The OPPF-UK is funded by the Medical Research Council, UK (grant MR/K018779/1) and the Membrane Protein Laboratory by the Wellcome Trust (grant 099165/Z/12/Z).

<ol>
	<li>Wallin, E., von Heijne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+integral+membrane+proteins+from+eubacterial,+archaean,+and+eukaryotic+organisms.">Genome-wide analysis of integral membrane proteins from eubacterial, archaean, and eukaryotic organisms.</a> Protein Sci. 7 (4), 1029-1038 (1998).</li><li>Fagerberg, L., Jonasson, K., von Heijne, G., Uhlen, M., Berglund, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+the+human+membrane+proteome.">Prediction of the human membrane proteome.</a> Proteomics. 10 (6), 1141-1149 (2010).</li><li>Okada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-Ray+diffraction+analysis+of+three-dimensional+crystals+of+bovine+rhodopsin+obtained+from+mixed+micelles.">X-Ray diffraction analysis of three-dimensional crystals of bovine rhodopsin obtained from mixed micelles.</a> J Struct Biol. 130 (1), 73-80 (2000).</li><li>Palczewski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+rhodopsin:+A+G+protein-coupled+receptor.">Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled receptor.</a> Science. 289 (5480), 739-745 (2000).</li><li>Miroux, B., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over-production+of+proteins+in+Escherichia+coli:+mutant+hosts+that+allow+synthesis+of+some+membrane+proteins+and+globular+proteins+at+high+levels.">Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels.</a> J Mol Biol. 260 (3), 289-298 (1996).</li><li>Wagner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+Escherichia+coli+for+membrane+protein+overexpression.">Tuning Escherichia coli for membrane protein overexpression.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (38), 14371-14376 (2008).</li><li>Schlegel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+membrane+protein+overexpression+in+the+Escherichia+coli+strain+Lemo21(DE3).">Optimizing membrane protein overexpression in the Escherichia coli strain Lemo21(DE3).</a> J Mol Biol. 423 (4), 648-659 (2012).</li><li>Chun, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+partner+toolchest+for+the+stabilization+and+crystallization+of+G+protein-coupled+receptors.">Fusion partner toolchest for the stabilization and crystallization of G protein-coupled receptors.</a> Structure. 20 (6), 967-976 (2012).</li><li>Drew, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP-based+optimization+scheme+for+the+overexpression+and+purification+of+eukaryotic+membrane+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.">GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nat Protoc. 3 (5), 784-798 (2008).</li><li>Drew, D. E., von Heijne, G., Nordlund, P., de Gier, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+an+indicator+to+monitor+membrane+protein+overexpression+in+Escherichia+coli.">Green fluorescent protein as an indicator to monitor membrane protein overexpression in Escherichia coli.</a> FEBS Lett. 507 (2), 220-224 (2001).</li><li>Kawate, T., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography+for+precrystallization+screening+of+integral+membrane+proteins.">Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins.</a> Structure. 14 (4), 673-681 (2006).</li><li>Newstead, S., Kim, H., von Heijne, G., Iwata, S., Drew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+fluorescent-based+optimization+of+eukaryotic+membrane+protein+overexpression+and+purification+in+Saccharomyces+cerevisiae.">High-throughput fluorescent-based optimization of eukaryotic membrane protein overexpression and purification in Saccharomyces cerevisiae.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (35), 13936-13941 (2007).</li><li>Busso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+protein+complexes+using+multiple+Escherichia+coli+protein+co-expression+systems:+a+benchmarking+study.">Expression of protein complexes using multiple Escherichia coli protein co-expression systems: a benchmarking study.</a> J Struct Biol. 175 (2), 159-170 (2011).</li><li>Sonoda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchmarking+membrane+protein+detergent+stability+for+improving+throughput+of+high-resolution+X-ray+structures.">Benchmarking membrane protein detergent stability for improving throughput of high-resolution X-ray structures.</a> Structure. 19 (1), 17-25 (2011).</li><li>Low, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+analytical+gel+filtration+screening+of+integral+membrane+proteins+for+structural+studies.">High-throughput analytical gel filtration screening of integral membrane proteins for structural studies.</a> Biochim Biophys Acta. 1830 (6), 3497-3508 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

