وقد تم تمويل البحوث في مختبر Bragonzi من قبل مؤسسة الإيطالية التليف الكيسي (CFaCore) والاتحاد الأوروبي وF7-2009-223670. تم تنفيذ جزء من هذا العمل في الإنبيق، مختبر المجهر المتقدمة، وأجري التشريح المرضي الماوس في وحدة من تشريح المرضي (معهد سان رافاييل العلمي).

<ol>
	<li>Gibson, R., Burns, J. L., Ramsey, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+and+management+of+pulmonary+infections+in+cystic+fibrosis.">Pathophysiology and management of pulmonary infections in cystic fibrosis.</a> Am. J. Respir. Crit. Care. 168, 918-951 (2003).</li><li>Bragonzi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+models+of+acute+and+chronic+lung+infection+with+cystic+fibrosis+pathogens.">Murine models of acute and chronic lung infection with cystic fibrosis pathogens.</a> IJMM. 300, 584-593 (2010).</li><li>Cash, H. A., McCullough, B., Johanson, W. G., Bass, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rat+model+of+chronic+respiratory+infection+with+Pseudomonas+aeruginosa.">A rat model of chronic respiratory infection with Pseudomonas aeruginosa.</a> Am. Rev. Respir. Dis. 119, 453-459 (1979).</li><li>Starke, J. R., Langston, C., Baker, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+chronic+pulmonary+infection+with+Pseudomonas+aeruginosa+and+Pseudomonas+cepacia.">A mouse model of chronic pulmonary infection with Pseudomonas aeruginosa and Pseudomonas cepacia.</a> Pediatr. Res. 22, 698-702 (1987).</li><li>Pedersen, S. S., Hansen, B. L., Hansen, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+experimental+chronic+Pseudomonas+aeruginosa+lung+infection+with+P.+aeruginosa+entrapped+in+alginate+microspheres.">Induction of experimental chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection with P. aeruginosa entrapped in alginate microspheres.</a> APMIS. 98, 203-211 (1990).</li><li>Bragonzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonmucoid+Pseudomonas+aeruginosa+expresses+alginate+in+the+lungs+of+patients+with+cystic+fibrosis+and+in+a+mouse+model.">Nonmucoid Pseudomonas aeruginosa expresses alginate in the lungs of patients with cystic fibrosis and in a mouse model.</a> J. Infect. Dis. 192, 410-419 (2005).</li><li>van Heeckeren, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+models+of+chronic+Pseudomonas+aeruginosa+lung+infection.">Murine models of chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection.</a> Lab. Anim. 36, 291-312 (2002).</li><li>Bragonzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+microevolution+during+cystic+fibrosis+lung+infection+establishes+clones+with+adapted+virulence+AJRCCM.">Pseudomonas aeruginosa microevolution during cystic fibrosis lung infection establishes clones with adapted virulence AJRCCM.</a> 180, 138-145 (2009).</li><li>Kukavica-Ibrulj, I., Facchini, M., Cigana, C., Levesque, R. C., Bragonzi, A., Filloux, S., Ramos, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+Pseudomonas+aeruginosa+virulence+and+the+host+response+using+murine+models+of+acute+and+chronic+lung+infection.">Assessing Pseudomonas aeruginosa virulence and the host response using murine models of acute and chronic lung infection.</a> Methods in Pseudomonas aeruginosa: Humana Press. , (2014).