Name: macrophage cholesterol depletion and its effect on the phagocytosis of cryptococcus neoformans
Uploaded: 2014-12-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans at JoVE.com

وأيد هذا العمل من المنح NIH AI56168، ​​AI71142، AI87541 وAI100631 إلى MDP. ماوريتسيو ديل POETA هو بوروز ويلكوم باحث في مجال الأمراض المعدية.

1. الكولسترول استنفاد الخلايا J774A.1 مع MβCD <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في خزانة السلامة البيولوجية العقيمة، والبذور 10 5 J774A.1 الخلايا الشبيهة بلعم لكل بئر على 96-جيدا لوحة زراعة الخلايا في 200 ميكرولتر من Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة (DMEM) تستكمل مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS) و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين (P / S). احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 O / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وسائل الاعلام من أحادي الطبقة الخلية وغسل الخلايا مرتين مع 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) التي تم تصفيتها أو تعقيمها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ميكرولتر من حل MβCD في تركيز (10 ملم أو 30 ملم في PBS) أو برنامج تلفزيوني 1X على النحو المرغوب فيه السيطرة واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 ° C مع اهتزاز. إزالة طاف والاحتياطي في RT للتحليل الكمي مع عدة المتاحة تجاريا باتباع الإجراء على الفور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مرتين إلى ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X أو المصل DMEM مجانا وتواصل مع العدوى أو ليز الخلايا عن طريق pipettiنانوغرام مرتين إلى ثلاث مرات مع H 2 O منزوع الأيونات لتحليل مع طبقة رقيقة اللوني أو مع عدة. ملاحظة: بعد نضوب الكولسترول والمتاحة تجاريا عدة الكولسترول الكمي يمكن استخدامها. انظر القسم المواد للحصول على التفاصيل. اتبع تعليمات الشركة الصانعة كما هو مكتوب. </li></ol> 2. مراقبة من الكولسترول المحتوى من قبل اللوني طبقة رقيقة (TLC) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل خزان TLC مرتين مع الأسيتون ومرة ​​واحدة مع محلول الأثير البترول: ايثر: حمض الخليك (65: 30: 1 من حيث الحجم). تشبع الخزان مع الأثير البترول: ايثر: حمض الخليك (65: 30: 1 من حيث الحجم) حل وترك O / N. ملاحظة: يجب دائما العضوية المذيبات أن تستخدم تحت غطاء الدخان لمنع استنشاق بخار. يجب ارتداء القفازات ومعطف المختبر في جميع الأوقات. حمض الخليك هو حمض قوي وينبغي أن تستخدم بحذر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في خزانة السلامة البيولوجية العقيمة، والبذور 10 6 J774A.1 مثل بلعم الخلايا لكل بئر على م 6-جيدالوحة الثقافة ليرة لبنانية في حجم 5 مل من DMEM الدافئة تستكمل مع 10٪ FBS و 1٪ P / S. احتضان عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 O / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المستنفدة الضامة الكولسترول باتباع الخطوات 1،2-1،4، استبدال 1 مل لمدة 200 ميكرولتر عند الاقتضاء لحساب حجم جيدا أكبر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 500 ميكرولتر من التربسين-EDTA إلى كل بئر، واحتضان لمدة 3 دقائق عند 37 درجة مئوية، وكشط بلطف الخلايا مع مكشطة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل إلى أنبوب microfuge وإضافة 500 ميكرولتر إضافية من DMEM الدافئة تستكمل مع 10٪ FBS و 1٪ P / S. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور الخلايا لمدة 5 دقائق في 300 x ج وإزالة طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 500 ميكرولتر إضافية من DMEM الدافئة تستكمل مع 10٪ FBS و 1٪ P / S إلى الخلية بيليه و resuspend بعناية من قبل pipetting صعودا وهبوطا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة 10 ميكرولتر من الخلايا والعد الخلايا على عدادة الكريات. تطبيع تركيزات خلية من كل عينة وإضافة عدد متساو من الخلايا لأنابيب زجاجية. ملاحظة: في هذه الخطوة، يمكن للمرءاختيار الجمع بين الخلايا من مجموعات العلاج نفسه للحصول على أكثر تركيزا النهائي استخراج الدهون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق على RT وإزالة وسائل الإعلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 مل من الميثانول ودوامة. ثم، إضافة 1 مل من الكلوروفورم ودوامة. التحقق من حالة المرحلة للتأكد من الحل في الطور. ملاحظة: أنابيب يمكن تخزينها في 4 درجات CO / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 1،700 x ج لمدة 10 دقيقة في RT ونقل طاف لأنبوب جديد </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل إضافية من كلوروفورم تليها 1 مل من درهم 2 O. دوامة مرتين لمدة 30 ثانية. أجهزة الطرد المركزي في 1،700 x ج لمدة 5 دقائق على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن أنبوب زجاجي على ميزان حساس واستخدام ماصة باستير الزجاج لنقل المرحلة الدنيا في أنبوب زجاجي من الوزن المعروفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجف أسفل الدهون في المبخر الطرد المركزي حتى تجف (حوالي 2 ساعة). تزن أنبوب مع الدهون المجففة وحساب الوزن الدهون الجاف. ملاحظة: الدهون الجافة يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية لتصبح جاهزة لأداء TLC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الدهون المجففة في الكلوروفورم يكفي لتطبيع تركيز الدهون (عادة 20-50 ميكرولتر) وتحميل 20 ميكرولتر من الدهون المخففة على TLC لوحة السيليكا. تحميل 20 ميكروغرام من الكولسترول مخففة في 20 ميكرولتر من كلوروفورم كمعيار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة المجففة لوحة TLC إلى خزان TLC المشبعة والسماح مذيب للهجرة يصل إلى 1 سم قبل وحة الحافة. إزالة TLC لوحة من دبابات واتركه حتى يجف حوالي 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصور الدهون عن طريق وضع في خزان بخار اليود للتحقق الهجرة. إزالة البقع والسماح لتتلاشى لحوالي 10 - 15 دقيقة تحت غطاء محرك السيارة. ملاحظة: اليود هو خطر استنشاق. استخدام دائما تحت غطاء الدخان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل لتلطيخ محايد الدهون عن طريق الجمع بين 60 مل من الميثانول مع 60 مل من H 2 O منزوع الأيونات، 4 مل من حمض الكبريتيك، و 630 ملغ من كلوريد المنغنيز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعناية وببطء تراجع لوحة TLC في حل الدهون تلطيخ محايد في علبة وازالة دون النزع قبالة السيليكا لآير. ملاحظة: الحل الدهون تلطيخ محايد يمكن إعادة استخدامها عدة مرات وبحيث يمكن استرجاعها من علبة وضعها مرة أخرى في زجاجة لاستخدامها لاحقا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمح لوحة لتجف تحت غطاء محرك السيارة في RT حتى اختفت جميع فقاعات. تسخين لوحة TLC على مجموعة كتلة الحرارة إلى 160 درجة مئوية، وشار إلى اللون المطلوب. ملاحظة: برنامج قياس كثافة مثل LS الرؤية الأشغال يمكن استخدامها لقياس العصابات المتفحمة لمقارنة عينات الدهون. </li></ol> 3. إصابة الضامة مع C. الأدعومية (H99) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في خزانة السلامة البيولوجية العقيمة، والبذور 10 خلايا تشبه البلاعم 5 لكل بئر على 96-جيدا لوحة زراعة الخلايا في 200 ميكرولتر من DMEM تستكمل مع 10٪ FBS و 1٪ P / S. احتضان عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2، 5٪ CO 2 O / N. ملاحظة: يمكن أيضا أن يتم العدوى في الزجاج القاع أطباق مبائر لتسهيل التصوير. لا تزال جميع المبالغ نفسها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو ثقافة C. الأدعومية (H99)، فحقن 10 مل من YNB مع مستعمرة واحدة تم الحصول عليها من لوحة ضرب واحتضان أنه O / N عند 30 درجة مئوية مع اهتزاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل والاعتماد C. الأدعومية (H99) الخلايا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي C. الأدعومية O / N الثقافة في 1،700 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وسائل الاعلام وتجاهل. غسل الخلايا مع 5 مل من برنامج تلفزيوني 1X. الطرد المركزي في 1،700 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة برنامج تلفزيوني ويغسل مع 5 مل من تصفيتها برنامج تلفزيوني 1X. الطرد المركزي في 1،700 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. كرر هذه الخطوة 2 مرات أكثر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة PBS و resuspend في 5 مل من برنامج تلفزيوني 1X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل التخفيف المتسلسل في برنامج تلفزيوني للحصول على 1: 500 التخفيف من ثقافة غسلها. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من العينة الأصلية إلى 900 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X للحصول 1:10 التخفيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر 1:10 عينة المخفف إلى 900 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X للحصول على 1: 100 التخفيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ميكرولتر من 1: عينة المخفف 100 إلى 800 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X للحصول على 1: 500 dilutiفي </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يستغرق 10 ميكرولتر من 1: 500 التخفيف والاعتماد على عدادة الكريات لحساب عدد من الخلايا. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل يعملون لتفعيل الضامة وopsonizing C. الأدعومية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع LPS وIFNγ 100X من الحلول الأسهم من خلال إضافة 10 ميكرولتر إلى 990 ميكرولتر. وتستخدم LPS وIFNγ لتعزيز امتصاص أكلة ولكن ليست مطلوبة لالبلعمة: ملاحظة. إذا كان هناك مصلحة في النشاط فطريات الضامة، نفذ تفعيل O / N عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز قبل الإصابة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في عينة الجمع بين 7.5 ميكرولتر من LPS المخفف، 1.25 ميكرولتر من المخفف IFNγ، 1.25 ميكرولتر من GXM الأجسام المضادة وحجم C. ثقافة الأدعومية الذي يعطي 1.25 × 10 5 الخلايا. جعل حجم ما يصل الى 250 ميكرولتر مضروبا عدد العينات مع DMEM تستكمل مع 10٪ FBS و 1٪ P / S. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة واحتضان الحل لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز. ملاحظة:نضوب الكولسترول (الخطوات 1،2-1،4) يمكن أن يتم بالتزامن مع خطوة طهاية. تأكد لعلاج الضامة قبل الجمع بين حل العاملة، حيث أن خلايا opsonized يجب أن تستخدم على النحو الأمثل لم يعد من 20 دقيقة بعد الحضانة خطوة 3.4.3. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصابة الضامة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الضامة غسل مرتين مع المصل DMEM الحرة وإضافة 200 ميكرولتر من opsonized C. حل الأدعومية العمل على كل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإصلاح وصمة عار الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وسائل الإعلام وغسل الخلايا 2 مرات مع DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الهواء الجاف أحادي الطبقة خلية لمدة 10 دقيقة وإضافة 200 ميكرولتر من الميثانول الجليد الباردة لإصلاح الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 15 دقيقة في RT وإزالة أي الميثانول المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ميكرولتر من 10X بالغيمزا واحتضان لمدة 5 دقائق على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل 2-3 مرات مع الماء منزوع الأيونات وO جاف / N مع غطاء قبالة. ملاحظة: التصوير يمكن القيام به في اليوم التالي أو ما يصل إلى followi الأسبوعنانوغرام تلطيخ. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصور وعدد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام المجهر، عد 300 خلية لكل نقطة بيانات (إذا كان هناك 2 من نفس المعاملة العد 150 لكل بئر) ولاحظ عدد من الضامة المصابة وعدد الخلايا المستخفية اجتاحت. ملاحظة: لضمان حتى أخذ العينات في استخدام نقطة بيانات لوحات 2 في حالة، واختيار 3 مناطق غير متداخلة في لوحة وتعول 50 خلية في المنطقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب مؤشر أكلة بضرب النسبة المئوية للالضامة المصابة حسب متوسط ​​عدد C. الأدعومية في البلاعم. تطبيع مؤشر أكلة بالإعراب عن القيم كنسبة مئوية من برنامج تلفزيوني 1X تعامل السيطرة. بعد عدة محاكمات حساب القيمة المتوسطة والانحراف المعياري للمتوسط ​​لتحديد الاتجاهات في مؤشر البلعمة. استخدام الطالب اختبار t لتحديد أهمية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتخاذ الميكروسكوب من الخلايا في 1،000X أو 400X التكبير. </li></ol></li></ol> 4. التريبان الأزرق الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في خزانة معقمة للسلامة الأحيائية، والبذور 10 6 خلايا تشبه البلاعم لكل بئر على 6 جيدا لوحة الثقافة خلية في حجم 5 مل من Dulbecco والحد الأدنى من المتوسط ​​ضروري (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين . احتضان عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 O / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المستنفدة الضامة الكولسترول باتباع الخطوات 1،2-1،4 استبدال 2 مل لمدة 200 ميكرولتر عند الاقتضاء لحساب حجم جيدا أكبر. ملاحظة: تأكد من تضمين عنصر تحكم تعامل مع برنامج تلفزيوني 1X فضلا عن التحكم التي يتم كشط قبل أي علاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 500 ميكرولتر من 1X PBS إلى كل بئر وكشط بلطف الخلايا مع مكشطة الخلية. نقل إلى أنبوب microfuge وتعليق الخلايا عن طريق pipetting بلطف صعودا وهبوطا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة 10 ميكرولتر من الخلايا وصمة عار مع 1 ميكرولتر من 4٪ التريبان الأزرق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الخلايا على عدادة الكريات وحساب الجدوى باستخدام المعادلة التالية:٪ الجدوى = [1 - (خلايا الأزرق / مجموع الخلايا)]س 100. القيم تطبيع إلى عنصر التحكم الذي كان دون علاج. بعد عدة محاكمات حساب قيمة المتوسط ​​والانحراف المعياري لتحديد الاتجاهات في قدرتها على البقاء. استخدام الطالب اختبار t لتحديد أهمية. </li></ol>

