 (2011).</li><li>Gohbara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+murine+spermatogenesis+in+an+organ+culture+system.">In vitro murine spermatogenesis in an organ culture system.</a> Biol. Reprod. 83, 261-267 (2010).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

توضح هذه الدراسة المجراة سابقا كله الجهاز طريقة قطرة يحتوي على العديد من التطبيقات المحتملة لدراسة التطور الجنيني. هذه التقنية يمكن استخدامها لأجهزة متعددة، ويسمح الباحث لمعالجة المسائل الحيوية التي يصعب دراسة استخدام في الجسم الحي النهج بسبب عدم إمكانية الوصول إلى الأجنة والفتك الجنينية المحتملة. هذه الطريقة ثقافة له فوائد إضافية على الآخر في المختبر النهج مثل خطوط الخلايا الثديية: الأجهزة كلها يمكن استخدامها، وبالتالي الحفاظ على التفاعلات بين الخلايا الحرجة التي تكون موجودة في الرحم. وحجم الثقافة صغير جدا (~ 30 ميكرولتر)، وبالتالي استخدام كميات صغيرة جدا من المواد الكيميائية الدوائية النادرة أو باهظة الثمن. الجوانب الحاسمة للبروتوكول ثقافة الحبرية ما يلي: أ) تشريح نظيفة من الجهاز. تشريح نظيفة يسمح بنية الأنسجة إلى الإبقاء على ويقلل من عدد من قطع يتعرض أو سور التالفةوجوه، والتي قد تنجذب إلى سطح الطبق الثقافة وقد تعكر صفو الثقافة؛ ب) التوجه السليم للجهاز داخل الحبرية، من أجل السماح للنمو الجهاز والتشكل. ج) اتخاذ الحبرية الحجم المناسب، بحيث تحتفظ الحبرية الجهاز في مكان من التوتر السطحي ولكن أيضا لا تجف. د) باستخدام حجم القطيرات الصحيح للجهاز. ينبغي تحديد حجم القطيرات تجريبيا وفقا لحجم الجهاز. ومع ذلك، يجب أن يكون 30 ميكرولتر نقطة انطلاق معقولة. ه) اختيار مرحلة ذات الصلة من التنمية لمعالجة هذه المسألة البيولوجية المصالح؛ و) الحفاظ على البيئة ثقافة عقيمة، لتجنب التلوث التي يمكن أن تتلف الأنسجة داخل الحبرية. ويركز هذا البحث أساسا على الغدد التناسلية E11.5-E13.5 (أي خلال التمايز الجنسي الأولي)، ولكنه يظهر أيضا أن هذا البروتوكول يمكن تطبيقها على الأجهزة الأخرى. التعديلات المحتملة لهذا البروتوكول عن الأجهزة الأخرى وتشمل: أ) تغيير حجم القطيرات لعضو معين و / أو مرحلة من مراحل التنمية. هذه الطريقة الثقافة ينطبق على جميع مراحل الجنين لالغدد التناسلية، ولكن ينبغي تعديل حجم لمراحل الجنين في وقت لاحق من الأجهزة الأكبر حجما. ومن المرجح هناك حد لمراحل الجنين التي يمكن استخدامها لأجهزة أكبر، بالنظر إلى أن الانتشار البسيط لن تسمح المغذيات أو الكواشف لاختراق الأنسجة كبيرة جدا بشكل فعال في مراحل لاحقة. ولذلك فمن المستحسن استخدام هذه الثقافة لأجهزة الجنين في أقرب وقت ممكن للتجربة. ب) مضيفا عوامل خارجية النمو والهرمونات، أو عوامل أخرى إلى وسائل الإعلام الثقافة. قد تتطلب بعض الأجهزة بروتين معين أو هرمون الخضوع التشكل الطبيعي. لذلك، هذا البروتوكول يمكن تعديلها بإضافة هذه الكواشف إلى وسائل الإعلام الثقافة. ج) تعديل طول الوقت في الثقافة. في حين يمكن أن يحدث تطور الخصية الأولية في اقل من 24 ساعة، قد تتطلب أجهزة أخرى فترات أطول من الزمن في الثقافة. إذا كانت قطراتيتم الاحتفاظ عقيمة، قد تكون أنسجة قابلة للما يصل إلى 4 أو حتى 5 أيام في الثقافة. لفترات أطول من ثقافة (أكثر من 48 ساعة)، لإزالة الأمونيا أو غيرها من النفايات المبنية تركات قد يكون من الضروري لتحديث وسائل الإعلام يوميا (مع الكواشف المرتبطة بها) في قطرات عن طريق إزالة حجم مجموعة من الحبرية والاستعاضة عن ذلك نفس الحجم مع وسائل الإعلام العذبة؛ لقطرات المعالجة، ويجب أن تحتوي وسائل الإعلام الجديدة على نفس التركيز من المخدرات / الكاشف كما في العلاج الأولي. د) تغيير التركيب من وسائل الإعلام و / أو الكواشف المرتبطة بها. قد تتطلب بعض الأنسجة أكثر أو أقل من كاشف الأدوية تعطى للحصول على التأثير المطلوب. فمن المستحسن لمحاولة التخفيف المتسلسل للتركيز وتقييم موت الخلايا (عبر المشقوق كاسباس 3 تلطيخ) للعثور على تركيز الأمثل التي من شأنها عرقلة / تفعيل المسار المطلوب ولكن ليس لحث على موت الخلايا كبيرا في أجهزة المستزرعة. ه) استخدام الضوابط الداخلية. منذ أجهزة مثل الغدد التناسلية