</li><li>Moalli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Therapeutic+Potential+of+the+Humoral+Pattern+Recognition+Molecule+PTX3+in+Chronic+Lung+Infection+Caused+by+Pseudomonas+aeruginosa.">The Therapeutic Potential of the Humoral Pattern Recognition Molecule PTX3 in Chronic Lung Infection Caused by Pseudomonas aeruginosa.</a> J. Immunol. 186, 5425-5534 .</li><li>Paroni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+CFTR-deficient+mice+to+long-term+Pseudomonas+aeruginosa+chronic+infection+and+PTX3+therapeutic+treatment.">Response of CFTR-deficient mice to long-term Pseudomonas aeruginosa chronic infection and PTX3 therapeutic treatment.</a> J. Infect. Dis. In press, .</li><li>Maxeiner, J., Karwot, R., Hausding, M., Sauer, K. A., Scholtes, P., Finotto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+enable+the+investigation+of+murine+bronchial+immune+cells,+their+cytokines+and+mediators.">A method to enable the investigation of murine bronchial immune cells, their cytokines and mediators.</a> Nat. Protoc. 2, 105-112 (2007).</li><li>Bragonzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+microevolution+during+cystic+fibrosis+lung+infection+establishes+clones+with+adapted+virulence..">Pseudomonas aeruginosa microevolution during cystic fibrosis lung infection establishes clones with adapted virulence..</a> AJRCCM. In press, (2009).</li><li>Pirone, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burkholderia+cenocepacia+strains+isolated+from+cystic+fibrosis+patients+are+apparently+more+invasive+and+more+virulent+than+rhizosphere+strains.">Burkholderia cenocepacia strains isolated from cystic fibrosis patients are apparently more invasive and more virulent than rhizosphere strains.</a> Environ. Microbiol. 10, 2773-2784 (2008).</li><li>Bragonzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+co-infection+of+the+cystic+fibrosis+lung+by+Pseudomonas+aeruginosa+and+Burkholderia+cenocepacia+reveals+influences+on+biofilm+formation+and+host+response.">Modelling co-infection of the cystic fibrosis lung by Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cenocepacia reveals influences on biofilm formation and host response.</a> PLoS One. 7, .</li><li>Bianconi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+signature-tagged+mutagenesis+in+Pseudomonas+aeruginosa:+tracking+patho-adaptive+mutations+promoting+long-term+airways+chronic+infection.">Positive signature-tagged mutagenesis in Pseudomonas aeruginosa: tracking patho-adaptive mutations promoting long-term airways chronic infection.</a> PLoS Pathog.. 7, (2011).</li></ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

الخطوات الحاسمة في P. وذكرت الزنجارية حبات إعداد والتحدي الماوس أدناه. سلالة الزنجارية P. المستخدمة للفئران التحدي أمر بالغ الأهمية. الوفيات، عدوى مزمنة أو التخليص ربما تختلف اختلافا كبيرا تبعا لإجهاد البكتيريا تستخدم للتحدي. وP. كان يفضل الزنجارية RP73 سلالة السريرية على مدى سلالة المختبر المرجعي PAO1 لأنه أدى إلى وفيات أقل نسبيا، أشد الآفات، والعدوى المزمنة أعلى. يجب أن يتم تنفيذ اختبار المخدرات في الدراسات قبل السريرية مع P. سلالات الزنجارية التي اختيرت لكفاءتها العالية في إنشاء العدوى المزمنة على المدى الطويل. هذا يقلل من عدد من الفئران التي تنسجم مع متطلبات التحقق العلمي والتحليل الإحصائي 10،11. الفرد P. الزنجارية الاستعدادات أجار حبة تختلف في الحجم وكفو / مل. وعلىوتعتبر قطر من 150 ميكرون verage