<ol>
	<li>Sarantis, H., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subversion+of+phagocytosis+for+pathogen+survival.">Subversion of phagocytosis for pathogen survival.</a> Cell Host &amp; Microbe. 12 (4), 419-431 (2012).</li><li>Rougerie, P., Miskolci, V., Cox, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+Of+Membrane+Structures+During+Phagocytosis+And+Chemotaxis+Of+Macrophages:+Role+And+Regulation+Of+The+Actin+Cytoskeleton.">Generation Of Membrane Structures During Phagocytosis And Chemotaxis Of Macrophages: Role And Regulation Of The Actin Cytoskeleton.</a> Immunological Reviews. 256 (1), 222-239 (1111).</li><li>Liu, T., Perlin, D. S., Xue, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mechanisms+Of+Cryptococcal+Meningitis.">Molecular Mechanisms Of Cryptococcal Meningitis.</a> Virulence. 3, 173 (2012).</li><li>Abadi, J., Pirofski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Antibodies+Reactive+With+The+Cryptococcal+Capsular+Polysaccharide+Glucuronoxylomannan+Are+Present+In+Sera+From+Children+With+And+Without+Human+Immunodeficiency+Virus+Infection.">A Antibodies Reactive With The Cryptococcal Capsular Polysaccharide Glucuronoxylomannan Are Present In Sera From Children With And Without Human Immunodeficiency Virus Infection.</a> The Journal Of Infectious Diseases. 180 (3), 915-919 (1999).</li><li>Kechichian, T. B., Shea, J., Del Poeta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+Of+Alveolar+Macrophages+Decreases+The+Dissemination+Of+A+Glucosylceramide-Deficient+Mutant+Of+Cryptococcus+Neoformans+In+Immunodeficient+Mice.">Depletion Of Alveolar Macrophages Decreases The Dissemination Of A Glucosylceramide-Deficient Mutant Of Cryptococcus Neoformans In Immunodeficient Mice.</a> Infection And Immunity. 75 (10), 4792-4798 (2007).</li><li>Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococci+At+The+Brain+Gate:+Break+And+Enter+Or+Use+A+Trojan+Horse.">Cryptococci At The Brain Gate: Break And Enter Or Use A Trojan Horse.</a> The Journal Of Clinical Investigation. 120 (5), 1389-1692 (1172).</li><li>Chr&#233;tien, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+Of+Cerebral+Cryptococcus+Neoformans+Infection+After+Fungemia.">Pathogenesis Of Cerebral Cryptococcus Neoformans Infection After Fungemia.</a> The Journal Of Infectious Diseases. 186 (4), 522-530 (2002).</li><li>Luberto, C., Martinez-Mari&#241;o, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+Of+App1+As+A+Regulator+Of+Phagocytosis+And+Virulence+Of+Cryptococcus+Neoformans.">Identification Of App1 As A Regulator Of Phagocytosis And Virulence Of Cryptococcus Neoformans.</a> The Journal Of Clinical Investigation. 112 (7), 1080-1094 (1172).</li><li>Mcquiston, T. J., Williamson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paradoxical+Roles+Of+Alveolar+Macrophages+In+The+Host+Response+To+Cryptococcus+Neoformans.">Paradoxical Roles Of Alveolar Macrophages In The Host Response To Cryptococcus Neoformans.</a> Journal Of Infection And Chemotherapy: Official Journal Of The Japan Society Of Chemotherapy. 18 (1), 1-9 (2012).</li><li>Garc&#237;a-Rodas, R., Zaragoza, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catch+Me+If+You+Can:+Phagocytosis+And+Killing+Avoidance+By+Cryptococcus+Neoformans.">Catch Me If You Can: Phagocytosis And Killing Avoidance By Cryptococcus Neoformans.</a> FEMS Immunology And Medical Microbiology. 64 (2), 147-161 (2012).</li><li>Coelho, C., Bocca, A. L., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Intracellular+Life+Of+Cryptococcus+Neoformans.">The Intracellular Life Of Cryptococcus Neoformans.</a> Annual Review Of Pathology. 9. 219, 10-1146 (2014).</li><li>Rao, M., Peachman, K. K., Alving, C. R., Rothwell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+Of+Cellular+Cholesterol+Interferes+With+Intracellular+Trafficking+Of+Liposome-Encapsulated+Ovalbumin.">Depletion Of Cellular Cholesterol Interferes With Intracellular Trafficking Of Liposome-Encapsulated Ovalbumin.</a> Immunology And Cell Biology. 81, 415-423 (2003).</li><li>Sein, K. K., Aikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Prime+Role+Of+Plasma+Membrane+Cholesterol.">The Prime Role Of Plasma Membrane Cholesterol.</a> In The Pathogenesis Of Immune Evasion And Clinical Manifestations Of Falciparum Malaria. Medical Hypotheses. 51 (2), 10-1016 (1998).</li><li>Pucadyil, T. J., Tewary, P., Madhubala, R., Chattopadhyay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+Is+Required+For+Leishmania+Donovani+Infection:+Implications+In+Leishmaniasis.">Cholesterol Is Required For Leishmania Donovani Infection: Implications In Leishmaniasis.</a> Molecular And Biochemical Parasitology. 133, 145-152 (2004).</li><li>Tagliari, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Microdomain+Components+Of+Histoplasma+Capsulatum+Yeast+Forms,+And+Their+Role+In.">Membrane Microdomain Components Of Histoplasma Capsulatum Yeast Forms, And Their Role In.</a> Alveolar Macrophage Infectivity. Biochimica Et Biophysica Acta. 1818 (3), 458-466 (2012).</li><li>Crane, J. M., Tamm, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+Of+Cholesterol+In+The+Formation+And+Nature+Of+Lipid+Rafts+In+Planar+And+Spherical+Model+Membranes.">Role Of Cholesterol In The Formation And Nature Of Lipid Rafts In Planar And Spherical Model Membranes.</a> Biophysical Journal. 86 (5), 2965-2979 (2004).</li><li>Brown, D. A., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+Of+Lipid+Rafts+In+Biological+Membranes.">Functions Of Lipid Rafts In Biological Membranes.</a> Annual Review Of Cell And Developmental Biology. 14, 111-136 (1998).</li><li>Simons, K., Toomre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Rafts+And+Signal+Transduction+Nature+Reviews.">Lipid Rafts And Signal Transduction Nature Reviews.</a> Molecular Cell Biology. 1 (1), 31-39 (2000).</li><li>Ilangumaran, S., Hoessli, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+Of+Cholesterol+Depletion+By+Cyclodextrin+On+The+Sphingolipid+Microdomains+Of+The+Plasma+Membrane.">Effects Of Cholesterol Depletion By Cyclodextrin On The Sphingolipid Microdomains Of The Plasma Membrane.</a> The Biochemical Journal. 335 (Pt 2), 433-440 (1998).</li><li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rapid+Method+Of+Total+Lipid+Extraction+And+Purification).">A Rapid Method Of Total Lipid Extraction And Purification).</a> Canadian Journal Of Biochemistry And Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).</li><li>Mukherjee, S., Lee, S., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+To+Cryptococcus+Neoformans+Glucuronoxylomannan+Enhance+Antifungal+Activity+Of+Murine+Macrophages.">Antibodies To Cryptococcus Neoformans Glucuronoxylomannan Enhance Antifungal Activity Of Murine Macrophages.</a> Infect. Immun. 63 (2), 573-579 (1995).</li><li>Deshaw, M., Pirofski, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+To+The+Cryptococcus+Neoformans+Capsular+Glucuronoxylomannan+Are+Ubiquitous.">Antibodies To The Cryptococcus Neoformans Capsular Glucuronoxylomannan Are Ubiquitous.</a> In Serum From HIV+ And HIV- Individuals. Clinical And Experimental Immunology. 99 (3), 425-432 (1995).</li><li>Tripathi, K., Mor, V., Bairwa, N. K., Del Poeta, M., Mohanty, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyurea+Treatment+Inhibits+Proliferation+Of+Cryptococcus+Neoformans+In+Mice.">Hydroxyurea Treatment Inhibits Proliferation Of Cryptococcus Neoformans In Mice.</a> Frontiers In Microbiology. 3, 187 (2012).</li><li>Chaka, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Analysis+Of+Phagocytosis+And+Killing+Of+Cryptococcus+Neoformans+By+Human+Peripheral+Blood+Mononuclear+Cells+By+Flow+Cytometry.">Quantitative Analysis Of Phagocytosis And Killing Of Cryptococcus Neoformans By Human Peripheral Blood Mononuclear Cells By Flow Cytometry.</a> Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2 (6), 753-759 (1995).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

