فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور لويس Reichardt للفئران TrkA taulacZ والدكتور أنيت ماركوس للمناقشة والاقتراحات الثاقبة. وأيد هذا العمل من جانب صناديق بدء التشغيل من مؤسسة بيرك وكذلك مؤسسة وايت هول منحة بحثية 2010-08-61، منحة بحثية من أجنحة لمؤسسة الحياة (WFL-US-028/14)، منح ZB1-1102-1 من كريستوفر ودانا ريف مؤسسة، والمنح 1R01EY022409 و3R01EY022409-01S1 من المعهد الوطني للعيون، لJZ. عمليات الخفجي المشتركة هو زميل جولدسميث.

ملاحظة: جميع إجراءات تتوافق مع دليل المعاهد الوطنية للصحة لاستخدام ورعاية الحيوانات المختبرية. وتمت الموافقة على بروتوكول الحيوان من قبل IACUC في كلية ويل كورنيل الطبية. 1. إعداد الأنسجة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الإناث توقيت الحمل خلع عنق الرحم 15. تشريح الجنينية E16 - E18 الأجنة من الإناث توقيت الحمل والأجنة مكان فردي في الآبار من صحن 6 جيدا، مليئة المالحة الفوسفات البارد مخزنة (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الأجنة في برنامج تلفزيوني الباردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة جزء صغير من الغشاء الذي يحيط بالجنين من الجنين ووضعه في حل بروتين K معدة سلفا لالتنميط الجيني لاحق. بدلا من ذلك، في حالة فقدان الغشاء الذي يحيط بالجنين، وإزالة جزء صغير من طرف الذيل الجنين ووضعه في بروتين K الحل </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كزة ثقوب في الجلد في جميع أنحاء الجنين باستخدام دبابيس الحشرات (100 لكل جانب على الأقل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة ببطء الطازجة بارافورمالدهيد 2٪ (PFA)،الرقم الهيدروجيني 7.4، إلى البئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يهز بلطف لمدة 2 ساعة في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الأجنة مرتين في برنامج تلفزيوني وتخزينها في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية حتى تلطيخ. </li></ol> 2. التنميط الجيني <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج الأغشية الذي يحيط بالجنين أو ذيول الجنين في بروتين K الخليط وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند 56 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخراج الحمض النووي باستخدام المتاحة تجاريا طقم تنقية الحمض النووي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خذ 0.5 ميكرولتر من إجمالي 200 ميكرولتر تنقيته حل الحمض النووي الجيني، والجمع بين ذلك مع 0.5 ميكرولتر من كل من الإحساس والعقاقير الاشعال الجينات المحددة (10 ميكرومتر)، 2 ميكرولتر dNTP ميكس (2.5 ملم من dATP، dCTP، dGTP وdTTP) ، 0.2 ميكرولتر بوليميريز طق (5 U / ميكرولتر) و 2 ميكرولتر PCR عازلة (10X)، إضافة H 2 O إلى الحجم الكلي لل20 ميكرولتر. ملاحظة: تسلسل التمهيدي هي كما يلي (الجدول 1): TrkA: TrkA_F: GCG GGC دول مجلس التعاون الخليجي GCC GCG ATG، TrkA_R: غا دول مجلس التعاون الخليجي TGC دول مجلس التعاون الخليجي GCG GCT CTG CCA GGG TG. PCR سفر و السياحةطول منة: 400 basepairs (بي بي). باكس: In5R: GTT GAC CAG AGT GGC GTA GG، Ex5F: TGA TCA غا CCA TCA TG، NeoR: CCG CTT CCA TTG CTC AGC GG. PCR أطوال شظية: النوع البري، 304 سنة مضت. باكس اغية، 507 سنة مضت. TauLacZ: lacZup: ACA ACG TCG TGA GTG GGA AAA، lacZdown: ATC AAC ATT AAA TGT GAG CGA G. PCR طول القطعة: 360 نقطة أساس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل PCR مع البرنامج التالي للTrkA: خطوة 1: 1 دقيقة في 95 ° C، خطوة 2: 10 ثانية في 95 درجة مئوية، الخطوة 3: 20 ثانية عند 68 ° C، الخطوة 4: 30 ثانية عند 72 ° C. كرر الخطوات من 2 - 4 لصالح 40 دورة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لLacZ وباكس، تشغيل PCR مع البرنامج التالي: خطوة 1: 1 دقيقة في 95 ° C، خطوة 2: 10 ثانية في 95 درجة مئوية، الخطوة 3: 1 دقيقة في 54 ° C، الخطوة 4: 1 دقيقة في 72 ° C، كرر الخطوات من 2 - 4 لصالح 35 دورات. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات تشغيل PCR على هلام الاغاروز 2٪ عند 100 V في المخزن 1X تريس، خلات-EDTA لمدة 20 دقيقة مع حارة من سلم DNA لتقييم أطوال شظية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل الأجنة لوجود نوع البرية TrkA، TRKA-tauLacZ وباكس الأليلات فارغة. التراكيب الوراثية للأجنة التجريبية هي TrkA taulacZ / WT: باكس - / - وTrkA taulacZ / taulacZ: باكس - / -، اعتمادا على الأسئلة التجريبية. سوف الأجنة التي تفتقر إلى مراسل tauLacZ تكون سلبية لمحواري تلطيخ، وبالتالي يمكن أن تخدم ضوابط السلبية لمعايرة عملية تلطيخ. </li></ol> 3. الأجنة تلطيخ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مجموعة تجارية لتلطيخ lacZ مع بعض التعديلات كما هو موضح أدناه في أقسام 3،2-3،8. هنا، استخدام عدة ميليبور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج الأجنة في الواق A لا يقل عن 1 ساعة، والهز برفق في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج مباشرة الأجنة في B الاحتياطي لمدة 15 دقيقة على الأقل، والهز برفق في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بينما الأجنة في الواق A / B، قبل دافئ حل الأنسجة قاعدة عند 37 درجة مئوية. استخدام 5 مل من محلول الأنسجة قاعدة في الجنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بينما الأجنة في الواق A / B، وإعداد الطازجة 5 رomo- 4- اللون الأخضر 3- indolyl α-D-galactopyranoside (X-غال) بتركيز 40 ملغ / مل في 100٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع X-غال في حل الأنسجة قاعدة قبل تحسنت بتركيز 1 ملغ / مل وإضافة 5 مل من X-غال / الأنسجة خليط قاعدة لقارورة زجاجية التلألؤ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأجنة إلى قارورة زجاجية تحتوي على التلألؤ X-غال / الأنسجة خليط قاعدة. ختم غطاء مع بارافيلم واحتضان عند 37 درجة مئوية خلال الليل، والتحقق من وجود وصمة عار الزرقاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأجنة بوستفيكس مع طازجة 4٪ PFA، ودرجة الحموضة 7.4. يهز بلطف لمدة 4 ساعة عند 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الأجنة مرتين في برنامج تلفزيوني الباردة. </li></ol> 4. الأنسجة الجفاف والمقاصة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الأجنة في 50٪ الميثانول / 50٪ PBS الخليط لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، والهز في قوارير زجاجية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مواصلة يذوى في 75٪ الميثانول PBS / 25٪ لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، والهز في قوارير الزجاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مواصلة يذوى في 90٪ الميثانول / 10٪ PBS لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، والهز في قوارير الزجاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مواصلة يذوى في الميثانول بنسبة 100٪ لمدة 30 دقيقة (2X) في درجة حرارة الغرفة، والهز في قوارير الزجاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بينما الأجنة والتجفيف، وإعداد 1: 1 (ت: ت) خليط من الكحول بيروكسايد وبيروكسايد بنزوات. ملاحظة: الكحول البنزويل بيروكسايد بنزوات وسامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج الأجنة في 1: 1 (ت: ت) خليط من الميثانول بنسبة 100٪: BABB 100٪ لمدة 15 دقيقة. فقط استخدام الزجاج لأن BABB سوف تذوب البلاستيك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج الأجنة في 100٪ BABB لواضحة تماما في الأنسجة وتصور X-غال تلطيخ في الجنين مسح. ملاحظة: صورة في أقرب وقت ممكن لأن وصمة عار X-غال سوف تتلاشى مع مرور الوقت. </li></ol> 5. الجامع جبل التصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استقرار الجنين، منغمسين في 100٪ BABB، في الزوايا المناسبة للتصوير باستخدام ملقط معدني. إلقاء الضوء باستخدام مزيج من يصل الضوء وتحت ضوء ضوء المصادر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على صور مع المجهر تشريحتجهيزه مع كاميرا رقمية. خذ متعددة التعرض الحقل مشرق في خمس طائرات التنسيق متتالية 0.5 مم وبصرف النظر على طول محور Z. قد تختلف الأوقات التعرض وتوقف F-وفقا لإضاءة وكاميرا المواصفات وتحتاج إلى أن يكون الأمثل لكل الإعداد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام معيار برامج معالجة الصور لمعالجة الصور تراكب وتوليد الصور المركبة. </li></ol>