مع 2 × 10 7 كفو / مل الأمثل. يتأثر حجم حبة بمعدل التحريك أثناء مرحلة التبريد (الخطوة 2.9). حبات أثار في سرعة قصوى صغيرة وكروية (&lt;50 ميكرون)، في حين أثارت تلك هي ببطء شديد كبيرة وغير متبلور (&gt; 1 مم). علاوة على ذلك، عندما التخفيف النهائية لالتحدي مستعدة، والخرز مع الحمولة الجرثومية المنخفضة يمكن أن تكون لزجة في حين أن أولئك مع ارتفاع الحمولة الجرثومية يمكن أن تضعف بشكل مفرط. ويرتبط تلقيح الفئران مع حبات لزجة مع ارتفاع معدل الوفيات بسبب الاختناق الفئران قريبا بعد التحدي، في حين حبات المخفف بشكل مفرط قد يؤدي إلى عدم وجود عدوى مزمنة. حجم الأمثل للحقن داخل الرغامى هو 50 ميكرولتر لكن أحجام التداول أعلى تصل إلى 100 ميكرولتر يمكن تلقيح. ونادرا ما يتم ملاحظة وجود اختلافات في وفيات أو عدوى مزمنة من الفئران عندما تتراوح الجرعة ما بين 5 تلقيح × 10 5 و 5 × 10 6 كفو / الماوس. Appropriatه يجب أن تستخدم البكتيرية المتوسطة النمو لتشكيل حبات أجار. في هذا المثال، P. كان جزءا لا يتجزأ الزنجارية في TSA؛ ذكرت صحف أخرى أن بيركولديريا cenocepacia أدرج في المغذيات أجار مرق 14،15. يجب الخرز أجار توفير بيئة microanaerobic مع المواد الغذائية الأساسية متوفرة لتكاثر الجراثيم من الخلايا واحد لmicrocolonies 9. جهد الجهاز التنفسي تختلف تبعا لجرعة مخدر واستخدامها، ويؤثر على الوفيات بعد الجراحة. الكيتامين بجرعة 0.1 ملغ / غ وزن الجسم andxylazine بجرعة 0.01 ملغ / غرام من وزن الجسم هي الخيارات المثلى. التنفس الطبيعي عند مدخل أنبوب الفئران مع القسطرة وضحالة واضح عندما يتم تلقيح الفئران عن طريق P. الزنجارية أجار الخرز. من الناحية المثالية، حقن P. يجب أن يتم تنفيذ الزنجارية أجار الخرز ببطء مع حجم الأمثل لل50 ميكرولتر. كميات أكبر تصل إلى 100 ميكرولتر يمكن أن يؤدي إلى وفيات أعلىوصعوبات أكبر في الانتعاش الفئران. يصاب كل الفئران على نحو كاف عندما تحدى عن طريق الجراحة داخل القصبة الهوائية. وP. الزنجارية RP73 أجار الناجم عن الالتهاب الرئوي المزمن حبة يشير إلى أن في هذا النموذج العدوى هو التعدد البؤرية وينطوي على واحد أو أكثر فصوص الرئة دون المساس الرئة بأكملها عموما. وبالتالي، يجب أن يتم تقييم الحمولة الجرثومية والاستجابة الالتهابية للخروج على مجموع الرئة. تحليل فصوص انتقائية لا تعطي نتائج صحيحة. يجب إضافة مجموعة من الفئران غير المصابة كوسيلة لمراقبة ومقارنة مع الفئران المصابة للكشف عن أي خلل محتمل في تجنيد الخلايا في السائل BAL أو في الأنسجة في الرئة بسبب التلوث أو خطأ في الإجراء. أنشئ هذا النموذج في مختبر BSL-2 مع ينبغي تدريب جميع العاملين في المختبرات في المهارات المناسبة للمراقبة الماوس. تم رصد الفئران مرتين يوميا لمدة المعلمات التالية: انتصاب الشعر، وموقف، تنقل، والتنفس، والفضول، إفراز الأنف، والاستمالة والجفاف. الموت الرحيم كانت الفئران التي فقدت ≥ 20٪ من وزن الجسم، وأظهرت الأدلة السريرية للمرض شديدة، مثل معطف ضيع، الخمول، فقدان الشهية، وضعف تحرك، أو الموقف المؤلم، وذلك قبل انتهاء التجربة. الفئران المصابة P. أظهرت الزنجارية RP73 أجار الخرز علامات أقل من الانزعاج خلال ثلاثة أيام من العدوى بالمقارنة مع الفئران المصابة PAO1. بعد هذه النقطة مرة مسح بعض الفئران البكتيريا ووضع غيرها عدوى مزمنة مستقرة، لمدة تصل إلى 28 يوما. أثبتنا أن نموذج عدوى مزمنة نقترح في هذه الورقة هي قادرة على إحداث P. مستقرة عدوى مزمنة الزنجارية في الفئران. وقد تم تحسين هذا الأسلوب لدراسة الآليات الجزيئية الكامنة وراء الفوعة الممرض والدفاع المضيف 8،9،16 أو لاختبار المخدرات من الجزيئات المضادة للبكتيريا ومضادة للالتهابات 10،11. Tانه المصادقة قبل السريرية لهذه المركبات في النماذج الحيوانية المناسبة أمر ضروري لمستقبل التدخلات العلاجية لأمراض الرئة في المرضى الذين يعانون من التليف الكيسي.