تأتي في أزواج، ويمكن الغدد التناسلية واحد يخدمباعتبارها الرقابة الداخلية مثالية للتعامل الغدد التناسلية المقابل. الأجهزة الأخرى مثل الكبد لا تأتي في أزواج. إذا كانت سلالة الماوس المستخدم هو نادر وعينات محدودة، فمن الممكن لتشريح الجهاز في النصف واستخدام كل شوط لمراقبة وعينات المعالجة. يجب على المرء أن نضع في اعتبارنا أن الأجهزة، حتى تلك التي تأتي في أزواج، قد تظهر التباين (مثل عدد مختلف من فصوص لكل جانب من الرئة)، لذلك يجب على المرء أن يحيط علما أي جانب من الجهاز يتم استخدامه للسيطرة و عينات العلاج. بينما الثقافات قطرة يحتمل أن إعادة إنشاء تقريبا جميع جوانب التنمية في الرحم، وهناك بعض القيود على هذه التقنية. واحد هو أن الثقافات قطرة، وبحكم تقنيات زراعة الجسم الحي بشكل عام، يؤدي إلى تباطؤ معدلات النمو باستمرار قريبة في التنمية الرحم 1،5. هذا هو الأرجح بسبب عدد من العوامل، مثل تركيزات أقل من عوامل النمو المطلوب في وسائل الإعلام ثقافة (وعلىالوصول إلى الأنسجة) واتساع الأوعية الدموية المحدود الذي يحدث خارج الحي. بالإضافة إلى حجم الجهاز، هناك قلق، وإذا لم يتم توجيه يزدرع بشكل صحيح أو الحبرية هو حجم غير صحيح، قد تصبح التشكل الأنسجة بالارض أو مشوهة مع عدم وجود هيكل الدعم التي توفرها سرير أجار في البروتوكولات الأخرى. ومع ذلك، يمكن تجنب هذه المشكلة مع تعظيم الاستفادة من المعلمات البروتوكول. العوامل التي تحد محتمل آخر هو مدى وسائل الإعلام والكواشف يمكن منتشر في جميع أنحاء الجهاز بأكمله؛ في حين أن هذه الأنسجة مثقف لها الأوعية الدموية، ليس هناك نضح من المواد المغذية والأكسجين من خلال هذه السفن خارج الجسم الحي بسبب نقص تدفق الدم، وذلك بدلا يصبح نشر عاملا. هذا القيد هو واضح خصوصا في الثقافات الخصية بعد الولادة، والتي فيفو السابقين الحيوانات المنوية غير مستدامة جيدا في محيط النباتى ولكن الجزء الوسط معظم الأنسجة (أي أبعد من وسائل الإعلام) degeneraقسم التدريب والامتحانات 21-23. ونظرا لهذه الملاحظات، يبدو أن حجم عاملا مقيدا العام للثقافة الجهاز كله أو بروتوكولات يزدرع كبيرة الحجم. ومع ذلك، برامج تخلقية العامة، مثل المتفرعة التشكل في رئة الجنين وتكوين الحبل الخصية نوفو دي في الغدد التناسلية الجنين، لا تزال تحدث في الثقافات الحبرية. لذلك، لا تزال هذه العمليات الأساسية دراستها باستخدام هذه التقنية. وقد وصفت هذا البروتوكول الجهاز كله أول من معتوق وآخرون. 2، الذي تكييفها من مقرها أجار طريقة الثقافة السابق بنسبة Coveney وآخرون. 4 الاستفادة من زراعة الأعضاء خارج الحي عبر قطرات بدلا من الآبار أجار هو أنه يستخدم في وبلغ حجم التداول الأقل 10 أضعاف الحد من ثقافة، وبالتالي الحفاظ على الكواشف. بالإضافة إلى ذلك، فإن الطريقة قطرات لا ينطوي قبل تفرخ-الآبار أجار في التي تحتوي على كاشف وسائل الإعلام، مما يوفر الوقت ويتجاوز أية مخاوف حول كفاءة الكواشف كونها ديlivered إلى الأنسجة عن طريق أجار. في حين يعتقد عموما الأساليب القائمة على أجار للحفاظ على أكثر بأمانة الهندسة المعمارية ثلاثية الأبعاد من الأنسجة، والتوجه السليم للالنباتى وتعظيم الاستفادة من الظروف والثقافة (انظر أعلاه) ضمان التشكل الطبيعي للأجهزة قطرة مثقف. هذه النتائج تثبت أن فيفو السابقين قطرة مثقف الغدد التناسلية الجنينية نمو المعرض والتشكل مماثلة لتلك التي من الأجهزة المتقدمة في utero-. لا يقتصر هذا الأسلوب الثقافة إلى الغدد التناسلية، ولكن أيضا يمكن تطبيقها على أجهزة الجنين أخرى مثل الرئة. وهذا خارج الحي الجهاز طريقة قطرة تكون مفيدة لدراسات كلها إشارات الجهاز والجهاز محددة التفاعلات الخلوية، مدعوما جزئيا القدرة على صورة أجهزة كاملة بعد ثقافة والعلاج من تعاطي المخدرات. الدراسة الموصوفة هنا يستخدم مثبط جزيء صغير للتحقيق في تأثير الأوعية الدموية على التشكل، ولكن عدد كبير من افا تجارياالكواشف الدوائية ilable متاحة لدراسة العديد من مسارات إشارات والعمليات البيولوجية. ولذلك، هناك العديد من الاستخدامات المحتملة في المستقبل لهذا الأسلوب الثقافة الحبرية التي من شأنها أن تسمح للباحثين للتحقيق الأسئلة المثيرة للاهتمام وهامة في البيولوجيا التطورية.