<ol>
	<li>Verze, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutaneous+innervation+in+hereditary+sensory+and+autonomic+neuropathy+type+IV.">Cutaneous innervation in hereditary sensory and autonomic neuropathy type IV.</a> Neurology. 55, 126-128 (2000).</li><li>Sethna, N. F., Meier, P. M., Zurakowski, D., Berde, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutaneous+sensory+abnormalities+in+children+and+adolescents+with+complex+regional+pain+syndromes.">Cutaneous sensory abnormalities in children and adolescents with complex regional pain syndromes.</a> Pain. 131, 153-161 (2007).</li><li>Uceyler, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+fibers+in+Fabry+disease:+baseline+and+follow-up+data+under+enzyme+replacement+therapy.">Small fibers in Fabry disease: baseline and follow-up data under enzyme replacement therapy.</a> J Peripher Nerv Syst. 16, 304-314 (2011).</li><li>Reichardt, L. F., Mobley, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Going+the+distance,+or+not,+with+neurotrophin+signals.">Going the distance, or not, with neurotrophin signals.</a> Cell. 118, 141-143 (2004).</li><li>White, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronous+onset+of+NGF+and+TrkA+survival+dependence+in+developing+dorsal+root+ganglia.">Synchronous onset of NGF and TrkA survival dependence in developing dorsal root ganglia.</a> J Neurosci. 16, 4662-4672 (1996).</li><li>Farinas, I., Wilkinson, G. A., Backus, C., Reichardt, L. F., Patapoutian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+neurotrophin+and+Trk+receptor+functions+in+developing+sensory+ganglia:+direct+NT-3+activation+of+TrkB+neurons+in+vivo.">Characterization of neurotrophin and Trk receptor functions in developing sensory ganglia: direct NT-3 activation of TrkB neurons in vivo.</a> Neuron. 21, 325-334 (1998).</li><li>Markus, A., Zhong, J., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raf+and+akt+mediate+distinct+aspects+of+sensory+axon+growth.">Raf and akt mediate distinct aspects of sensory axon growth.</a> Neuron. 35, 65-76 (2002).</li><li>Kuruvilla, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neurotrophin+signaling+cascade+coordinates+sympathetic+neuron+development+through+differential+control+of+TrkA+trafficking+and+retrograde+signaling.">A neurotrophin signaling cascade coordinates sympathetic neuron development through differential control of TrkA trafficking and retrograde signaling.</a> Cell. 118, 243-255 (2004).</li><li>Zhong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raf+kinase+signaling+functions+in+sensory+neuron+differentiation+and+axon+growth+in+vivo.">Raf kinase signaling functions in sensory neuron differentiation and axon growth in vivo.</a> Nature. 10, 598-607 (2007).</li><li>Bulfone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+olfactory+sensory+map+develops+in+the+absence+of+normal+projection+neurons+or+GABAergic+interneurons.">An olfactory sensory map develops in the absence of normal projection neurons or GABAergic interneurons.</a> Neuron. 21, 1273-1282 (1998).</li><li>Moqrich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expressing+TrkC+from+the+TrkA+locus+causes+a+subset+of+dorsal+root+ganglia+neurons+to+switch+fate.">Expressing TrkC from the TrkA locus causes a subset of dorsal root ganglia neurons to switch fate.</a> Nature. 7, 812-818 (2004).</li><li>Knudson, C. M., Tung, K. S., Tourtellotte, W. G., Brown, G. A., Korsmeyer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bax-deficient+mice+with+lymphoid+hyperplasia+and+male+germ+cell+death.">Bax-deficient mice with lymphoid hyperplasia and male germ cell death.</a> Science. 270 (5233), 96-99 (1995).</li><li>Lentz, S. I., Knudson, C. M., Korsmeyer, S. J., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophins+support+the+development+of+diverse+sensory+axon+morphologies.">Neurotrophins support the development of diverse sensory axon morphologies.</a> J. Neurosci. 19, 1038-1048 (1999).</li><li>Patel, T. D., Jackman, A., Rice, F. L., Kucera, J., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+sensory+neurons+in+the+absence+of+NGF/TrkA+signaling+in+vivo.">Development of sensory neurons in the absence of NGF/TrkA signaling in vivo.</a> Neuron. 25, 345-357 (2000).</li><li>Donovan, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-RAF+kinase+drives+developmental+axon+growth+and+promotes+axon+regeneration+in+the+injured+mature+CNS.">B-RAF kinase drives developmental axon growth and promotes axon regeneration in the injured mature CNS.</a> The Journal of experimental medicine. 211, 801-814 (2014).</li><li>Mercer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+endogenous+oncogenic+V600EB-raf+induces+proliferation+and+developmental+defects+in+mice+and+transformation+of+primary+fibroblasts.">Expression of endogenous oncogenic V600EB-raf induces proliferation and developmental defects in mice and transformation of primary fibroblasts.</a> Cancer research. 65, 11493-11500 (2005).</li><li>Tronche, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+glucocorticoid+receptor+gene+in+the+nervous+system+results+in+reduced+anxiety.">Disruption of the glucocorticoid receptor gene in the nervous system results in reduced anxiety.</a> Nature genetics. 23, 99-103 (1999).</li><li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolbox+of+Cre-dependent+optogenetic+transgenic+mice+for+light-induced+activation+and+silencing.">A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing.</a> Nat Neurosci. 15, 793-802 (2012).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Neuronal+Subsets+in+Transgenic+Mice+Expressing+Multiple+Spectral+Variants+of+GFP.">Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Schmidt, H., Rathjen, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DiI-labeling+of+DRG+neurons+to+study+axonal+branching+in+a+whole+mount+preparation+of+mouse+embryonic+spinal+cord.">DiI-labeling of DRG neurons to study axonal branching in a whole mount preparation of mouse embryonic spinal cord.</a> J Vis Exp. , (2011).</li></ol>