التليف الكيسي (CF) هو مرض وراثي التي تسببها طفرات في التليف الكيسي عبر الغشاء تصرف منظم (CFTR) الجينات. هذا الجين يشفر لقناة كلوريد أعرب على الغشاء معظم الخلايا الظهارية. تسبب توسع القصبات، يسد المخاط ومتني الدمار أساسا من التهابات الزائفة الزنجارية يؤدي تدريجيا إلى أمراض الرئة الحادة والوفيات في معظم المرضى CF 1. فهم المرضية CF ومزيد من علاجات جديدة تعتمد على تطوير نموذج حيواني مع السمات المميزة لCF. العديد من الفئران، المعدلة وراثيا لهذا الجين CFTR، تم إنشاؤه لكن القيود في قدرة تلك الأنواع ألخص بأمراض الرئة CF-مثل وعدة تشوهات الجهاز التي شوهدت في مرضى التليف الكيسي قد تم توثيقها على نطاق واسع 2. تطوير عدوى هي واحدة من التحديات الرئيسية في نموذج حيواني CF. على البنود الأدبيقترح في وقت مبكر أن عدوى مزمنة دائم أكثر من شهر واحد يمكن أن يتحقق إلا إذا تم تلقيح الفئران مع البكتيريا جزءا لا يتجزأ من وكيل شل حركة مثل أجار، الاغاروز، أو الأعشاب البحرية الجينات 3-5. توفر هذه العوامل شل حركة الشروط microaerobic / اللاهوائية التي تسمح للبكتيريا أن تنمو في شكل microcolonies، على غرار النمو في المخاط من المرضى CF 6. هذا النموذج من عدوى مزمنة تؤدي إلى استمرار البكتيريا في الرئتين تسبب التهاب الشعب الهوائية والأضرار 7. ومع ذلك، اعتمادا على الطريقة المستخدمة، السلالة البكتيرية وجرعة تلقيح في الرئتين، فإن النسبة المئوية من الفئران المصابة المزمن والحمل البكتيري تعافى في الرئتين عند نقاط زمنية مختلفة يمكن أن تختلف إلى حد كبير. على وجه الخصوص، لا يزال التحدي الرئيسي للعدوى مزمنة طويلة الأجل عبء البكتيرية منخفضة من قبل P. الزنجارية ونسبة منخفضة من الفئران المصابة أسابيع بعد التحدي، مشيرا ثايتم مسح الخلايا البكتيرية ر تدريجي من قبل المضيف. عن طريق تحديد P. الزنجارية RP73 سلالة السريرية من مجموعة من CF يعزل 8 حصلنا عليها بنجاح وفيات منخفض، والآفات أكثر حدة، ونسبة عالية من العدوى المزمنة مع الحمولة الجرثومية مستقرة تصل إلى شهر واحد في الفئران C57Bl/6NCrl. تفاصيل هذه الورقة منهجية لتضمين P. الزنجارية في حبات أجار، ولدينا إصابة الفئران عن طريق التقطير داخل القصبة الهوائية، ويقاس الحمل والسيتوكينات البكتيرية في الرئتين، وجمع السائل BAL وأجرى الفحص النسيجي. عموما، فإن هذا البروتوكول مساعدة الباحثين في معالجة المسائل الهامة أساسا على 8،9 المرضية واختبار علاجات جديدة ضد P. الزنجارية عدوى مزمنة 10،11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="605">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Bacto Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:191px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:143px;">211823</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Difco Agar, granulated</td>
			<td style="width:191px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:143px;">214510</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Heavy mineral oil</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">330760-1L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">S-(+)-Ketamine hydrochloride</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">K1884</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazine hydrochloride</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">X1251</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:272px;">1 ml syringe 25 G 5/8&#39;&#39;&#160;0.5 x 16 mm</td>
			<td style="width:191px;">PIC</td>
			<td style="width:143px;">3071250300350</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Catheter 22GA 0.9 x 25 mm</td>
			<td style="width:191px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:143px;">381223</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Graefe Forceps - 0.5 mm Tips Curved</td>