في بروتوكول الموضحة في هذه المقالة، يتم الجمع بين ربط الاستنساخ مستقل في ناقلات مراسل GFP مع الكشف عن مضان للكشف بسرعة التعبير النسبي للبروتينات الغشاء متعددة في E. القولونية. ناقلات ويمكن إجراء في أربعة أيام عمل مع الفحص التعبير الأساسي تتخذ أسبوع آخر. في جل يستخدم مضان لست] المنظفات الخلايا بأكملها إلى رتبة التعبير يضرب لمزيد من التحليل في الشاشة الثانوية. الشاشة التعبير الأساسية كما وردت لا يتطلب أي معدات متخصصة وبصرف النظر عن حاضنة شاكر مناسبة للخلايا تنمو في كتل بئر عميقة. جميع مناولة السائل الآخر تنطوي 96-جيدا لوحات SBS يمكن القيام بها باستخدام الماصات متعدد القنوات. بروتوكول يمكن تعديلها بسهولة لتشمل سلالات القولونية E. أخرى نمت في ظل ظروف التعبير المختلفة (مثل انخفاض درجة الحرارة). في حالة LEMO21 (DE3) المعايرة مستوى رامنوز (0-2،0 ملم)وأضاف لتعديل معدل النسخ يمكن أن تزيد من مستوى التعبير عن بعض البروتينات الغشاء 7. المنظفات الأخرى من DDM يمكن أن تستخدم لاستخراج في الشاشة الرئيسية على الرغم من المنظفات أقسى قد ذوبان البروتينات من الهيئات إدراج وبالتالي تعطي ايجابيات كاذبة. ومن الواضح أن أكثر وضع تصبح الشاشة الأولي، والمزيد من التجربة تستغرق وقتا طويلا. ينطوي على الشاشة الثانوية إعداد إجمالي جزء من الغشاء يضرب التعبير المحددة في الشاشة الرئيسية. هذا هو خطوة حاسمة لأنها سوف تأكيد توطين البروتينات الانصهار إلى غشاء من E. خلايا القولونية. ويتم رصد استخراج احق من البروتين GFP الانصهار في المنظفات مختلفة كل مضان الكشف عن حجم الإقصاء اللوني من المواد تذوب لتقييم أحادية التبعثر من المجمعات المنظفات البروتين. هذا هو خطوة حاسمة أخرى نظرا لأنه يحدد المنظفات الأنسب لذوبانية البروتين غشاء لالتجهيز النهائي لاحق. ومع ذلك، تبين التجربة أن المزيد من التحسين من اختيار المنظفات (ق) قد لا تزال هناك حاجة خلال تنقية والتبلور. دليل السلوك موحد في المنظفات المختلفة بما في ذلك تلك التي تحتوي على حجم مذيلة صغير نسبيا (على سبيل المثال LDAO) ويبدو أن مؤشر جيد على الميل لتشكيل جيدا الانعراج بلورات على الأقل للبروتينات غشاء أولية النواة 14. وفي هذا الصدد الشخصى تعرض لبروتين الغشاء في الشكل 2B يبدو مواتية للغاية. والميزة الرئيسية لاستخدام مراسل GFP هو أنه يعطي قراءة التدريجي السريع التعبير في عينات تنقيته الامم المتحدة. والعيب هو أن البروتين GFP الانصهار لابد من إزالتها خلال عملية تنقية البروتين لبلورة. في حالة ناقلات المستخدمة هنا، وهو موقع البروتيني فيروسات الانف 3C تمكن الانقسام من GFP. بدلا من ذلك، فإنه واضح ومباشرلإعادة استنساخ البروتينات مرشح، التي تم تحديدها في الشاشة، إلى ناقلات التي تضيف فقط polyhistidine أو غيرها من العلامة تقارب لتنقية اللاحقة. وهذا يفترض أن الاندماج لGFP ليس من الضروري للتعبير. البديل الرئيسي لاستخدام الانصهار لGFP للكشف عن التعبير بروتين الغشاء والإذابة هو فقط إضافة علامة الحامض الاميني. ولكن هذا النهج يتطلب عادة بدءا من جزء غشاء 15 التي لتقييم العديد من المتغيرات سيصبح جدا تستغرق وقتا طويلا. وباختصار، فإن الغرض الرئيسي من بروتوكول الموضحة في هذه المقالة هو تمكين عدد كبير من تسلسل البروتين غشاء المتغيرات التي سيتم تقييمها بسرعة من حيث التعبير والمنظفات الإذابة والأولوية لتحليل أعمق.