The authors declare that there are no competing interests.

الإجراء المبين أعلاه تلطيخ X-غال من الفئران الجنينية TrkA taulacZ يسمح لتصور سريع ومفصل من التوقعات محور عصبي لمسافات طويلة في الجنين ثابتة على حالها. بسبب الخلفية فارغة باكس هذه الفئران تسمح للتحقق من الإشارات الآليات التي يمكن أن تسهم في نمو كل من محور عصبي وبقاء الخلايا العصبية. التزاوج مع المعدلة وراثيا أو خروج المغلوب الفئران التي تهم يسمح لتقييم شامل من الظواهر محور عصبي ويمكن أن تكون دليلا مفيدا بالنسبة للتجارب المستقبلية لدراسة الإشارات النمو محوار بطريقة أكثر تفصيلا. ويتمثل التحدي الرئيسي في الجسم الحي محور عصبي دراسات النمو هو الوقت للتحضير الأنسجة أقسام وتقييم الظواهر المعقدة من المحاور المتزايدة التي قد تتأثر بطرق متعددة عن طريق أي تلاعب الجيني واحد. وTrkA taulacZ / taulacZ: باكس - / - خط يمكن تقييم الآثار الكاملة لجينالفائدة على الطرفية تطوير مستقبلة الأذية محور عصبي. وهذه التقنية تقتصر على تصور مستقبلة الأذية مسارات محواري التي عادة التعبير عن TrkA خلال مراحل النمو المبكرة. وبالإضافة إلى nociceptors الطرفية، فإنه قد يكون من الممكن تصور توقعات الدماغ الأمامي الكوليني متعاطفة والقاعدية. ولكن هذا يتطلب التحسين محدد من تقنيات تلطيخ المقاصة النسيج هو خطوة رئيسية من البروتوكول هو موضح هنا. فإنه يمكن تقييم مفصل للتوقعات الكذب أعمق في الأعمال التحضيرية جبل بأكملها، وبالتالي تحديد المحتملين من الظواهر متميزة. للصحفيين الفلورسنت، مثل TdTomato أو صحفيين GFP 18،19، أن تعرض الوضوح البصري في ظل ظروف معينة، ومع ذلك فإنه من الصعب الحصول على كامل جبل صورة لأننا وجدنا أنه في المقابل إلى تلطيخ X-غال، وإشارات الفلورسنت تتلاشى بشكل كبير خلال إجراء المقاصة الأنسجة. صلاح الغيدانكما انها تستخدم على نطاق واسع تلطيخ لوضع العلامات محور عصبي 20؛ عيوبه هي أنه لا يمكن تسمية انتقائي نوع فرعي معين من المحاور مثل الألياف مستقبلة الأذية هنا، وأنه من الصعب أن يعلم تماما مسارات طويلة في المحيط. وخلاصة القول، ونحن نقدم البروتوكول الذي يستخدم مزيج من اثنين من خطوط الماوس المعدلة وراثيا للسماح التصور الروتيني للالعرش كاملة من المحاور مسبب للألم في جنين الفأر.