			<td style="width:191px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:143px;">11152-10</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Scissors, Iris, 11 cm, straight</td>
			<td style="width:191px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:143px;">501758</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Suture clips</td>
			<td style="width:191px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:143px;">12040-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Suture thread</td>
			<td style="width:191px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:143px;">18020-40</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:191px;">Lonza</td>
			<td style="width:143px;">BE12-167F</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Complete protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:143px;">11836145001</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:272px;">Fast-Read 102 Burker disposable chamber</td>
			<td style="width:191px;">Biosigma</td>
			<td style="width:143px;">390497</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Tuerk solution</td>
			<td style="width:191px;">Fluka</td>
			<td style="width:143px;">93770</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">RBC lysis buffer</td>
			<td style="width:191px;">Biolegend</td>
			<td style="width:143px;">420301</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:191px;">Lonza</td>
			<td style="width:143px;">DE14-801F</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">EZ cytofunnel</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:143px;">A78710021</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Superfrost ultra plus microscope slides</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:143px;">J3800AMNZ</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Diff-Quik Romanowsky staining set</td>
			<td style="width:191px;">Medion Diagnostics</td>
			<td style="width:143px;">130832</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:272px;">Hexadecyltrimethylammonium chloride</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">52366-10G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">96-well EIA/RIA plate</td>
			<td style="width:191px;">Costar</td>
			<td style="width:143px;">3590</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">3,3&#8217;,5,5&#8217;- tetramethylbenzidine</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">T8665-1L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Sulfuric acid</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">320501-1L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">10% neutral buffered formalin</td>
			<td style="width:191px;">Bio-optica</td>
			<td style="width:143px;">05-01005Q</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Harris haematoxylin non Papanicolau</td>
			<td style="width:191px;">Bio-optica</td>
			<td style="width:143px;">05-M06004</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Eosin plus alcoholic solution</td>
			<td style="width:191px;">Bio-optica</td>
			<td style="width:143px;">05-M11007</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Shaking incubator</td>
			<td style="width:191px;">Amerex Instruments</td>