وتشير التقديرات إلى أن البروتينات الغشاء تمثل حوالي 20-30٪ من الجينات المشفرة في جميع الجينوم التسلسل 1، بما في ذلك الجينوم البشري (2). نظرا لدوره الحاسم في العديد من العمليات البيولوجية، لنقل مثلا من نواتج الأيض، وتوليد الطاقة وكأهداف المخدرات، وهناك اهتمام كبير في تحديد هيكل ثلاثي الأبعاد الخاصة بهم. ومع ذلك بالمقارنة مع البروتينات القابلة للذوبان، والبروتينات الغشاء هي غاية ممثلة تمثيلا ناقصا في بنك معلومات البروتين. في الواقع، من 99624 الهياكل صدر في PDB ( <a href="http://www.rcsb.org/pdb/">http://www.rcsb.org/pdb/</a> ) فقط 471 ( <a href="http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/">http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/</a> تصنف)، والبروتينات الغشاء. وهذا يعكس الصعوبات التقنية في العمل مع بروتينات غشاء التي يتم التعبير عنها بشكل طبيعي في مستويات منخفضة نسبيا؛ رودوبسين هي واحدة من عدد قليل من الاستثناءات 3،4. وعلى مدى التعبير عن النسخة المؤتلف<html> الصورة في الخلايا مغاير غالبا ما يؤدي إلى misfolding والفقراء استهداف لغشاء مما يحد من المستوى العام للإنتاج. اختيار أفضل المنظفات لاستخراج والإذابة من بروتين الغشاء مرة واحدة وأعرب يجعل تنقية اللاحقة صعبة وتتطلب التحسين دقيق. لا تزال القولونية المضيف التعبير الأكثر استخداما للبروتينات غشاء يمثل 72٪ ( <a href="http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/">http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/</a> ) هياكل حلها حتى الآن والتي هي على وجه الحصر تقريبا من مصادر بكتيرية. E. محدد سلالات القولونية، C41 (DE3) وC43 (DE3)، وقد تم عزل التي لا تؤدي إلى الإفراط في التعبير عن بروتينات الغشاء، وبالتالي تجنب آثار سمية لوحظ لBL21 آخر سلالات 5،6. ضبط مستوى المؤتلف التعبير البروتين غشاء يبدو أن تكون حاسمة لتحسين مستوى الإنتاج 6،7. &quot;jove_content&quot;&gt; وفي كثير من الحالات قد يتطلب إنتاج الناجح للبروتينات الغشاء لتحديد هيكل تقييم إصدارات متعددة بما في ذلك جذر الأمينو والحذف-كربوكسي المحطة، orthologues متعددة لاستغلال الاختلاف التسلسل الطبيعي والبروتينات الانصهار المختلفة 6-8. لذلك، وهي طريقة لفحص التعبير عن بروتينات الغشاء متعددة في نفس الوقت أمر ضروري. واحد النهج المتبع عادة هو صهر البروتين لبروتين الفلورية الخضراء (GFP) التعبير تمكين لتعقبها دون الحاجة لتنقية البروتين. وبهذه الطريقة، معلومات عن مستوى التعبير والاستقرار والسلوك في المنظفات المختلفة يمكن تقييمها مع كميات صغيرة من المواد النقية الامم المتحدة 9-12. في هذه المقالة وصفنا بروتوكول مبسط للاستنساخ والتعبير فحص بروتينات الغشاء في E. القولونية باستخدام الانصهار لGFP كمراسلة الإنتاج وتوصيف لاحق من المنظفات: البروتين شركاتLEXES (الشكل 1).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pOPIN-N-GFP</td>
			<td>addgene (www.addgene.org)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pOPINE-3C-GFP</td>
			<td>addgene (www.addgene.org)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C41(DE3)pLysS</td>
			<td>Lucigen (http://lucigen.com/</td>
			<td>60444-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEMO21(DE3)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2528H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-Fusion HD EcoDry Cloning System, 96 Rxns</td>
			<td>Clontech/Takara</td>
			<td>639688</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power broth</td>
			<td>Molecular Dimensions (http://www.moleculardimensions.com/)</td>