في العمل مع هذا البروتوكول من المهم الحصول على عدد خلايا دقيقة عندما تصفيح خلايا الثدييات وopsonizing C. خلايا الأدعومية. هذا يقلل من التباين بين التجارب ويضمن ودقيقة 1: 1 هدف إلى نسبة المستجيب طوال فترة الدراسة. فمن الأهمية بمكان لتنسيق توقيت استنزاف الكولسترول والإصابة لمنع خلايا الخميرة opsonized أو خلايا البلاعم المعالجة من يستريح في RT بين الإجراءات أيضا. فترات انتظار طويلة يمكن أن يؤدي إلى فقدان الجسم المضاد طهاية أو يستكمل الكوليسترول المنضب قبل أن تبدأ العدوى. إذا تتم التجارب بدقة تحليل البيانات يسمح لاستنتاجات لتمييزها عن دور الكوليسترول في البلعمة. القيود المفروضة على تقنية تمنع أي استنتاجات فيما يتعلق بآلية محددة من خلالها استنزاف الكولسترول يخفض مؤشر البلعمة من البلاعم مثل الخلايا، وأنه من غير الواضح ما إذا كان EFfect غير مباشرة بسبب الكوليسترول أو بسبب آلية الثانوية. مزيد من العمل على هذا المنوال يحقق مكونات أخرى من الطوافات الدهنية مثل الإسفنجية أو البروتينات المعروفة إلى وظيفة في البلعمة مثل مستقبلات Fcγ ومستقبلات مكملا 3 2. تعديل هذه التقنية لاستخدام الأجسام المضادة إما طهاية أو تكمل وحدها يمكن أن تساعد في التمييز بين دور لل الكولسترول في أحد هذه الممرات المعروفة أو كليهما. ومن المهم أيضا أن نتذكر أن MβCD مقتطفات الكولسترول استنادا للا مائية وحجمه، وبالتالي الجامدة ذات حجم مماثل يمكن أيضا أن تستنفد وسوف تهاجر بمعدل مماثل كما الكولسترول على TLC. ومن المهم أيضا أن نلاحظ أن نضوب الكوليسترول يمكن أن تؤثر بشكل جزئي تفعيل بلعم، وهذا من غير المرجح أن تكون مسؤولة عن الفرق التي لوحظت في امتصاص كما يؤدون العدوى في غياب IFN- وLPS معارض نفس انخفاض في الإقبال على C. الأدعومية (لا تظهر البيانات)، بور فإنه من الفائدة عند تعديل هذه التقنية لدراسة الأنشطة المضادة للفطريات الضامة ودور التنشيط. هذه الطريقة أيضا لا تسمح لنا أن نتبين ما إذا كانت نضوب الكولسترول لديه أي آثار علاجية في عدوى فطرية. مزيد من العمل في الجسم الحي مع عقاقير خفض الكوليسترول والدراسات الوبائية من المرضى الذين يستخدمون عقاقير خفض الكوليسترول قد يزيد من توضيح دور للنضوب الكولسترول في علاج هذا المرض ويمكن أن توفر وسيلة أكثر انتقائية لمنع تراكم الكولسترول. ويمكن بسهولة استخدام هذا الإجراء لدراسة امتصاص مسببات الأمراض الأخرى أو الجزيئات الصلبة (أي، الخرز الزجاجي) التي phagocytized والسماح لدراسة البيولوجيا الأساسية من البلعمة. تعديلات قد يسمح لدراسة جوانب أخرى من البلعمة عن طريق معالجة خلايا البلاعم مع الانزيمات لتتحلل بشكل انتقائي مكونات غشاء أخرى أو العقاقير المختلفة ومثبطات والتي قد تكون من بينطبقا لتقديرات وتجدر الإشارة أيضا إلى أن التدفق الخلوي قد يقدم طريقة أكثر دقة والكمية لتوصيف البلعمة ويمكن استخدامها لتحل محل العد المجهري المباشر 24. تماما، وهذا هو تقنية بسيطة نسبيا والتي يمكن استخدامها كنقطة انطلاق لمزيد من التفاصيل دراسات متعمقة أن الإجابة على الأسئلة حول كيف يمكن أن تلعب الدهون دورا هاما في العدوى واستجابة جهاز المناعة.