			<td style="width:143px;">Steady Shake 757</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Water bath</td>
			<td style="width:191px;">Grant</td>
			<td style="width:143px;">SUB14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Homogenizer</td>
			<td style="width:191px;">Ystral</td>
			<td style="width:143px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Precision balance</td>
			<td style="width:191px;">KERN</td>
			<td style="width:143px;">440-47N</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Cytocentrifuge</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:143px;">A78300003</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Low Cost Heating Pad</td>
			<td style="width:191px;">2biol</td>
			<td style="width:143px;">LCHP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="42" rowspan="2" style="height:42px;width:272px;">Homogenization probe</td>
			<td rowspan="2" style="width:191px;">Ystral</td>
			<td style="width:143px;">2366931(great)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:143px;">2366925(small)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Inverted optical microscope</td>
			<td style="width:191px;">Zeiss</td>
			<td style="width:143px;">Axioplan2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Camera (microscope)</td>
			<td style="width:191px;">Zeiss</td>
			<td style="width:143px;">Axiocam MRc5</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Rotary microtome</td>
			<td style="width:191px;">Leica</td>
			<td style="width:143px;">RM2255</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long term chronic pseudomonas aeruginosa airway infection in mice

نموذج الفأر من عدوى المسالك الهوائية المزمن هو أحد الأصول الرئيسية في التليف الكيسي (CF) البحوث، وعلى الرغم من أن هناك عدد من المخاوف بشأن النموذج نفسه. المراحل المبكرة من الالتهاب والعدوى وقد تم دراسة على نطاق واسع باستخدام الزائفة الزنجارية نموذج أجار الخرز الماوس، في حين ركزت تقارير قليلة فقط على العدوى المزمنة على المدى الطويل في الجسم الحي. يبقى التحدي الرئيسي لعدوى مزمنة على المدى الطويل عبء البكتيرية منخفضة من قبل P. الزنجارية ونسبة منخفضة من الفئران المصابة أسابيع بعد التحدي، مشيرا إلى أن الخلايا البكتيرية يتم مسح تدريجيا من قبل المضيف. تعرض هذه الورقة طريقة للحصول على كفاءة عدوى مزمنة طويلة الأجل في الفئران. ويستند هذا الأسلوب على التضمين من P. الزنجارية سلالات السريرية في حبات أجار في المختبر، تليها التقطير داخل القصبة الهوائية في الفئران C57Bl/6NCrl. ويرتبط التهاب في الرئتين الثنائية مع بغازياألطراف قابلة للقياس للقراءة عموميات بما في ذلك فقدان الوزن، وفيات، والعدوى المزمنة، والاستجابة للالتهابات. وP. كان يفضل الزنجارية RP73 سلالة السريرية على مدى سلالة المختبر المرجعي PAO1 لأنه أدى إلى وفيات أقل نسبيا، أشد الآفات، والعدوى المزمنة أعلى. P. قد تستمر الزنجارية الاستعمار في الرئة لأكثر من ثلاثة أشهر. الفئران أمراض الرئة يشبه ذلك من مرضى التليف الكيسي يعانون من أمراض رئوية مزمنة متقدمة. هذا نموذج الفئران يحاكي معظم كثب مسار المرض الإنسان، ويمكن استخدامها على حد سواء لدراسات عن المرضية وتقييم علاجات جديدة.