			<td>MD12-106-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11697498001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, Mini, EDTA-Free; Protease Inhibitor Cocktail&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Rhamnose monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83650</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8849</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse 1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L7651</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol hemisuccinate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6512</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYMAL-6 ( 6-Cyclohexyl-1-Hexyl-&#946;-D-Maltoside)</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C326</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDM ( n-Dodecyl &#223;-maltoside )</td>
			<td>Generon</td>
			<td>D97002</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DM (n-Decyl &#223;-maltoside)</td>
			<td>Generon</td>
			<td>D99003</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDAO ( N,N-Dimethyl-n-dodecylamine N-oxide)</td>
			<td>Generon</td>
			<td>D71111</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E1 ClipTip Eq384 8 channel 1-30 ul&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>4672030</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainin Pipette Pipet-Lite XLS 6ch 100-1200&#181;L LTS Spacer</td>
			<td>Anachem</td>
			<td>LA6-300XLS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainin Pipette Light XLS+ 8ch 2-20&#181;L LTS</td>
			<td>Anachem</td>
			<td>L8-20XLSPLUS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Pipet-Lite XLS 8ch 100-1200&#181;L LTS Tip</td>
			<td>Anachem</td>
			<td>L8-1200XLS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well V bottom deep well blocks</td>
			<td>Porvair sciences</td>
			<td>360115</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenchMark Fluorescent Protein Standard</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>LC5928</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Novex 10% Bis-Tris Midi Protein Gels, 26 well</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>WG1203BOX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell4 SureLock Midi-Cell</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>WR0100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibramax 100</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>544-21200-00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tension rollers attachment</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>549-81000-00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ptima L-100 Ultracentrifuge running 45-Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>393253</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima Max-XP ultracentrifuge running TLA-55 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>393315</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floor standing centrifuge, Avanti J-26S XPI running JA-17 and JS-5.3 rotors&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B14535</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prominence UFLC with RF-20A Fluorescence detector</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sepharose 6 10/300 GL size exclusion column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5172-01&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSI5R-HS SHEL LAB Floor Model Shaking Incubator, 5 Cu.Ft. (144 L), 30-850 RPMs</td>
			<td>Shel Lab&#160;</td>
			<td>SSI5R-HS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Innova44R incubator</td>
			<td>New Brunswick /Eppendorf</td>
			<td>Innova44R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TS SERIES 0.75KW DISRUPTER 230V 50HZ 1PH (40KPSI)</td>
			<td>Constant systems</td>
			<td>PL083016</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Rhamnose monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>83650</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