تجديد جهاز في الجسم الحي في البشر محدود للغاية؛ لذلك، هندسة الأنسجة، وتطوير الأنسجة والأعضاء من الخلايا الفردية التي تبرعت بها مجموعة، أصبح علاجا جذابا المحتملين لاستبدال الجهاز. ومع ذلك، لهذه الاستراتيجية العلاجية لتكون ناجحة، والعوامل والتفاعلات الخلوية العاملة في التشكل من الجهاز يجب دراستها بدقة وفهمها جيدا. نظرا لعدم القدرة على دراسة تطوير أجهزة معينة مع الأساليب التقليدية، تحولت الباحثون إلى الجنين كله بديل أو الثقافات الجهاز كله. Kalaskar وآخرون. 1 أظهرت أن ثقافة مرحلة التطور الجنيني كلها خارج الحي تعطي نتائج مماثلة (في 58٪ من الأجنة مثقف) لفي التنمية الرحم، مما يشير إلى أن وسائل الثقافة فيفو السابقين هي بديل ممكن للدراسات توالد. نظام الجهاز ثقافة فردية، مثل هذا خارج الحي دروPLET نظام الثقافة، ويسمح لتحليل الجهاز كله مستقلة عن التأثيرات الجهازية، مع السماح التلاعب في مسار الإشارات معين أو التفاعلات الخلوية عن طريق إضافة الكواشف الدوائية أو الأجسام المضادة. تقليديا، ودراسة تطوير الجهاز الجنين قد اقتصر على التقنيات المعدلة وراثيا والماوس خروج المغلوب، بالإضافة إلى الكواشف الدوائية تسليمها للأمهات. ومع ذلك، هناك مسائل فنية تشمل هذه التقنيات والعلاجات في الجسم الحي. معظم المخاوف تدور حول آثار التأثير على مختلف الأجهزة في وقت واحد والذي غالبا ما يؤدي إلى الفتك الجنينية. مصدر قلق إضافي من الدراسات التلاعب نمو الجنين هو دواء تأثير الأمهات من المخدرات على التطور الجنيني داخل الرحم (على سبيل المثال، والتمثيل الغذائي الأمهات من الدواء قبل أن تصل إلى الجنين) وإذا كانت هذه الكواشف يمكن أن تمر من خلال حاجز المشيمة. تقنية ثقافة الجهاز كلها وصفتهنا تم تكييفها من بروتوكول وصف لأول مرة من قبل معتوق وآخرون. 2، والتي يتم تحضين الغدد التناسلية الجنينية كلها في خارج الحي الثقافات قطرة تستقيم. واحدة ميزة كبيرة لزراعة الغدد التناسلية الجنينية هي أن مثبطات جزيء صغير يمكن الوصول بسهولة الجهاز كله عن طريق الانتشار البسيط. وقد أظهرت DeFalco آخرون أن استخدام هذا فيفو السابقين قطرة طريقة الثقافة بالتزامن مع مثبطات جزيء صغير يمكن أن تستخدم لدراسة العمليات والتفاعلات التي تحدث أثناء نمو الغدد التناسلية 3 إشارات؛ أن هذه العمليات سيكون من الصعب دراسة في الجسم الحي بسبب التحديات التقنية (على سبيل المثال، مرور المخدرات عبر المشيمة أو الفتك يصيب أعضاء متعددة باستخدام النهج