البلعمة هي العملية التي يتم المنضوية كيانات خارج الخلية من قبل الخلايا المضيفة. بل هو سلاح أساسي في ترسانة النظام المناعي للدفاع ضد مسببات الأمراض، ولكن قد تكون في كثير من الأحيان تخريب العملية التي مسببات الأمراض للسماح لاستيعاب ونشر في جميع أنحاء الجسم 1. وبوساطة البلعمة من قبل العديد من الأحداث يشير إلى أن يؤدي إلى التعلق والغمر عن طريق إعادة ترتيب الهيكل الخلوي الخلية المضيفة. البالعات &quot;الفنية&quot; قادرة على إدراك وربط opsonins على سطح الممرض الغازية للإشارة لمرفق وتشكيل أقدام صفاحية التي تبتلع الممرض وتشكيل يبلوع 2. ومن بين ما يسمى البالعات &#39;المهنية&#39; هم الضامة. الضامة هي خلايا متخصصة للغاية التي تنفذ مهام الحماية التي تشمل السعي إلى القضاء على المرض والعوامل المسببة، وإصلاح الأنسجة التالفة، والتوسط من الالتهاب، ومعظمهذه من خلال عملية البلعمة 1،2. المستخفية المورمة هي الأنواع من الخميرة الممرضة التي تسبب مرض خطير يعرف باسم المستخفيات. يتم استنشاق الجراثيم المستخفية من قبل المضيف ويؤدي الى عدوى رئوية التي عادة ما تكون أعراض. ويعتقد أن التعرض منتشر للغاية. وقد أظهرت عينة من 61 طفلا من الأمراض المعدية للأطفال عيادة في مركز مستشفى برونكس لبنان وجدت أن كل الذين شملهم الاستطلاع كان الأجسام المضادة للglucuronoxylomannan السكاريد بالمستخفيات وغيرها من الدراسات انتشار في كل من فيروس نقص المناعة البشرية (HIV) غير مصاب والبالغين المصابين 3، 4. الضامة السنخية هي الخط الأول للاستجابة للعدوى رئوية واضح في معظم الحالات بنجاح الممرض. ومع ذلك، في الأفراد المناعة (المرضى على سبيل المثال، فيروس نقص المناعة البشرية والإيدز) الخميرة قادرة على البقاء على قيد الحياة داخل الضامة. في هذهالحالات، يمكن للالضامة بمثابة محراب للتكرار من مسببات المرض ويمكن أن تسهل نشرها على الجهاز العصبي المركزي (CNS) حيث يصبح المرض قاتلا 5-8. ويعتقد أن الضامة حتى يمكن تقديم الخميرة مباشرة في السحايا، مما يساعد الخميرة لعبور حاجز الدم في الدماغ عن طريق &quot;حصان طروادة&quot; نموذج 3،9 - 11. وبالتالي، فمن المهم أن نفهم عملية البلعمة والعوامل التي تؤثر عليه، وخاصة في الالتهابات بالمستخفيات. العمل السابق في أنظمة الممرض أخرى تشير إلى الكولسترول والدهون الطوافات التي شكلتها الكولسترول وجود دور هام في البلعمة 12-15. الكولسترول هو النوع الأكثر وفرة الدهون في خلايا الثدييات، وتضم 25 - 50٪ من غشاء الخلية الثدييات 16. وقد وجد أن تلعب دورا في تحوير BIOPخصائص hysical الأغشية عن طريق تغيير صلابة من 17. الكولسترول والإسفنجية تشكل معا microdomains الدهون داخل غشاء المعروفة باسم الطوافات الدهنية. تم العثور على الطوافات الدهنية أن تشارك في تشكيل caveolae، فضلا عن توفير مجال معزولة لأنواع معينة من إشارات 16-18. نظرا لصغر حجمها، فمن الصعب لدراسة الطوافات الدهنية في الجسم الحي. طريقة واحدة مفيدة لدراسة دور الطوافات الدهنية هو تغيير ناخبيهم. الميثيل-β-سيكلودكسترين (MβCD) هو مركب التي تم العثور عليها في استنزاف الكولسترول من الأغشية الثدييات ويستخدم عادة لدراسة دور الطوافات الدهنية 18. في هذا البروتوكول، ونحن نقدم وسيلة لاستنزاف الكولسترول من أغشية الخلية المضيفة وقياس تأثير استنزاف على قدرة الخلايا المضيفة في phagocytose C. الأدعومية في المختبر. هذا الإجراء يجعل من استخدام زراعة الخلايا TECHNIQUES على البلاعم خلد مثل خط الخلية (J774A.1) كنموذج للعدوى. تم انجازه استنزاف الكولسترول عن التعرض لMβCD، والذي له نواة مسعور محدد لحجم الجامدة وغير قادرة على بمثابة بالوعة للالكولسترول لاستدراجه للخروج من غشاء 19. وقد تم قياس نضوب الكولسترول كميا باستخدام عدة المتاحة تجاريا ونوعيا باستخدام بلي-داير استخراج الدهن تعديل تليها طبقة رقيقة اللوني (TLC) 20. . تم قياس البلعمة عن طريق إصابة خط الخلية مع ثقافة الخميرة opsonized مختلطة مع كوكتيل من انترفيرون γ وlipopolysaccharide في تفعيل الضامة وopsonized المستخفية باستخدام glucuronoxylomannan (GXM) الأجسام المضادة 21-23. تلطيخ والتجارب المجهري سمحت لرؤية الخلايا وحساب مؤشر أكلة لتقييم درجة البلعمة. أخذت معا، وهذا البروتوكول دescribes طريقة الأساسي الذي يدمج تغيير تركيبة الدهون مع عملية الفسيولوجية.