green fluorescent protein-based expression screening of membrane proteins in escherichia coli

يبقى إنتاج بروتينات الغشاء المؤتلف للدراسات الهيكلية والوظيفية تحديا تقنيا بسبب انخفاض مستويات التعبير وعدم الاستقرار المتأصل في العديد من البروتينات الغشاء يذوب مرة واحدة في المنظفات. ووصف البروتوكول الذي يجمع بين ربط الاستنساخ مستقلة عن بروتينات الغشاء كما اندماج مع GFP التعبير في الإشريكية القولونية الكشف عنها بواسطة GFP مضان. وهذا يتيح للبناء والتعبير فحص متعددة بروتين الغشاء / المتغيرات لتحديد المرشحين المناسبين لمزيد من الاستثمار من الوقت والجهد. يستخدم مراسل GFP في الشاشة الرئيسية التعبير من خلال وضع تصور GFP مضان التالية SDS هلام بولي أكريلاميد الكهربائي (SDS-PAGE). بروتينات غشاء التي تظهر سواء على مستوى التعبير عالية مع الحد الأدنى من التدهور كما يدل على ذلك عدم وجود GFP مجانا ويتم اختيار، على شاشة الثانوية. يتم تحجيم هذه التركيبات ومجموع جزء الغشاء إعداد وذوباند في أربعة المنظفات المختلفة. وبعد تنبيذ فائق لإزالة المواد غير القابلة للذوبان، المنظفات، ويتم تحليل لست] من خلال الكشف مضان استبعاد حجم اللوني (FSEC). رصد الملف الشخصي حجم الإقصاء من قبل GFP مضان يوفر معلومات حول أحادية التبعثر وسلامة بروتينات الغشاء في المنظفات المختلفة. البروتين: تركيبات المنظفات التي أزل مع ذروة متناظرة مع ضئيلة أو معدومة مجانا GFP والحد الأدنى التجميع هي المرشحين لتنقية اللاحقة. باستخدام المنهجية المذكورة أعلاه، والتعبير مغاير في E. تم تحليل القولونية من SED (الشكل، استطالة، وتقسيم، وتبوغ) البروتينات من 47 نوع مختلف من البكتيريا. يكون لهذه البروتينات عادة عشرة المجالات عبر الغشاء وضرورية لانقسام الخلايا. وتظهر النتائج أن إنتاج orthologues عنيزة في E. كان القولونية اختلافا كبيرا فيما يتعلق مستويات التعبير وسلامة البروتينات GFP الانصهار. ط التجربةdentified مجموعة فرعية لمزيد من التحقيق.