إنشاء شبكات الخلايا العصبية الدقيقة هي عملية التنموية المعقدة ضرورية لوظائف الجهاز العصبي. اضطراب في هذه العملية يؤدي إلى اختلال الوظائف العصبية التي تورطت في الأمراض العصبية الإنسان 1-3. لدراسة الآليات الجزيئية الكامنة وراء نمو محور عصبي وتعصيب المستهدفة في الثدييات، وقد وضعنا بروتوكولا لتصور مسارات محور عصبي من TrkA، معربا عن الخلايا العصبية الحسية باستخدام مزيج من اثنين من خطوط الماوس المعدلة وراثيا. TrkA هو مستقبلات لعامل نمو الأعصاب NGF، وهو علامة وظيفية من الخلايا العصبية الحسية مسبب للألم 4. وأعرب عن TrkA غاية في الخلايا العصبية مسبب للألم خلال التنمية في وقت مبكر ويتوسط بقاء الخلايا العصبية التي تعتمد على NGF، والنمو محور عصبي، تشجر والهدف تعصيب 5-9. في الفئران TrkA taulacZ، يتم استبدال البرية نوع الجينات TrkA من قبل taulacZ التعبير جassette 10، على ان يكون التشكل محور عصبي من الخلايا العصبية-TrkA الإيجابية المفترضة يمكن تصور كتبها β-غال (X-غال) تلطيخ 11. باستخدام سطر TrkA taulacZ / WT متخالف، يمكننا دراسة العوامل التي قد تتداخل مع تنظيم أو تطوير التوقعات وارد الحسية في الجسم الحي. وعلاوة على ذلك، TrkA التعبير غائبة في الفئران متماثلة اللواقح TrkA taulacZ / taulacZ، والتي يمكن بالتالي استخدامها لتقييم نمو محور عصبي تعزيز آليات في غياب NGF / TrkA الإشارات. منذ الخلايا العصبية مسبب للألم تعتمد على NGF / TrkA يشير ليس فقط للنمو محور عصبي، ولكن أيضا من أجل البقاء، ونحن توظيف خط الماوس آخر، تفتقر إلى الجين باكس المؤيد لأفكارك، لمنع موت الخلايا المبرمج في الخلايا العصبية DRG الجنينية، إنقاذهم من موت الخلايا التي هي على خلاف ذلك لوحظ في غياب TrkA الإشارات. وباكس - / - 12 الخلفية مما يسمح للmolecuتشريح لار من مسارات الإشارات التي تؤثر على وجه التحديد 7-9،13-15 نمو محور عصبي. في TrkA - / -: باكس - / - الفئران، والخلايا العصبية DRG البقاء على قيد الحياة، ولكن الحسي تعصيب وارد في الجلد وألغيت تماما 14،15. يمكننا تفعيل انتقائي مسارات إشارات لتحديد مساهماتها في تطوير التوقعات محور عصبي. فائدة هذه الطريقة هي أنها تسمح للتقييم التغيرات في الظواهر نمو محور عصبي عندما تربى تعديلات وراثية مختلفة على TrkA taulacZ / taulacZ: باكس - / - أو TrkA taulacZ / WT: باكس - / - الخلفيات.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="465">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;"></td>
			<td style="width:127px;">Company</td>
			<td style="width:139px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PFA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6418</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Life Tech</td>
			<td>10010-023</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Rinse Solution A</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>BG-6-B</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Rinse Solution B</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>BG-7-B</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Stain Base Solution</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>BG-8-C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-gal&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4252</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass scintiallation vial</td>
			<td>Kimble Chase</td>
			<td>74500-20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator</td>
			<td>Labline</td>
			<td>Model 120</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insect pins</td>
			<td>FST</td>
			<td>26000-30</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6 well dish</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>CC7672-7506</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td>custom DNA primers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Takara dNTP mixture</td>
			<td>Takara</td>
			<td>4030</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Takara LA buffer</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR002A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Takara LA Taq</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR002A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR machine</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>DNA Engine Dyad</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Benzyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B-1042</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Benzyl benzoate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B-6630</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M205A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC310FX</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ring light&#160;</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>MEB110</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Photoshop</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>Photoshop 4.0</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-mount imaging of mouse embryo sensory axon projections