وراثية أو الدوائية). ثقافة الحبرية ليست فقط تحسنا في بعض الجوانب أكثر في الرحم التجريب، ولكن أيضا أن ذلك يعد تحسنا خلال في المختبر، وبحكم السادسنظم فو كذلك. استخدام خطوط الخلايا لدراسة التشكل من الصعب للغاية لأنها تفتقر إلى أنواع الخلايا المتنوعة، تفتقر إلى المصفوفة خارج الخلية (ECM) العناصر الأساسية التي تسمح تشكيل بنية الجهاز، ويمكن أن تظهر التحف في الإشارة شلالات. على الرغم من أن هندسة الأنسجة وإجراء تحسينات كبيرة في خلق السقالات محاكاة ECM، والافتقار إلى المعرفة فيما يتعلق وهي مطلوبة إشارات من قبل كل نوع من الخلايا خلال توالد يجعل صعوبة في بناء نظام جهاز في المختبر. وقد أنظمة أخرى خارج الحي أنشئت سابقا لدراسة توالد، أو بشكل أكثر تحديدا التشكل، وكانت ناجحة جدا للتصوير المباشر لأجهزة الجنين في أجار 4، transwells 5، 6 مرشحات، ومصفوفات سقالة أخرى 7،8. الاستفادة من نظام الثقافة الحبرية هو أنه يتيح دراسة التشكل من خلال توفير القدرة على الاستفادة من أقل الكواشف، والتي هي سften تكلفة، ولكن أيضا إعطاء التوتر السطحي الجهاز، وهو أمر مهم للنمو ويشير قدرات 9. في الماوس، التشكل الخصية الأولي يحدث بين الجنينية (E) مراحل E11.5 وE13.5. وتشمل هذه المراحل نافذة الوقت الأمثل لدراسة العوامل التي تؤثر على التفرقة بين جنس معين. ومن بين العمليات الحيوية التي تحدث أثناء تشكيل الخصية هي الجيل العمارة الحبل الخصية وتشكيل شبكة الأوعية الدموية الخصية محددة. استخدام هذا الجهاز خارج الحي كله نظام الثقافة الحبرية، واحد قادر على تغيير الأوعية الدموية الخاص بالذكور وتمنع الخصية التشكل من خلال استخدام مثبط جزيء صغير الذي يمنع نشاط مستقبلات عامل النمو البطاني الوعائي (VEGF)؛ بوساطة VEGF إعادة الأوعية الدموية هو أمر حاسم لتنمية الخصية 10-12. يمكن أن تطبق بنجاح هذه التقنية إلى الأجهزة الأخرى، ويمكن أن تستهدف وقت محددنوافذ التنمية. جبل لالجامع التصوير جهاز يسمح التصور من الهياكل الحيوية فضلا عن التغييرات الهيكلية والخلوية الناتجة عن إدارة مثبطات المختلفة. الأهم من ذلك، هذا النظام هو مفيد في هذا الباحث يمكن تجاوز آثار الخلط المحتملة من الدواء الأمهات أو التعطيل المنهجي في الجسم الحي خلال استراتيجيات الجينات المستهدفة. وهكذا، هذا الجهاز كله خارج الحي النظام الثقافة قطرات يمكن أن تحسن بشكل كبير من القدرة على فهم التفاعلات والإشارات التي تحدث بشكل خاص ضمن أجهزة خاصة أثناء التطور الجنيني.