الأسرة عنيزة من البروتينات (الشكل، واستطالة، وتقسيم، وتبوغ) ضرورية لانقسام الخلايا البكتيرية. يكون لهذه البروتينات لا يتجزأ عادة عشرة المجالات عبر الغشاء مع كل الأمينية وكربوكسي مصطلحات داخل الخلية. لتجسيد بروتوكول المذكورة أعلاه، تم استنساخ 47 عنيزة orthologues في ناقلات pOPINE-3C-EGFP. وأجري الشاشة الصغيرة التعبير حجم يبني في اثنين E سلالات .coli، Lemo21 (DE3) نمت في وجود 0.25 ملي رامنوز لمنع التعبير المتسرب وC41 (DE3) pLysS، والتي تستخدم بشكل روتيني للتعبير عن غشاء البروتينات 5-8. وقد تم تحليل المنظفات تذوب لست] من الثقافات التي تحدثها الكهربائي SDS-بولكرلميد. باستخدام مضان في جل لتصور أظهرت أعرب GFP البروتينات الانصهار التي تم إنتاجها بين سلالتين 38 من عنيزة يبني 47. ومن المثير للاهتمام كانت هناك اختلافات بين سلالات التعبير اثنين. من 38 أعرب يبني، أنتجت فقط 18 في كل من السلالات، وأعرب 14 فقط في Lemo21 (DE3) و 6 فقط في C41 (DE3) pLysS. وعموما، كان هناك نسبة نجاح أعلى للLemo21 (DE3) مقارنة C41 (DE3) pLysS (38 مقابل 24). ومع ملاحظة أن ظهرت بعض البروتينات لتكون سلالة معينة تعني أن الفرز في كل أمر مفيد. وأظهرت بيانات تمثيلية لل24 من 47 عنيزة يبني في الشكل 1. وكثافة من عصابات يعطي مؤشرا لمستوى التعبير، مثل البروتين الانصهار في C4 جيدا في الشكل 1A و 1B يتم التعبير بشكل جيد في كل سلالات إلا أن إضافية وتشير أقل العصابات الوزن الجزيئي أن البروتين هو المتدهورة جزئيا. في العديد من الممرات وجود الفرقة والتي تتطابق في الحجم إلى GFP وحده. ويمكن إجراء تقييم نوعي لسلامة البروتين من خلال النظر في كثافة البروتين الانصهار نسبة إلى GFP الحرة؛على سبيل المثال G4 وH4 وانهارت تماما لGFP الحرة في C41 (DE3) pLysS (الشكل 1B) في حين أنه في Lemo21 (DE3) هناك بعض سليمة البروتين (الشكل 1A). 14 من أصل 38 البروتينات أعرب عن شدة الفرقة GFP الحرة هي مماثلة لتلك التي من البروتين الانصهار، لمدة 21 شدة الفرقة GFP الحر أكبر من أن البروتين الانصهار وأقلية من البروتينات الانصهار (3 / 38 أعرب) على سبيل المثال F6 وG6 في الشكل 1A يكون قليل نسبيا GFP الحرة مقارنة مع البروتين الانصهار. اثنين من التركيبات التي أعرب جيدا في B5 الشاشة الابتدائي (العصابات كثافة عالية لGFP الحر والبروتينات الانصهار) وG6 (قليلا الحرة GFP) وأعرب عن ومجموع جزء غشاء المعدة من 500 مل ثقافة الخلية. تم تقسيم الأغشية معلق إلى مأخوذة وتحليلها بواسطة-الكشف عن مضان استبعاد حجم اللوني (FSEC). وقدم لمحات FSEC في شملت رقمالبريد 2A و 2B على التوالي، وتبين أن اثنين عنيزة البروتينات تتصرف بشكل مختلف في المنظفات أربعة اختبارها. في حالة واحدة (الشكل 2A: عينة B5) البروتين أعطى فقط ذروة متناظرة مع تجميع يذكر في DDM الذي من شأنه بالتالي أن يكون المنظفات المفضل لتنقية اللاحقة. على النقيض من ذلك الآخر انصهار بروتين (الشكل 2B: عينة G6) أعطى صورة مماثلة في كافة المنظفات التي تم اختبارها. <img alt="الشكل (1)" src="/files/ftp_upload/52357/52357fig1highres.jpg" width="700px" /> الشكل 1: رسم تخطيطي لسير العمل لفحص غشاء البروتين التعبير في E. القولونية باستخدام مراسل GFP. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/52357/52357fig2highres.jpg" /> الشكل 2: شاشة الرئيسي للبروتين الغشاء التعبير باستخدام مضان في جل. </strong&gt; لست] منظفات من E. خلايا القولونية تم تحليلها بواسطة SDS-PAGE والمواد الهلامية تصوير تستخدم برنامج التحصين الموسع الأزرق الإضاءة و530/28 مرشح. وأظهرت نتائج 24 يبني (المسمى A4-H6 على أساس وضعهم في لوحة 96-جيدا). يشار إلى مواقف العصابات لGFP مجاني وGFP البروتينات الانصهار. (A) والبروتينات التي أعرب عنها في Lemo21 (DE3). (ب) البروتينات التي أعرب عنها في C41 (DE3) pLysS. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52357/52357fig3highres.jpg" /> الرقم 3: الشاشة الثانوية من غشاء البروتين التعبير باستخدام-الكشف عن الإسفار استبعاد حجم اللوني (FSEC) تم استخراج مجموع الكسور الغشاء في أربعة المنظفات المختلفة وبروتينات الغشاء تذوب تحليلها بواسطة استبعاد حجم اللوني باستخدام نظام FPLC بالإضافة إلى جهاز الكشف عن مضان. لمحات FSEC ل(A) بروتين الغشاء B5 و (ب) </sترونج&gt; بروتين الغشاء G6. يشار إلى موقف القمم الموافق مجمعة البروتين، ويذوب البروتين GFP الانصهار وGFP مجانا. وأشار المنظفات اختبارها تحت الملامح.