<table><tbody><tr><td>Class II type A2 Biosafety Cabinet</td><td>Labconco</td><td>3460009</td><td></td></tr><tr><td>J774A.1 cell line</td><td>ATCC</td><td>TIB-67</td><td>Arrives Frozen. See ATCC instructions for culturing.</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle Medium</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>Store at 4 &amp;deg;C and warm to 37 &amp;deg;C prior to use</td></tr><tr><td>HI Fetal Bovine Serum Performance Plus</td><td>Gibco</td><td>10082-147</td><td>Keep frozen at -20 &amp;deg;C and thaw before adding to DMEM</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Used to suplement DMEM</td></tr><tr><td>Isotemp Cell culture incubator</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Model # 3530</td></tr><tr><td>96-Well culture dish</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>10x Phosphate Buffered Saline</td><td>Fisher Scientific BioReagents</td><td>BP3994</td><td>Dilute to 1x and filter or autoclave prior to use.</td></tr><tr><td>Methyl-&amp;beta;-cyclodextrin</td><td>Sigma Life Science</td><td>C4555-10G</td><td>Dissolve in 1x PBS to make solutions of 10 mM and 30 mM concentrations</td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>Labline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit</td><td>Life Technologies Molecular Probes</td><td>A12216</td><td>All reagents for Cholesterol Assay are contained within the kit. Follow Manufacturer instructions.</td></tr><tr><td>96-Well Black Assay plate</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>FilterMax microplate reader</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Model F5</td></tr><tr><td>TLC chamber</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z126195-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650498-4L</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-2L-R</td><td></td></tr><tr><td>TLC Paper</td><td>Whatman</td><td>3030917</td><td>Cut down to size needed for TLC tank</td></tr><tr><td>Fume hood</td><td></td><td></td><td>Any fume hood that complies with AIHA/ANSI Standards</td></tr><tr><td>6-Well plate</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Cell scraper</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3010</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Model Alegra x-30R</td></tr><tr><td>Votex mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td>Model # MS104S meaures down to 0.1 mg</td></tr><tr><td>Glass Pasteur pipette</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>700000</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac concentrator</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Model # SPD2010</td></tr><tr><td>Petroleum ether</td><td>Fisher Scientific</td><td>E139-1</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl ether</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>309966</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td></td></tr><tr><td>TLC Silica Gel 60 with concentrating zone</td><td>Analytical Chromatograhy Millipore</td><td>1.11845.0001</td><td></td></tr><tr><td>Iodine chips</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>376558-50G</td><td></td></tr><tr><td>Sulfuric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320501</td><td></td></tr><tr><td>Manganese chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244589</td><td></td></tr><tr><td>UVP EC3 Imaging System</td><td>Ultra-Violet Products Ltd.</td><td></td><td>Use the Vision Works LS software for densitometry analysis</td></tr><tr><td>Glass bottom confocal dish</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-10C</td><td>www.glassbottomdishes.com</td></tr><tr><td>Cryptococcus neoformans (H99)</td><td></td><td></td><td>Obtained from Duke University Medical Center</td></tr><tr><td>YNB</td><td>BD</td><td>239210</td><td>See manufacturer for preparation instructions. Use a glucose concentration of 20 g/L.</td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide</td><td>Sigma</td><td>L4391-1MG</td><td>Dissolve in 1x PBS to make 1 mg/ml stock. Store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Interferon gamma</td><td>Sigma</td><td>I4777</td><td>Dissolve in 1x PBS to make 0.1 mg/ml stock solution</td></tr><tr><td>Glucuronoxylomannan antibody (anti-GXM)</td><td></td><td></td><td>Gift from Arturo Casadevall&#039;s Lab concentration is 1.98 mg/ml</td></tr><tr><td>Giemsa</td><td>MP Biomedicals</td><td>194591</td><td>Dissolve 0.8 g of Giemsa in 25 ml of glycerol and heat to 60 &amp;deg;C for 1 hr. Add 25 ml of methanol to the solution and allow to age at room temperature for at least 1 month.</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Observer.D1 microscope with AxioCam MRm for taking images</td></tr></tbody></table>

macrophage cholesterol depletion and its effect on the phagocytosis of cryptococcus neoformans

المستخفيات هو عدوى تهدد الحياة التي تسببها الفطريات المسببة للأمراض من جنس المستخفية. تحدث العدوى عند استنشاق جراثيم، والتي هي قادرة على تكرار في الرئة العميقة. البلعمة من المستخفية بواسطة الضامة هي واحدة من الطرق أن هذا المرض هو قادرة على الانتشار في النظام العصبي المركزي لتسبب التهاب السحايا والدماغ القاتل. لذلك، ودراسة العلاقة بين المستخفية والضامة مهمة لفهم تطور العدوى. تصف هذه الدراسة بروتوكول خطوة بخطوة لدراسة البلاعم العدوى التي كتبها C. الأدعومية في المختبر. باستخدام هذا البروتوكول، ودرس دور الجامدة المضيف على التفاعلات المضيف الممرض. استخدمت سيكلودكسترين (MCD) في استنزاف الكولسترول من الفئران شبكية ساركوما مثل بلعم خط الخلية J774A.1 - تركيزات مختلفة من الميثيل. وأكد استنزاف الكولسترول وكميا باستخدام كل من المتوفره تجاريامواقع الحكومة الإلكترونية عدة الكولسترول الكمي وطبقة رقيقة اللوني. تم تنشيط خلايا الكوليسترول المنضب باستخدام Lipopolysacharide (LPS) والانترفيرون غاما (IFNγ) وإصابة مع opsonized الأجسام المضادة المستخفية المورمة البرية من نوع الخلايا H99 في نسبة المستجيب إلى الهدف 1: 1. تم رصد الخلايا المصابة بعد 2 ساعة من الحضانة مع C. تم حساب الأدعومية ومؤشر على البلعمة. أدى استنزاف الكولسترول في انخفاض كبير في مؤشر البلعمة. البروتوكولات قدمت وتقدم طريقة مريحة لمحاكاة بدء عملية العدوى في بيئة المختبر ودراسة دور تكوين الدهون المضيف على العدوى.