<table><tbody><tr><td>Superfrost Plus Microscope Slides</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Cover Glasses: Squares (22 mm x 22 mm, No. 1.5)</td><td>Fisherbrand</td><td>12-541B</td><td></td></tr><tr><td>Sally Hansen Xtreme Wear Nail Polish, Invisible</td><td>Sally Hansen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8-Strip 0.2 ml PCR Tubes &amp;amp; Detached Flat Caps</td><td>GeneMate</td><td>T3218-1</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman L P1,000L, P200L, P20L, P10L, P2L</td><td>Gilson</td><td>FA10006M, FA10005M, FA10003M, FA10002M, FA10001M</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>FST</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Fine Scissors</td><td>FST</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Posi-Click 1.7 ml microcentrifuge tubes</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>Posi-Click 0.6 ml microcentrifuge tubes</td><td>Denville</td><td>C2176</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;mu;l SHARP Precision Barrier Tips</td><td>Denville</td><td>P1096FR</td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;mu;l SHARP Precision Barrier Tips</td><td>Denville</td><td>P1121</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;mu;l SHARP Precision Barrier Tips</td><td>Denville</td><td>P1122</td><td></td></tr><tr><td>1,000 &amp;mu;l SHARP Precision Barrier Tips</td><td>Denville</td><td>P1126</td><td></td></tr><tr><td>1 ml syringe with 27 gauge needles</td><td>BD PrecisionGlide</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>10 ml syringe</td><td>BD</td><td>305559</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;mu;M PES syringe filter</td><td>VWR</td><td>28145-501</td><td></td></tr><tr><td>Grade 3 Qualitative Filter Paper Standard Grade, circle, 185 mm</td><td>Whatman</td><td>1003-185</td><td></td></tr><tr><td>Primaria 35 mm Easy Grip Style Cell Culture Dish</td><td>Falcon/Corning</td><td>353801</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dishes, Sterile (100 mm x 15 mm)</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick Galaxy 14 S CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Incubator</td><td>Eppendorf</td><td>CO14S-120-0000</td><td></td></tr><tr><td>Biosafety Cabinet</td><td>Nuare</td><td>NU-425-400</td><td></td></tr><tr><td>Mini-centrifuge&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-090-100</td><td></td></tr><tr><td>BioExpress GyroMixer Variable XL</td><td>GeneMate</td><td>R-3200-1XL</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler Pro Thermal Cycler with control panel</td><td>Eppendorf</td><td>950040015</td><td></td></tr><tr><td>SMZ445 stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ445</td><td></td></tr><tr><td>MultiImage Light Cabinet with AlphaEase Software</td><td>Alpha Innotech Corporation</td><td>Discontinued</td><td></td></tr><tr><td>Absolute 200 proof Ethanol</td><td>Fisher</td><td>BP2818-500</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate (Dibasic MW 142) Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>S374-1</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate (Monobasic MW 136) KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride (NaCl)</td><td>Fisher</td><td>S671-3</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma</td><td>M2393-100g</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride (CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma</td><td>C5670-100g</td><td></td></tr><tr><td>Ambion Nuclease-Free Water</td><td>Life Technologies</td><td>AM9938&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>XY PCR Primer&amp;nbsp;</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Glacial Acetic Acid</td><td>Fisher</td><td>A38-500</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA)</td><td>Fisher</td><td>BP2482-1</td><td></td></tr><tr><td>1% Ethidium bromide solution</td><td>Fisher</td><td>BP1302-10</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>GeneMate</td><td>E-3120-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>367176-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Set, 100 mM Solutions</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0182</td><td></td></tr><tr><td>DNA Choice Taq polymerase with 10x Buffer</td><td>Denville</td><td>CB-4050-3</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Fisher</td><td>O4042-500</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>FluorMount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen Chloride (HCl)</td><td>Fisher</td><td>A144212</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA), powder, Fraction V, Heat shock isolation</td><td>Bioexpress</td><td>0332-100g</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (DMEM)&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS), triple 100 nm filtered</td><td>Fisher</td><td>03-600-511</td><td>Heat-inactivate before using</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Use at 1:100</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO), Hybri-max, sterile-filtered</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>VEGFR Tyrosine Kinase Inhibitor II - CAS 269390-69-4 - Calbiochem</td><td>EMD Millipore</td><td>676481</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit Anti-Sox9 Antibody</td><td>Millipore</td><td>AB5535</td><td>Use at dilution: 1:4,000</td></tr><tr><td>Rat Anti-Mouse PECAM1 (CD31) Antibody</td><td>BD Pharmingen</td><td>553370</td><td>Use at dilution: 1:250</td></tr><tr><td>Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>9661S</td><td>Use at dilution: 1:250</td></tr><tr><td>Rat E-cadherin / CDH1 Antibody (ECCD-2)</td><td>Life Technologies</td><td>13-1900</td><td>Use at dilution: 1:500</td></tr><tr><td>Hoechst 3342, trihydrochloride, trihydrate</td><td>Invitrogen (Molecular Probes)</td><td>H1399</td><td>Use at 2 ug/ml</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>712-165-153</td><td>Use at dilution: 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>712-605-153</td><td>Use at dilution: 1:500</td></tr><tr><td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate</td><td>Life Technologies</td><td>A31572</td><td>Use at dilution: 1:500</td></tr><tr><td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>Life Technologies</td><td>A21206</td><td>Use at dilution: 1:500</td></tr><tr><td>Donkey anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>Life Technologies</td><td>A21208</td><td>Use at dilution: 1:500</td></tr><tr><td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate</td><td>Life Technologies</td><td>A31573</td><td>Use at dilution: 1:500</td></tr></tbody></table>