تصور كامل طول التوقعات العصبية في الأجنة أمر ضروري للحصول على فهم كيفية تطور الثدييات الشبكات العصبية. نحن هنا تصف طريقة لتسمية في الموقع مجموعة فرعية من عقدة الجذر الظهري (DRG) التوقعات محور عصبي لتقييم خصائصها المظهرية باستخدام عدة خطوط الماوس التلاعب بها وراثيا. الخلايا العصبية-TrkA الإيجابية هي الخلايا العصبية مستقبلة الأذية، مخصصة لنقل إشارات الألم. نحن نستخدم خط الماوس TrkA taulacZ لتسمية مسارات كافة محاور الطرفية-TrkA إيجابي في جنين الفأر سليمة. نحن أبعد تولد خط TrkA taulacZ على خلفية فارغة باكس، الذي يلغي أساسا موت الخلايا المبرمج العصبية، من أجل تقييم الأسئلة المتعلقة النمو بشكل مستقل عن الآثار المحتملة للالتلاعب الجيني على بقاء الخلايا العصبية. وفي وقت لاحق، هي ولدت الفئران المعدلة وراثيا في المصالح مع TrkA taulACZ / باكس خط باطل ونحن على استعداد لدراسة باستخدام التقنيات الموصوفة هنا ثم. ويشمل هذا العرض معلومات مفصلة عن خطط تربية الماوس، التنميط الجيني في وقت تشريح، وإعداد الأنسجة، وتلطيخ والمقاصة للسماح لرؤية كامل طول مسارات محور عصبي في إعداد كامل جبل.

التراكيب الوراثية من TrkA WT / taulacZ: باكس - / - وTrkA taulacZ / taulacZ: باكس - / - الأجنة يمكن تحديد بشكل لا لبس فيه من قبل ستاندرد PCR التنميط الجيني (الشكل 1). يعرض تلطيخ X-غال بالتفصيل العرش محور عصبي المحيطية تحت الجلد في الأجنة الملون تقليدية (أرقام 2، 3A)، وطوال الجنين بعد تطهير الأنسجة (أرقام 3B، 4). لقد ولدت في TrkA WT / taulacZ: باكس - / - تمشيا مع الفئران التي تحمل جوهري تنشيط كيناز B-RAF (V600E) الطفرة (LSL-kaBraf 16) تحت السيطرة من الخلايا العصبية محددة nestin المروج 17، للحصول على LSL- kaBraf: TrkA taulacZ / taulacZ: باكس - / - الفئران. في هذه الأجنة، والتي تفتقر تماما TrkA الإشارات، مورفولوجية مستقبلة الأذية التوقعات الطرفية مع ذلك وضعت تقريبا عادة (الشكل 4). هذا التظاهرسا وظيفة حاسمة لB-RAF مما يشير إلى نمو محور عصبي محيطي، وأيضا يدل على أن البقاء على قيد الحياة ومحور عصبي النمو وتعزيز وظائف TrkA إشارات يمكن فصلها، مع باكس - / - الخلفية الوراثية تستعيض عن فقدان بقاء TrkA التي تعتمد على الإشارات . <img alt="الشكل (1)" src="/files/ftp_upload/52212/52212fig1highres.jpg" /> الشكل 1: انماط من الفئران المعدلة وراثيا الصور هلام الاغاروز التمثيلية. عينة 1: TrkA WT / taulacZ: باكس WT / -، عينة 2: TrkA taulacZ / taulacZ: باكس - / -، عينة 3: TrkA WT / taulacZ: باكس - / -. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/52212/52212fig2highres.jpg" /> الشكل 2: E18.5 TrkA WT / taulacZ الماوس ملطخة X-غال توقعات أكسون من العقد مثلث التوائم في الجذع وهيئة التعليم العالي.وترد د في الجنين المزالة. شريط الحجم: 1 مم. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52212/52212fig3highres.jpg" /> وتظهر E18.5 TrkA WT / taulacZ الماوس ملطخة X-غال (A) قبل و(B) بعد تطهير مع BABB التوقعات من DRGs في منتصف الجذع: الرقم 3. شريط مقياس: 2 مم. <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/52212/52212fig4highres.jpg" /> الشكل (4): وE16.5 LSL-kaBraf: TrkA taulacZ / taulacZ: باكس - / -:. nestin-لجنة المساواة العرقية جنين الفأر ملطخة X-غال وتطهيرها مع BABB kaBraf بترميز كيناز تفعيلها B-RAF بروتين كيناز، B-RAF V600E. أدى التعبير عن KAB-RAF في الخلايا العصبية DRG في كامل طول، على مقربة من تمديد محور عصبي طبيعي في غياب TrkA الإشارات. شريط الحجم: 1 مم. للمزيد من الصور بما في ذلك الضوابط، انظر المرجع. 15، الشكل2. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td colspan="2"> الاشعال تستخدم لPCR التنميط الجيني </td></tr><tr><td rowspan="3"> 1 </td><td> TrkA </td><td> حجم جزء DNA: 400 شركة بريتيش بتروليوم </td></tr><tr><td> TrkA_F </td><td> GCG GGC دول مجلس التعاون الخليجي GCC GCG ATG </td></tr><tr><td> TrkA_R </td><td> غا دول مجلس التعاون الخليجي GCC TGC GCG GCT CTG CCA GGG TG </td></tr><tr><td rowspan="4"> 2 </td><td> باكس </td><td> حجم جزء DNA: 304 سنة مضت (النوع البري)، 507 سنة مضت (باكس خالية) </td></tr><tr><td> In5R </td><td> GTT GAC CAG AGT GGC GTA GG </td></tr><tr><td> Ex5F </td><td> TGA TCA غا CCA TCA TG </td></tr><tr><td> NeoR </td><td> CCG CTT CCA TTG CTC AGC GG </td></tr><tr><td rowspan="3"> 3 </td><td> TauLacZ </td><td> حجم جزء DNA: 360 شركة بريتيش بتروليوم </td></tr><tr><td> lacZup </td><td> ACA ACG TCG TGA GTG GGA AAA </td></tr><tr><td> lacZdown </td><td> ATC AAC ATT AAA TGT GAG CGA G </td></tr&gt; </tbody></table> الجدول 1: الاشعال تستخدم لPCR التنميط الجيني.