الكولسترول استنفاد تحليل طاف محفوظة في الخطوة 1.3 من البروتوكول باتباع إرشادات الشركة المصنعة في Amplex الأحمر الكولسترول الفحص عدة غلة تركيز مرتفع من الكولسترول في عينة MβCD تعامل على أنها مقارنة بالكنترول برنامج تلفزيوني 1X. اعتمادا على نوع من الخلايا والتركيز MβCD المستخدمة استنزاف الكوليسترول قد تختلف. لJ774 تعامل مع 10 ملي MβCD، لوحظ وجود استنزاف ما يقرب من 50٪. ويمكن حساب استنزاف باستخدام القيم التي تم الحصول عليها من طاف والخلايا المحللة التي تم جمعها في الخطوة 1.4 (الشكل 1). المحللة خلية تحليلها باستخدام TLC يظهر انخفاض ملحوظ في تلطيخ الكولسترول في الخلايا المعالجة مع زيادة تركيز MβCD (الشكل 2A). ويظهر تحليل كثافة من TLC اتجاها مماثلا لفحص الكمي (الشكل 2B). طريقة بلي-داير يعطي تحويلة الخامract من الدهون الكلية وأنه من الضروري للسماح للانفصال كافية من الدهون من أجل تحديد الفرقة الصحيحة باستخدام معيار الكوليسترول في الدم. عدوى بعد اتباع الإجراء العدوى، تبقى خلايا الالتزام وسليمة. يبقى مورفولوجيا الخلايا دون تغيير بين مجموعات العلاج. مجموعة التحكم التي لم تتعرض لC. يخدم الأدعومية باعتباره نقطة تفتيش (الشكل 3). ومن الممكن الحصول على نتائج دون المستوى الأمثل وربما تظهر كما تحلل الخلايا والأشكال التضاريسية غير طبيعية أخرى. السبب الأكثر احتمالا هو تلوث خط الخلية أو الكواشف المستخدمة في الإجراء. الميكروسكوب من الخلايا المصابة على النحو الأمثل تظهر بوضوح C. اجتاحت الأدعومية داخل خلايا الثدييات. يمكن ملاحظة اختلافات في عدد من الخميرة phagocytized عن طريق الملاحظة بين مجموعات العلاج (الشكل 4). بعد احتساب مؤشر أكلة من 300 خلايا البلاعم في العلاج المجموعةتم العثور على انخفاض في المؤشر أكلة في الكوليسترول المنضب الخلايا (الشكل 5). لا يظهر انخفاض في مؤشر أكلة أن تعتمد على الاختلافات المحتملة في تفعيل بلعم، على الرغم من أنها قد تحدث. أداء العدوى في غياب تفعيل بلعم، ولكن بعد العلاج مع النتائج MCD في انخفاض مماثل مؤشر البلعمة (لا تظهر البيانات). التريبان الأزرق ويستخدم التريبان الأزرق تلطيخ لتقييم جدوى من الخلايا بعد نضوب الكولسترول. ويلاحظ أي تغيير في جدوى بين PBS المعالجة و10MM MCD تعامل الخلايا. يظهر قابلية لاسقاط قليلا بعد العلاج مع 30 ملي MCD، الذي يمكن أن يتوقع نتيجة لاستنزاف ما يقرب من 75٪ في الكوليسترول (الدهون وضروري) لوحظ في تحليل كثافة (الشكل 6 والشكل 2B). <img alt="الشكل (1)" sالصليب الأحمر = &quot;/ الملفات / ftp_upload / 52432 / 52432fig1highres.jpg&quot; العرض = &quot;550&quot; /&gt; الشكل 1. المحتوى الكولسترول من طاف بعد العلاج. الكمي الكوليسترول في طاف جمعها من الخلايا المعالجة يظهر تخصيب اليورانيوم في MCD بالمقارنة مع 1X PBS. نضوب الكولسترول هو 50 ± 5٪ تحسب من نسبة الكولسترول الكلي في برنامج تلفزيوني 1X (طاف + المحللة الخلية). تظهر أشرطة الخطأ الانحراف المعياري (ن = 5). <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/52432/52432fig2highres.jpg" width="450" /> الشكل 2. TLC الكوليسترول في المحللة الخلية وكثافة. صورة وضعت لوحة TLC تصور مع MnCl 2 تفحيم. وينظر الى انخفاض ملحوظ في نسبة الكوليسترول بعد العلاج MβCD (A). تحليل كثافة من العصابات بالمقارنة مع PBS معاملة السيطرة (كما هو موضح 100٪) يؤكد الاتجاه وجدت في الكولسترول الكمي فحص (B </stronز&gt;). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52432/52432fig2highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52432/52432fig3highres.jpg" width="700" /> الشكل 3. الميكروسكوب السيطرة غير المصابة الضامة J774 المعالجة. صور من الخلايا غير المصابة J774 التي اتخذت في 200X التكبير. شريط النطاق هو 50 ميكرون. برنامج تلفزيوني 1X (A)، و 10 ملي MβCD (B)، و 30 ملي MβCD (C) الخلايا المعالجة تظهر أي تغيير. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52432/52432fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/52432/52432fig4highres.jpg" width="700" /> الشكل 4. العدوى من J774 الضامة معيتم إظهار التكبير C. الأدعومية صور من الخلايا المصابة J774 التي اتخذت في 400X (أعلى A.1 صف واحد - - C.1). و1،000X (C.2 A.2 الصف السفلي). المنضوية C. تظهر خلايا الأدعومية كما المجالات الأزرق البنفسجي مع عصابة أخف المحيطة بهم. الخلايا المعالجة مع برنامج تلفزيوني 1X (A)، و 10 ملي MβCD (B)، و 30 ملي MβCD (C) الخلافات تظهر في C. الأدعومية امتصاص. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52432/52432fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/52432/52432fig5highres.jpg" width="550" /> ويظهر الشكل 5. أكلة أكلة مؤشر الرقم القياسي. فيما يتعلق السيطرة على المجموعة التي عولجت PBS (ملحوظ في 100 للمقارنة). تم تخفيض مؤشر أكلة بنسبة 25٪ بحلول 10ملي MβCD العلاج وقبل ما يقرب من 55٪ من 30 ملي العلاج. تظهر أشرطة الخطأ الانحراف المعياري للمتوسط ​​(ن = 4). <img alt="الشكل (6)" src="/files/ftp_upload/52432/52432fig6highres.jpg" width="450" /> الشكل 6. بقاء الخلية. الاختلافات في بقاء الخلية بواسطة فحص الأزرق التريبان تظهر اختلاف بسيط عند المقارنة بين جميع مجموعات العلاج الثلاثة. هناك انخفاض طفيف باتجاه آخر في جدوى في ملي MβCD مجموعة العلاج 30، والذي يمكن توقعه من نضوب مثل عنصرا رئيسيا من الغشاء. تظهر أشرطة الخطأ الانحراف المعياري (ن = 4).