Watch this Scientific Journal Video about Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli at JoVE.com

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

ويرد نهج مبسط لفحص للتعبير عن بروتينات الغشاء المؤتلف في القولونية استنادا إلى الانصهار البروتين الفلوري الأخضر.

الأخضر الفلورسنت القائم على البروتين التعبير فحص غشاء البروتينات في<em&gt; الإشريكية القولونية</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

green-fluorescent-protein-based-expression-screening-membrane

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

32.6K Views.  Research Complex at Harwell.  ويرد نهج مبسط لفحص للتعبير عن بروتينات الغشاء المؤتلف في القولونية استنادا إلى الانصهار البروتين الفلوري الأخضر. 

Video: Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

تلطيخ من البروتينات في الهلام مع Coomassie G - 250 دون عضوي حمض الخليك والمذيبات

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme acid stresses including passage through the mammalian stomach where the pH can fall to as low as pH 1 - 22. To enable such a broad range of acidic pH survival, E. coli possesses four different inducible amino acid decarboxylases that decarboxylate their substrate amino acids in a proton-dependent manner thus raising the internal pH. The decarboxylases include the glutamic acid decarboxylases GadA and GadB3, the arginine decarboxylase AdiA4, the lysine decarboxylase LdcI5, 6 and the ornithine decarboxylase SpeF7. All of these enzymes utilize pyridoxal-5'-phospate as a co-factor8 and function together with inner-membrane substrate-product antiporters that remove decarboxylation products to the external medium in exchange for fresh substrate2. In the case of LdcI, the lysine-cadaverine antiporter is called CadB. Recently, we determined the X-ray crystal structure of LdcI to 2.0 &#197;, and we discovered a novel small-molecule bound to LdcI the stringent response regulator guanosine 5'-diphosphate,3'-diphosphate (ppGpp) 14. The stringent response occurs when exponentially growing cells experience nutrient deprivation or one of a number of other stresses9. As a result, cells produce ppGpp which leads to a signaling cascade culminating in the shift from exponential growth to stationary phase growth10. We have demonstrated that ppGpp is a specific inhibitor of LdcI 14. Here we describe the lysine decarboxylase assay, modified from the assay developed by Phan et al.11, that we have used to determine the activity of LdcI and the effect of pppGpp/ppGpp on that activity. The LdcI decarboxylation reaction removes the &alpha;-carboxy group of L-lysine and produces carbon dioxide and the polyamine cadaverine (1,5-diaminopentane)5. L-lysine and cadaverine can be reacted with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid (TNBS) at high pH to generate N,N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) and N,N&#8242;-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine), respectively11. The TNP-cadaverine can be separated from the TNP-lysine as the former is soluble in organic solvents such as toluene while the latter is not (See Figure 1). The linear range of the assay was determined empirically using purified cadaverine.

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

The activity of the inducible lysine decarboxylase is monitored by reacting the substrate L-lysine and the product cadaverine with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid to form adducts that have differential solubility in toluene.

على الفحص لقياس نشاط القولونية محرض يسين Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

بلورة البروتينات في الغشاء Mesophases Lipidic

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

ارتفاع المناولة فحص النشاط Endoglucanase الفطرية في القولونية</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

استخدام روبوت لارتفاع الإنتاجية البلورة من بروتينات الغشاء في Mesophases شحمي

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

حيوي داخلي المجهري للهياكل التصوير التحت خلوية في الفئران لايف تعرب عن البروتينات الفلورية

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has become the method of choice for introducing DNA into prokaryotes that are not naturally competent. Electroporation is a rapid, efficient, and streamlined transformation method that, in addition to purified DNA and competent bacteria, requires commercially available gene pulse controller and cuvettes. In contrast to the pulsing step, preparation of electrocompetent cells is time consuming and labor intensive involving repeated rounds of centrifugation and washes in decreasing volumes of sterile, cold water, or non-ionic buffers of large volumes of cultures grown to mid-logarithmic phase of growth. Time and effort can be saved by purchasing electrocompetent cells from commercial sources, but the selection is limited to commonly employed E. coli laboratory strains. We are hereby disseminating a rapid and efficient method for preparing electrocompetent E. coli, which has been in use by bacteriology laboratories for some time, can be adapted to V. cholerae and other prokaryotes. While we cannot ascertain whom to credit for developing the original technique, we are hereby making it available to the scientific community.