Watch this Scientific Journal Video about Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections at JoVE.com

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

كله جبل التصوير من جنين فأر التوقعات الحسية أكسون

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

whole-mount-imaging-of-mouse-embryo-sensory-axon-projections

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.0K Views.  Weill Medical College of Cornell University. We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

Video: Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the procedure for the visualization of Drosophila embryonic nervous system using antibodies to neuronal proteins. Since the entire embryonic peripheral nervous and central nervous systems are well characterized at the level of individual cells (Dambly-Chaudi&egrave;re et al., 1986; Bodmer et al., 1987; Bodmer et al., 1989), any aberrations to these systems can be easily identified using antibodies to different neuronal proteins. The developing embryos are collected at certain times to ensure that the embryos are in the proper developmental stages for visualization. After collection, the outer layers of the embryo, the chorion membrane and the vitelline envelope that surrounds the embryo, are removed before fixation. Embryos are then incubated with neuronal antibodies and visualized using fluorescently labeled secondary antibodies. Embryos at stages 12-17 are visualized to access the embryonic nervous system. At stage 12 the CNS germ band starts shortening and by stage 15 the definitive pattern of the commissure has been achieved. By stage 17 the CNS contracts and the PNS is fully developed (Campos-Ortega et al. 1985). Thus changes in the pattern of the PNS and CNS can be easily observed during these developmental stages.

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

We describe the procedure to prepare staged Drosophila embryos for the visualization of the embryonic nervous system during embryogenesis.

التصور الجهاز العصبي الجنينية في جبل لالجامع ذبابة الفاكهة الأجنة

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

متعددة الماوس تشريحي عصبي التصوير بالرنين المغناطيسي

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

تشريح العين ماوس لجبل الجامعة للصبغات الظهارة الشبكية

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

استنساخه سحق الفأر العصب الوركي وتقييم لاحق للتجديد من قبل الجامعة جبل تحليل العضلات