Watch this Scientific Journal Video about Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans at JoVE.com

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

بلعم الكولسترول استنفاد وتأثيره على البلعمة من<em&gt; المستخفية المورمة</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

macrophage-cholesterol-depletion-its-effect-on-phagocytosis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

12.6K Views.  Stony Brook University. In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections. 

Video: Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

Macrophages are critical players in the innate immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune response and directing the acquired immune response. Macrophage dysfunction can lead to an inability to mount an appropriate immune response and as such, has been implicated in many disease processes, including inflammatory bowel diseases. Macrophages display polarized phenotypes that are broadly divided into two categories. Classically activated macrophages, activated by stimulation with IFN&gamma; or LPS, play an essential role in response to bacterial challenge whereas alternatively activated macrophages, activated by IL-4 or IL-13, participate in debris scavenging and tissue remodeling and have been implicated in the resolution phase of inflammation. During an inflammatory response in vivo, macrophages are found amid a complex mixture of infiltrating immune cells and may participate by exacerbating or resolving inflammation. To define the role of macrophages in situ in a whole animal model, it is necessary to examine the effect of depleting macrophages from the complex environment. To ask questions about the role of macrophage phenotype in situ, phenotypically defined polarized macrophages can be derived ex vivo, from bone marrow aspirates and added back to mice, with or without prior depletion of macrophages. In the protocol presented here clodronate-containing liposomes, versus PBS injected controls, were used to deplete colonic macrophages during dextran sodium sulfate (DSS)-induced colitis in mice. In addition, polarized macrophages were derived ex vivo and transferred to mice by intravenous injection. A caveat to this approach is that clodronate-containing liposomes deplete all professional phagocytes, including both dendritic cells and macrophages so to ensure the effect observed by depletion is macrophage-specific, reconstitution of phenotype by adoptive transfer of macrophages is necessary. Systemic macrophage depletion in mice can also be achieved by backcrossing mice onto a CD11b-DTR background, which is an excellent complementary approach. The advantage of clodronate-containing liposome-mediated depletion is that it does not require the time and expense involved in backcrossing mice and it can be used in mice regardless of the background of the mice (C57BL/6, BALB/c, or mixed background).

Macrophages play a central role in homeostasis and pathology in many tissues. The protocol presented here describes methods for depleting macrophages in vivo, deriving polarized macrophages from bone marrow aspirates, and adoptively transferring macrophages into mice. These techniques allow determination of the role that polarized macrophages play in health and disease.

نضوب وإعادة إعماره الضامة في الفئران

Macrophages are critical players in the innate  immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune  response and directing ...

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of phagocytes to the site where pathogens are located; (ii) recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) through pattern recognition receptors (PRRs); (iii) engulfment of microorganisms bound to the phagocyte cell membrane, and (iv) processing of engulfed cells within maturing phagosomes and digestion of the ingested particle. Studies that assess phagocytosis in its entirety are informative1, 2, 3, 4, 5 but are limited in that they do not normally break the process down into migration, engulfment and phagosome maturation, which may be affected differentially. Furthermore, such studies assess uptake as a single event, rather than as a continuous dynamic process. We have recently developed advanced live-cell imaging technologies, and have combined these with genetic functional analysis of both pathogen and host cells to create a cross-disciplinary platform for the analysis of innate immune cell function and fungal pathogenesis. These studies have revealed novel aspects of phagocytosis that could only be observed using systematic temporal analysis of the molecular and cellular interactions between human phagocytes and fungal pathogens and infectious microorganisms more generally. For example, we have begun to define the following: (a) the components of the cell surface required for each stage of the process of recognition, engulfment and killing of fungal cells1, 6, 7, 8; (b) how surface geometry influences the efficiency of macrophage uptake and killing of yeast and hyphal cells7; and (c) how engulfment leads to alteration of the cell cycle and behavior of macrophages 9, 10.
In contrast to single time point snapshots, live-cell video microscopy enables a wide variety of host cells and pathogens to be studied as continuous sequences over lengthy time periods, providing spatial and temporal information on a broad range of dynamic processes, including cell migration, replication and vesicular trafficking. Here we describe in detail how to prepare host and fungal cells, and to conduct the video microscopy experiments. These methods can provide a user-guide for future studies with other phagocytes and microorganisms.

We describe methods for live-cell video microscopy of Candida albicans phagocytosis by macrophages. These methods enable stage-specific analysis of macrophage migration, recognition, engulfment and phagosome maturation and reveal novel aspects of phagocytosis.

الخلية الحية المجهرية فيديو البلعمة الممرض الفطرية

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic cells that encounter inhaled fungi and other microbes. Macrophages and other immune cells recognize Aspergillus motifs by pathogen recognition receptors and initiate downstream inflammatory responses. The phagocyte NADPH oxidase generates reactive oxygen intermediates (ROIs) and is critical for host defense. Although NADPH oxidase is critical for neutrophil-mediated host defense1-3, the importance of NADPH oxidase in macrophages is not well defined. The goal of this study was to delineate the specific role of NADPH oxidase in macrophages in mediating host defense against A. fumigatus. We found that NADPH oxidase in alveolar macrophages controls the growth of phagocytosed A. fumigatus spores4. Here, we describe a method for assessing the ability of mouse alveolar macrophages (AMs) to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores (conidia). Alveolar macrophages are stained in vivo and ten days later isolated from mice by bronchoalveolar lavage (BAL). Macrophages are plated onto glass coverslips, then seeded with green fluorescent protein (GFP)-expressing A. fumigatus spores. At specified times, cells are fixed and the number of intact macrophages with phagocytosed spores is assessed by confocal microscopy.

A method to evaluate the ability of isolated mouse alveolar macrophages to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores by confocal microscopy.

تقييم نشاط مضاد للفطريات المعزولة من السنخية الضامة التي كتبها متحد البؤر المجهري

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular interaction that is not clearly understood is non-lytic exocytosis. In this process, yeast cells are released into the extracellular space by a poorly understood mechanism that leaves both the macrophage and Cn viable. Here, we describe how to follow a large number of individually infected macrophages for a 24 hr infection period by time-lapsed microscopy. Infected macrophages are housed in a heating chamber with a CO2 atmosphere attached to a microscope that provides the same conditions as a cell-culture incubator. Live digital microscopy can provide information about the dynamic interactions between a host and pathogen that is not available from static images. Being able to visualize each infected cell can provide clues as to how macrophages handle fungal infections, and vice versa. This technique is a powerful tool in studying the dynamics that are behind a complex phenomenon.

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

We describe how to visualize macrophage-C. neoformans (Cn) interactions in real time, with specific emphasis on the process of non-lytic exocytosis using digital light microscopy. Using this technique individually infected macrophages can be studied to ascertain various aspects of this phenomenon.