using ex vivo upright droplet cultures of whole fetal organs to study developmental processes during mouse organogenesis

التحقيق توالد في الرحم هي عملية صعبة من الناحية التقنية في الثدييات المشيمية نظرا لعدم إمكانية الوصول إلى الكواشف إلى الأجنة التي تتطور داخل الرحم. يوفر خارج الحي تستقيم طريقة الثقافة قطرة وضعت حديثا بديلا جذابا لالدراسات التي أجريت في الرحم. تقدم الثقافة فيفو السابقين قطرة القدرة على دراسة ومعالجة التفاعلات الخلوية ومسارات الإشارات المختلفة من خلال استخدام مختلف الحجب ومركبات تفعيل. بالإضافة إلى ذلك، فإن آثار مختلف الكواشف الدوائية على تطوير أجهزة معينة يمكن دراستها من دون آثار جانبية غير مرغوب فيها من إيصال الدواء النظامية في الرحم. بالمقارنة مع غيرها من نظم المختبر، وثقافة قطرة يسمح ليس فقط من أجل القدرة على دراسة ثلاثي الأبعاد التشكل وخلية خلية التفاعلات، التي لا يمكن استنساخها في خطوط خلايا الثدييات، ولكن يتطلب أيضا أقل بكثير صeagents من الآخر خارج الحي والبروتوكولات المختبر. توضح هذه الورقة السليم الماوس الجنين تشريح الجهاز وتقنيات زراعة قطرة تستقيم، تليها كله المناعي الجهاز لإثبات فعالية هذه الطريقة. فيفو السابقين قطرة طريقة ثقافة يسمح بتشكيل بنية الجهاز قابلة للمقارنة إلى ما لوحظ في الجسم الحي، ويمكن استخدامها لدراسة عمليات خلاف ذلك يصعب الدراسة بسبب الفتك الجنينية في النماذج في الجسم الحي. كنظام تطبيق النموذج، سيتم استخدام مثبط جزيء صغير للتحقيق في دور الأوعية الدموية في التشكل الخصية. هذا خارج الحي قطرة طريقة ثقافة غير قابلة للتوسيع إلى أجهزة الجسم الجنين أخرى، مثل الرئة وربما غيرها، على الرغم من أن كل جهاز يجب أن يكون على نطاق واسع درس لتحديد أي تعديلات الجهاز محددة لبروتوكول. ويوفر هذا النظام الثقافة الجهاز المرونة في التجريب مع أجهزة الجنين، والنتائج obtaineد باستخدام هذه التقنية ستساعد الباحثين اكتساب نظرة ثاقبة نمو الجنين.

Watch this Scientific Journal Video about Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis at JoVE.com

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

The&#160;ex vivo&#160;upright droplet culture is an alternative to current&#160;in vitro&#160;and&#160;in vivo&#160;experimental techniques. This protocol is easy to perform and requires smaller amounts of reagent, while permitting the ability to manipulate and study fetal vascularization, morphogenesis, and organogenesis.

باستخدام<em&gt; السابقين فيفو</em&gt; الثقافات تستقيم القطرة من الجامعة الجنين هيئات لدراسة العمليات التنموية خلال الماوس توالد

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

using-ex-vivo-upright-droplet-cultures-whole-fetal-organs-to-study

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

12.4K Views.  Cincinnati Children's Hospital Medical Center. The ex vivo upright droplet culture is an alternative to current in vitro and in vivo experimental techniques. This protocol is easy to perform and requires smaller amounts of reagent, while permitting the ability to manipulate and study fetal vascularization, morphogenesis, and organogenesis.

Video: Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an integral part of the male reproductive tract, is responsible for sperm storage, maturation, and transport. The adult epididymis is a highly coiled tube that develops from a simple and straight embryonic precursor known as Wolffian duct (WD). Proper coiling of the epididymis is essential for male fertility, as sperm in the testis are unable to fertilize an oocyte. However, the mechanism responsible for epididymal development and coiling remains unclear, partially due to the lack of whole organ culture and imaging methods. In this study, we describe an in vitro culture system and whole mount immunofluorescence protocol to better visualize the process of WD coiling and development, which may also be applied to study other tubular organs.

We present a method for isolation and culture of the mouse Wolffian duct (WD). We also demonstrate a detailed procedure for whole mount immunostaining of cultured/freshly isolated WDs with fluorescently tagged antibodies. Together, these techniques enable the study of WD development, coiling, and differentiation.

هيئة الثقافة والجامع جبل المناعي تلون ماوس وولف القنوات

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Three-Dimensional Imaging of Organoids to Study Primary Ciliogenesis During ex vivo Organogenesis

Organoids are stem cell-derived three-dimensional structures that reproduce ex vivo the complex architecture and physiology of organs. Thus, organoids represent useful models to study the mechanisms that control stem cell self-renewal and differentiation in mammals, including primary ciliogenesis and ciliary signaling. Primary ciliogenesis is the dynamic process of assembling the primary cilium, a key cell signaling center that controls stem cell self-renewal and/or differentiation in various tissues. Here we present a comprehensive protocol for the immunofluorescence staining of cell lineage and primary cilia markers, in whole-mount mouse mammary organoids, for light sheet microscopy. We describe the microscopy imaging method and an image processing technique for the quantitative analysis of primary cilium assembly and length in organoids. This protocol enables a precise analysis of primary cilia in complex three-dimensional structures at the single cell level. This method is applicable for immunofluorescence staining and imaging of primary cilia and ciliary signaling in mammary organoids derived from normal and genetically modified stem cells, from healthy and pathological tissues, to study the biology of the primary cilium in health and disease.

Three-Dimensional Imaging of Organoids to Study Primary Ciliogenesis During ex vivo Organogenesis

Stem cell-derived organoids facilitate the analysis of molecular and cellular processes that regulate stem cell self-renewal and differentiation during organogenesis in mammalian tissues. Here we present a protocol for the analysis of the biology of the primary cilium in mouse mammary organoids.

Organoids are stem cell-derived three-dimensional structures that reproduce ex vivo the complex architecture and physiology of organs. Thus, organoids ...