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Angiogenesis is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting of new blood vessels from a pre-existing vessel network. Angiogenesis plays a key role not only in normal development of organs and tissues, but also in many diseases in which blood vessel formation is dysregulated, such as cancer, blindness and ischemic diseases. In adult life, blood vessels are generally quiescent so angiogenesis is an important target for novel drug development to try and regulate new vessel formation specifically in disease. In order to better understand angiogenesis and to develop appropriate strategies to regulate it, models are required that accurately reflect the different biological steps that are involved. The mouse neonatal retina provides an excellent model of angiogenesis because arteries, veins and capillaries develop to form a vascular plexus during the first week after birth. This model also has the advantage of having a two-dimensional (2D) structure making analysis straightforward compared with the complex 3D anatomy of other vascular networks. By analyzing the retinal vascular plexus at different times after birth, it is possible to observe the various stages of angiogenesis under the microscope. This article demonstrates a straightforward procedure for analyzing the vasculature of a mouse retina using fluorescent staining with isolectin and vascular specific antibodies.

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

The neonatal murine retina provides a well characterized physiological model of angiogenesis, which permits investigations of the roles of different genes or drugs that modulate angiogenesis in an in vivo context. Immunofluorescent staining to accurately visualize the vascular plexus is pivotal to the success of these types of studies.

كله جبل تلوين مناعي للشبكية الفأر حديثي الولادة المعنية بالتحقيق في الأوعية الدموية<em&gt; في الجسم الحي</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

كله من جبل Immunolabeling الشم مستقبلات الخلايا العصبية في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الهوائي

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Flat Mount Imaging of Mouse Skin and Its Application to the Analysis of Hair Follicle Patterning and Sensory Axon Morphology

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel cell clusters), sebaceous glands, nerves and nerve endings, and capillaries. The spatial arrangement of these structures is tightly controlled on a microscopic scale - as seen, for example, in the orderly arrangement of cell types within a single hair follicle - and on a macroscopic scale - as seen by the nearly identical orientations of thousands of hair follicles within a local region of skin. Visualizing these structures without physically sectioning the skin is possible because of the 2-dimensional geometry of this organ. In this protocol, we show that mouse skin can be dissected, fixed, permeabilized, stained, and clarified as an intact two dimensional object, a flat mount. The protocol allows for easy visualization of skin structures in their entirety through the full thickness of large areas of skin by optical sectioning and reconstruction. Images of these structures can also be integrated with information about position and orientation relative to the body axes.

Mammalian skin contains a diverse array of structures - such as hair follicles and nerve endings - that exhibit distinctive patterns of spatial organization. Analyzing skin as a flat mount takes advantage of the 2-dimensional geometry of this tissue to produce full-thickness high-resolution images of skin structures.

شقة التصوير من جبل ماوس الجلد وتطبيقه على تحليل الشعر جريب الزخرفة والحسية أكسون الصرف

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel ...

Whole Mount Labeling of Cilia in the Main Olfactory System of Mice

The mouse olfactory system comprises 6-10 million olfactory sensory neurons in the epithelium lining the nasal cavity. Olfactory neurons extend a single dendrite to the surface of the epithelium, ending in a structure called dendritic knob. Cilia emanate from this knob into the mucus covering the epithelial surface. The proteins of the olfactory signal transduction cascade are mainly localized in the ciliary membrane, being in direct contact with volatile substances in the environment. For a detailed understanding of olfactory signal transduction, one important aspect is the exact morphological analysis of signaling protein distribution. Using light microscopical approaches in conventional cryosections, protein localization in olfactory cilia is difficult to determine due to the density of ciliary structures. To overcome this problem, we optimized an approach for whole mount labeling of cilia, leading to improved visualization of their morphology and the distribution of signaling proteins. We demonstrate the power of this approach by comparing whole mount and conventional cryosection labeling of Kirrel2. This axon-guidance adhesion molecule is known to localize in a subset of sensory neurons and their axons in an activity-dependent manner. Whole mount cilia labeling revealed an additional and novel picture of the localization of this protein.

Cilia of olfactory sensory neurons contain proteins of the signal transduction cascade, but a detailed spatial analysis of their distribution is difficult in cryosections. We describe here an optimized approach for whole mount labeling and en face visualization of ciliary proteins.

كله جبل وصفها من سيليا في النظام الشمية الرئيسية من الفئران

The mouse olfactory system comprises 6-10 million olfactory sensory neurons in the epithelium lining the nasal cavity. Olfactory neurons extend a single ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

التصوير كاليفورنيا<sup&gt; 2+</sup&gt; حيوية في محطات المخروط مبصرة أكسون من شبكية العين الفأر

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

جبل كله تشريح والمناعي من الكبار ماوس القوقعة

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...