تصور الإيماس غير التحللي من<em&gt; الأدعومية المستخفية</em&gt; من الضامة الرقمية الخفيفة عن طريق الميكروسكوب

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular processes. This technique can be used on a variety of cell types, both adherent and non-adherent, to examine a variety of cellular properties. When studying phagocytosis, fluorometric technique utilizes phagocytic cell types such as macrophages, and fluorescently labeled opsonized particles whose fluorescence can be extinguished in the presence of trypan blue. Following plating of adherent macrophages in 96-well plates, fluorescent particles (green or red) are administered and cells are allowed to phagocytose for varied amounts of time. Following internalization of fluorescent particles, cells are washed with trypan blue, which facilitates extinction of fluorescent signal from bacteria which are not internalized, or are merely adhering to the cell surface. Following the trypan wash, cells are washed with PBS, fixed, and stained with DAPI (nuclear blue fluorescent label), which serves to label nuclei of cells. By a simple fluorometric quantification through plate reading of nuclear (blue) or particle (red/green) fluorescence we can examine the ratio of relative fluorescence units of green:blue and determine a phagocytic index indicative of amount of fluorescent bacteria internalized per cell. The duration of assay using a 96-well method and multichannel pipettes for washing, from end of phagocytosis to end of data acquisition, is less than 45 min. Flow cytometry could be used in a similar manner but the advantage of fluorometry is its high throughput, rapid method of assessment with minimal manipulation of samples and quick quantification of fluorescent intensity per cell. Similar strategies can be applied to non adherent cells, live labeled bacteria, actin polymerization, and essentially any process utilizing fluorescence. Therefore, fluorometry is a promising method for its low cost, high throughput capabilities in the study of cellular processes.

Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

تقنية عالية الإنتاجية فلوروميتريك تقييم بلعم البلعمة وأكتين البلمرة

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation of experiments, fresh or frozen monocytes are cultured in flasks for 1 week with M-CSF to induce their differentiation into macrophages. Then, the macrophages can be harvested and seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments. The use of defined numbers of macrophages rather than defined numbers of monocytes to initiate macrophage cultures for experiments yields macrophage cultures in which the desired cell density can be more consistently attained. Use of cryopreserved monocytes reduces dependency on donor availability and produces more homogeneous macrophage cultures.

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. The protocol utilizes cryopreservation of monocytes coupled with their bulk differentiation into macrophages. Then harvested macrophages can then be seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments.

ثقافة الضامة الوحيدات المستمدة-بلعم مستعمرة تحفيز عامل متباينة الإنسان

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of lipids. The function of lipids (e.g., in host-pathogen interactions or host entry) has been reported to play a crucial role in cellular processes. Here, we show a method to determine lipid composition, with a focus on the cholesterol level of primary blood-derived neutrophils, by HPTLC in comparison to high performance liquid chromatography (HPLC). The aim was to investigate the role of lipid/cholesterol alterations in the formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NET release is known as a host defense mechanism to prevent pathogens from spreading within the host. Therefore, blood-derived human neutrophils were treated with methyl-&#946;-cyclodextrin (M&#946;CD) to induce lipid alterations in the cells. Using HPTLC and HPLC, we have shown that M&#946;CD treatment of the cells leads to lipid alterations associated with a significant reduction in the cholesterol content of the cell. At the same time, M&#946;CD treatment of the neutrophils led to the formation of NETs, as shown by immunofluorescence microscopy. In summary, here we present a detailed method to study lipid alterations in neutrophils and the formation of NETs.

Lipids are known to play an important role in cellular functions. Here, we describe a method to determine the lipid composition of neutrophils, with emphasis on the cholesterol level, by using both HPTLC and HPLC to gain a better understanding of the underlying mechanisms of neutrophil extracellular trap formation.

طرق لدراسة الدهون التعديلات في العدلات وتشكيل لاحقة من الفخاخ خارج الخلية العدلات

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution of inflammation. Accumulation of apoptotic debris in the body may trigger chronic inflammatory responses that lead to systemic autoimmune diseases over time. Impaired apoptotic cell clearance has been implicated in a variety of autoimmune diseases. Apoptotic clearance is a complex process rarely detected under physiological conditions. It involves abundant surface receptors and signaling molecules. Studying the process of apoptotic cell clearance provides insightful molecular mechanisms and subsequent biological responses, which may lead to the development of new therapeutics. Here, we describe protocols for the induction of apoptotic thymocytes, the preparation of peritoneal macrophages, and the analysis of apoptotic cell clearance by flow cytometry and microscopy. All cells will undergo apoptosis at a certain stage, and many residential and circulating cells can uptake apoptotic debris. Therefore, the protocol described here can be used in many applications to characterize apoptotic cell binding and ingestion by many other cell types.

Here, we present a protocol to prepare apoptotic thymocytes and peritoneal macrophages and analyze the efficiency of efferocytosis and the specific inhibitor-mediated blocking of apoptotic thymocytes engulfment. This protocol has a broad application in cell-mediated clearance of other particles including artificial beads and bacteria.

التحليل التجريبي لأحاطه الخلايا الشحمية بواسطة الضامة

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution ...

The Effect of Aspirin and Ibuprofen on the Phagocytic Ability of Macrophages

This video showcases a method to assess the impact of aspirin and ibuprofen, at their minimum inhibitory concentrations, on macrophage phagocytosis using pH-sensitive fluorescent dye-stained fungal cells. The drugs inhibit cyclooxygenase-2, decreasing prostaglandin formation and boosting macrophage phagocytosis, as observed through fluorescence measurements of pH-sensitive dye.

تأثير الأسبرين والإيبوبروفين على قدرة البلعمة للبلاعم

1. Safety considerations

	Personnel should use personal protective equipment (PPE).
	Handle the pathogen and macrophages in a Class II Biological safety ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunodiagnostics

Cellular Immunodiagnostics

Effect of Aspirin and Ibuprofen on Phagocytic Ability of Macrophages

Begin with a culture of the murine macrophage cell line, grown in complete RPMI 1640 medium, as described in the text protocol.
Additionally, prepare a culture of Cryptococcus neoformans resuspended in PBS to the desired concentration, as mentioned in the text protocol.&#160;
To stain the cryptococcal cells with the phagocytosis stain, dispense 999 microliters of the cells into a microcentrifuge tube. Add 1 microliter of the stain to the tube. Incubate the cells for 1 hour at room temperature, in the dark, with slow agitation.
After incubation, wash the cells by first centrifugation. Then, discard the supernatant. Resuspend the cells with PBS and repeat the washing step two additional times.
Dispense 100 microliters of the Cryptococcus neoformans cell suspension into the wells of the 96-well plate containing the cultured macrophages.
To study the effect of the test drugs on macrophage phagocytosis, dispense 100 microliters of the desired test drug into appropriate wells of the 96-well plate as described in the text protocol.
Incubate the plate in a carbon dioxide incubator for 2 to 6 hours. At the end of the incubation, measure the fluorescence from the phagocytic stain.

بلعم الكولسترول استنفاد وتأثيره على البلعمة من

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

نضوب وإعادة إعماره الضامة في الفئران

الخلية الحية المجهرية فيديو البلعمة الممرض الفطرية

تقييم نشاط مضاد للفطريات المعزولة من السنخية الضامة التي كتبها متحد البؤر المجهري

تصور الإيماس غير التحللي من

تقنية عالية الإنتاجية فلوروميتريك تقييم بلعم البلعمة وأكتين البلمرة

ثقافة الضامة الوحيدات المستمدة-بلعم مستعمرة تحفيز عامل متباينة الإنسان

طرق لدراسة الدهون التعديلات في العدلات وتشكيل لاحقة من الفخاخ خارج الخلية العدلات

التحليل التجريبي لأحاطه الخلايا الشحمية بواسطة الضامة

تأثير الأسبرين والإيبوبروفين على قدرة البلعمة للبلاعم

تأثير الأسبرين والإيبوبروفين على قدرة البلعمة للبلاعم