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation is a commonly employed method for introducing DNA into bacteria in a process known as transformation. Traditional protocols for the preparation of electrocompetent cells are time consuming and labor intensive. This article describes an alternate, rapid, and efficient method for the preparation of electrocompetent cells presently employed by some laboratories.

بروتوكول السريع لإعداد Electrocompetent<em&gt; كولاي</em&gt; و<em&gt; ضمة الكوليرا</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for expressing proteins and genetic circuits in a controlled manner as well as for providing a prototyping environment for synthetic biology.2,3 To achieve the latter goal, cell-free expression systems that preserve endogenous Escherichia coli transcription-translation mechanisms are able to more accurately reflect in vivo cellular dynamics than those based on T7 RNA polymerase transcription. We describe the preparation and execution of an efficient endogenous E. coli based transcription-translation (TX-TL) cell-free expression system that can produce equivalent amounts of protein as T7-based systems at a 98% cost reduction to similar commercial systems.4,5 The preparation of buffers and crude cell extract are described, as well as the execution of a three tube TX-TL reaction. The entire protocol takes five days to prepare and yields enough material for up to 3000 single reactions in one preparation. Once prepared, each reaction takes under 8 hr from setup to data collection and analysis. Mechanisms of regulation and transcription exogenous to E. coli, such as lac/tet repressors and T7 RNA polymerase, can be supplemented.6 Endogenous properties, such as mRNA and DNA degradation rates, can also be adjusted.7 The TX-TL cell-free expression system has been demonstrated for large-scale circuit assembly, exploring biological phenomena, and expression of proteins under both T7- and endogenous promoters.6,8 Accompanying mathematical models are available.9,10 The resulting system has unique applications in synthetic biology as a prototyping environment, or "TX-TL biomolecular breadboard."

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

This five-day protocol outlines all steps, equipment, and supplemental software necessary for creating and running an efficient endogenous Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system from scratch. With reagents, the protocol takes 8 hours or less to setup a reaction, collect, and process data.

بروتوكولات لتنفيذ و<em&gt; كولاي</em&gt; وبناء خلية الحرة TX-TL نظام التعبير عن علم الأحياء الاصطناعية

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

الكشف عن لايف<em&gt; كولاي</em&gt; O157: H7 من قبل خلايا PMA-QPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

عالية الإنتاجية التعبير الكمي فحص وتنقية تطبق على المؤتلف ثاني كبريتيد الغنية البروتينات السم المنتجة في<em&gt; E. القولونية</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

الأخضر الفلورسنت القائم على البروتين التعبير فحص غشاء البروتينات في

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

تلطيخ من البروتينات في الهلام مع Coomassie G - 250 دون عضوي حمض الخليك والمذيبات

على الفحص لقياس نشاط القولونية محرض يسين Decarboxyase

بلورة البروتينات في الغشاء Mesophases Lipidic

ارتفاع المناولة فحص النشاط Endoglucanase الفطرية في القولونية

استخدام روبوت لارتفاع الإنتاجية البلورة من بروتينات الغشاء في Mesophases شحمي

حيوي داخلي المجهري للهياكل التصوير التحت خلوية في الفئران لايف تعرب عن البروتينات الفلورية

بروتوكول السريع لإعداد Electrocompetent

بروتوكولات لتنفيذ و

الكشف عن لايف

عالية الإنتاجية التعبير الكمي فحص وتنقية تطبق على المؤتلف ثاني كبريتيد الغنية البروتينات السم المنتجة في