Genetics

Mouse Fetal Liver Culture System to Dissect Target Gene Functions at the Early and Late Stages of Terminal Erythropoiesis

Erythropoiesis involves a dynamic process that begins with committed erythroid burst forming units (BFU-Es) followed by rapidly dividing erythroid colony forming units (CFU-Es). After CFU-Es, cells are morphologically recognizable and generally termed terminal erythroblasts. One of the challenges for the study of terminal erythropoiesis is the lack of experimental approaches to dissect gene functions in a chronological manner. In this protocol, we describe a unique strategy to determine gene functions in the early and late stages of terminal erythropoiesis. In this system, mouse fetal liver TER119 (mature erythroid cell marker) negative erythroblasts were purified and transduced with exogenous expression of cDNAs or small hairpin RNAs (shRNAs) for the genes of interest. The cells were subsequently cultured in medium containing growth factors other than erythropoietin (Epo) to maintain their progenitor stage for 12 hr while allowing the exogenous cDNAs or shRNAs to express. The cells were changed to Epo medium after 12 hr to induce cell differentiation and proliferation while the exogenous genetic materials were already expressed. This protocol facilitates analysis of gene functions in the early stage of terminal erythropoiesis. To study late stage terminal erythropoiesis, cells were immediately cultured in Epo medium after transduction. In this way, the cells were already differentiated to the late stage of terminal erythropoiesis when the transduced genetic materials were expressed. We recommend a general application of this strategy that would help understand detailed gene functions in different stages of terminal erythropoiesis.

We present an in vitro mouse fetal liver erythroblast culture system that dissects the early and late stages of terminal erythropoiesis. This system facilitates functional analysis of specific genes in different developmental stages.

الماوس الجنين الكبد نظام الثقافة لتشريح الهدف جين وظائف في المراحل المبكرة والمتأخرة من محطة الكريات الحمر

Erythropoiesis involves a dynamic process that begins with committed erythroid burst forming units (BFU-Es) followed by rapidly dividing erythroid colony ...

Immunology and Infection

Recapitulating Suckling-to-Weaning Transition In Vitro using Fetal Intestinal Organoids

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to digest solid food. This process is termed suckling-to-weaning transition and results in the replacement of neonatal epithelium with adult epithelium which goes hand in hand with metabolic and morphological adjustments. These complex developmental changes are the result of a genetic program that is intrinsic to the intestinal epithelial cells but can, to some extent, be modulated by extrinsic factors. Prolonged culture of mouse primary intestinal epithelial cells from late fetal period, recapitulates suckling-to-weaning transition in vitro. Here, we describe a detailed protocol for mouse fetal intestinal organoid culture best suited to model this process in vitro. We describe several useful assays designed to monitor the change of intestinal functions associated with suckling-to-weaning transition over time. Additionally, we include an example of an extrinsic factor that is capable to affect suckling-to-weaning transition in vivo, as a representation of modulating the timing of suckling-to-weaning transition in vitro. This in vitro approach can be used to study molecular mechanisms of the suckling-to-weaning transition as well as modulators of this process. Importantly, with respect to animal ethics in research, replacing in vivo models by this in vitro model contributes to refinement of animal experiments and possibly to a reduction in the use of animals to study gut maturation processes.

This protocol describes how to mimic suckling-to-weaning transition in vitro using mouse late fetal intestinal organoids cultured for 30 days.

خلاصه الرضاعة إلى الفطام الانتقالية في المختبر باستخدام الغدد المعوية الجنينية

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to ...

Optimization of Renal Organoid and Organotypic Culture for Vascularization, Extended Development, and Improved Microscopy Imaging

Embryonic kidney organotypic cultures, and especially pluripotent stem cell-derived kidney organoids, are excellent tools for following developmental processes and modelling kidney disease. However, the models are limited by a lack of vascularization and functionality. To address this, an improved protocol for the method of xenografting cells and tissues to the chorioallantoic membrane (CAM) of an avian embryo to gain vascularization and restoration of blood flow was developed. The grafts are overlaid with custom-made minireservoirs that fix the samples to the CAM and supply them with culture medium that protects the grafts from drying. The improved culture method allows xenografts to grow for up to 9 days. The manuscript also describes how to provide optimal conditions for long-term confocal imaging of renal organoids and organotypic cultures using the previously published Fixed Z-Direction (FiZD) method. This method gently compresses an embryonic organ or organoid between a glass coverslip and membrane in a large amount of medium and provides excellent conditions for imaging for up to 12 days. Together, these methods allow vascularization and blood flow to renal organoids and organotypic kidney cultures with improved confocal imaging. The methods described here are highly beneficial for studying fundamental and applied functions of kidneys ex vivo. Both methods are applicable to various types of tissues and organoids.

This work describes two methods for studying organ development, an improved xenotransplantation setup on chorioallantoic membrane (CAM) from avian embryos that allows for vascularization of cultured embryonic organs and organoids and a novel fixed z-direction organ culture method with modified experimental conditions that allows for high-resolution time-lapse confocal imaging.

التحسين من الكلين Organoid وOrganotypic الثقافة للعوعية ، التنمية الموسعة ، وتحسين التصوير المجهري

Embryonic kidney organotypic cultures, and especially pluripotent stem cell-derived kidney organoids, are excellent tools for following developmental ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

الثقافات المشيمة وساقطي الجهاز الإنسان لدراسة العدوى في واجهة الأم والجنين

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis

Postimplantation mammalian embryo culture methods have been generally inefficient and limited to brief periods after dissection out of the uterus. Platforms have been recently developed for highly robust and prolonged ex utero culture of mouse embryos from egg-cylinder stages until advanced organogenesis. These platforms enable appropriate and faithful development of pregastrulating embryos (E5.5) until the hind limb formation stage (E11). Late gastrulating embryos (E7.5) are grown in rotating bottles in these settings, while extended culture from pregastrulation stages (E5.5 or E6.5) requires a combination of static and rotating bottle cultures. In addition, sensitive regulation of O2 and CO2 concentration, gas pressure, glucose levels, and the use of a specific ex utero culture medium are critical for proper embryo development. Here, a detailed step-by-step protocol for extended ex utero mouse embryo culture is provided. The ability to grow normal mouse embryos ex utero from gastrulation to organogenesis represents a valuable tool for characterizing the effect of different experimental perturbations during embryonic development.

Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis

An enhanced platform for whole-embryo culture allows continuous and robust ex utero development of postimplantation mouse embryos for up to six days, from pregastrulation stages until advanced organogenesis. In this protocol, we detail the standard procedure for successful embryo culture using static plates and rotating bottle systems.

خارج الرحم زراعة أجنة الفئران من ما قبل المعدة إلى التكوين العضوي المتقدم

Postimplantation mammalian embryo culture methods have been generally inefficient and limited to brief periods after dissection out of the uterus. ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

نظام ل<em&gt; خارج الجسم</em&gt; التثقيف البنكرياس الجنينية

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Biology

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate tangentially from their place of origin in the ventral telencephalon (including from the medial and caudal ganglionic eminences (MGE, CGE)) to the dorsal cortical plate in response to a variety of intrinsic and extrinsic cues. Different methodologies have been developed over the years to genetically manipulate specific pathways and investigate how they regulate the dynamic cytoskeletal changes required for proper IN migration. In utero electroporation has been extensively used to study the effect of gene repression or overexpression in specific IN subtypes while assessing the impact on morphology and final position. However, while this approach is readily used to modify radially migrating pyramidal cells, it is more technically challenging when targeting INs. In utero electroporation generates a low yield given the decreased survival rates of pups when electroporation is conducted before e14.5, as is customary when studying MGE-derived INs. In an alternative approach, MGE explants provide easy access to the MGE and facilitate the imaging of genetically modified INs. However, in these explants, INs migrate into an artificial matrix, devoid of endogenous guidance cues and thalamic inputs. This prompted us to optimize a method where INs can migrate in a more naturalistic environment, while circumventing the technical challenges of in utero approaches. In this paper, we describe the combination of ex utero electroporation of embryonic mouse brains followed by organotypic slice cultures to readily track, image and reconstruct genetically modified INs migrating along their natural paths in response to endogenous cues. This approach allows for both the quantification of the dynamic aspects of IN migration with time-lapse confocal imaging, as well as the detailed analysis of various morphological parameters using neuronal reconstructions on fixed immunolabeled tissue.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Here, we provide a low-cost and reliable method to generate electroporated brain organotypic slice cultures from mouse embryos suitable for confocal microscopy and live-imaging techniques.

الرحم السابقين انهانسر والثقافات أورجانوتيبيك شريحة من أدمغة الفأر الجنينية للعيش-التصوير لترحيل إينتيرنيورونس جابايرجيك

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate ...

Neuroscience

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

الفأر الجنينية التنمية في الجامعة نظام الثقافة الأجنة الخالية من المصل

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

باستخدام

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

هيئة الثقافة والجامع جبل المناعي تلون ماوس وولف القنوات

Three-Dimensional Imaging of Organoids to Study Primary Ciliogenesis During ex vivo Organogenesis

الماوس الجنين الكبد نظام الثقافة لتشريح الهدف جين وظائف في المراحل المبكرة والمتأخرة من محطة الكريات الحمر

خلاصه الرضاعة إلى الفطام الانتقالية في المختبر باستخدام الغدد المعوية الجنينية

التحسين من الكلين Organoid وOrganotypic الثقافة للعوعية ، التنمية الموسعة ، وتحسين التصوير المجهري

الثقافات المشيمة وساقطي الجهاز الإنسان لدراسة العدوى في واجهة الأم والجنين

خارج الرحم زراعة أجنة الفئران من ما قبل المعدة إلى التكوين العضوي المتقدم

نظام ل

الرحم السابقين انهانسر والثقافات أورجانوتيبيك شريحة من أدمغة الفأر الجنينية للعيش-التصوير لترحيل إينتيرنيورونس جابايرجيك

الفأر الجنينية التنمية في الجامعة نظام الثقافة الأجنة الخالية من المصل