عندما يتم البروتوكول بشكل صحيح، P. سوف الزنجارية أجار حبات قياس بين 100-200 ميكرون ويمكن ملاحظتها مع ضوء المجهر المقلوب من قبل pipetting كمية صغيرة من حبات أجار التعليق على شريحة. الخلايا البكتيرية واحدة واضحة في حبات أجار، كما هو مبين بالتفصيل في الشكل 1. اختيار P. سلالة الزنجارية المستخدمة في إعداد أجار الخرز أمر بالغ الأهمية. الشكل 2 والجدول 1 تشير البيانات التي تم الحصول عليها في أعقاب إصابة الفئران مع P. الزنجارية PAO1 مرجعية سلالة المختبر بالمقارنة مع RP73 عزل السريرية. وفيات، لاحظ في أول 3 أيام من العدوى، منخفضة لكل من السلالات، ولكن أعلى لPAO1 (أرقام 2A و 2B). ويمكن ملاحظة اختلافات كبيرة من حيث نسبة الإصابة المزمنة في الفئران على قيد الحياة بين PAO1 وRP73 الفئران تحدى. حين إلىه في 3 أيام بعد الإصابة، وجميع الفئران المصابة تزال من قبل كل من P. سلالات الزنجارية، وبعد هذا الوقت نقطة مسح بعض الفئران البكتيريا ووضع غيرها عدوى مزمنة مستقرة. من 7 أيام فصاعدا نسبة الفئران المصابة بشكل مزمن، ظلت مستقرة تصل إلى 28 يوما لكلا من السلالات. PAO1 يؤدي إلى عدوى مزمنة في مئوية من الفئران التي تراوحت بين 20 حتي 27،8٪ (الشكل 2A)، في حين كانت نسبة RP73 75-87،1٪ (الشكل 2B)، مشيرا إلى أن P. كان الزنجارية سلالة السريرية أكثر كفاءة في إنشاء عدوى مزمنة مقارنة سلالة المختبر PAO1. وكانت أعداد البكتيريا في 3 أيام بعد الإصابة أعلى لPAO1 (5 × 10 7 كفو / الرئة) (الشكل 2C والجدول 1) مقارنة RP73 (1.3 × 10 6 كفو / الرئة) (الشكل 2D)، ثم من 7 أيام فصاعدا، عندما أنشئت عدوى مزمنة، وتستقر الحمولة الجرثومية في ما بين 10 &lt;sup&gt; في 4 و 10 5 كفو / الرئة لكلا السلالات. بمجرد ثبوت العدوى المزمنة، لا يغير من عدد من كفو / رئة بشكل ملحوظ خلال شهر واحد. علاوة على ذلك، فإن الحمل البكتيري في الشعب الهوائية مشابه بين الفئران تحدى مع السلالات البكتيرية المختلفة 9،13. قراءة أخرى الرافضة، بما في ذلك المضيف الاستجابة الالتهابية وأمراض الأنسجة، ويمكن قياس مختلفة في الوقت نقطة من التحدي. الشكل 3 يبين استجابة التهابية من حيث التوظيف الكريات البيض في السائل BAL الماوس 7 أيام من التحدي مع P. الزنجارية RP73 سلالة السريرية جزءا لا يتجزأ من أجار الخرز. تمت مقارنة الفئران المصابة RP73 على الفئران غير المصابة. شملت عدد خلايا العدلات التفاضلي، الضامة، والخلايا الليمفاوية. من إجمالي عدد الخلايا هو أعلى بكثير لدى الفئران المصابة RP73 مقارنة مع الفئران غير المصابة. العدلات، على وجه الخصوص، تقريبا غائبة تماما في السائل BAL من الفئران المصابة لا، كانت معظم represented نوع الخلوية في الفئران المصابة RP73، مما يدل على استجابة كبيرة من قبل النظام المناعي الفطري للإصابة مزمنة. تحليل الأنسجة من الرئتين من الفئران، بالعدوى بشكل مزمن مع P. الزنجارية RP73، يدل على أن العدوى هو التعدد البؤرية. أرقام 4C و4F تظهر الفص واحد هو أن أكثر انخراطا من الفصوص الأخرى التي تتأثر أو تشارك بشكل هامشي (أرقام 4B و 4E). ويمكن ملاحظة الخرز في التجويف الشعب الهوائية وmicrocolonies من الخلايا البكتيرية واضحة في حبات (أرقام 4C و4F). وأظهر التشريح المرضي الرئة في المناطق المعنية عن طريق العدوى الآفات الالتهابية في شعب هوائية وفي لحمة الرئة. امتلأت شعب هوائية من قبل التهاب العدلة الضخمة المحيطة الخرز، في حين كانت مخترقة من قبل لحمة الضامة، الخلايا الليمفاوية وبعض العدلات. الأنسجة منتم استخدام الماوس المعافين كعنصر تحكم، وكانت كل من وحمة شعب هوائية واضحة من الخلايا الالتهابية (أرقام 4A و 4D). <img alt="الرقم 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51019/51019fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51019/51019fig2.jpg" width="500px" /> الشكل 2. بالطبع وقت P. العدوى الزنجارية المزمنة مع PAO1 سلالة المرجعية وRP73 سلالة السريرية. C57BL/6NCrl (20-22 ز) كانت مصابة ذكور الفئران عن طريق الحقن داخل القصبة الهوائية مع 1-5 × 10 6 كفو من P. الزنجارية سلالة PAO1 (A و C) أو RP73 (B و D) جزءا لا يتجزأ من أجار الخرز. لكل نقطة في الوقت، رسوم بيانية تمثل نسبة الوفيات الناجمة عن تجرثم الدم (الحمراء)، والبقاء على قيد الحياة (الرمادي) أو النسبة المئوية من الحيوانات التي مسح العدوى (أبيض) والقادرين على إنشاء عدوى مزمنة (الأخضر) (A و B). الموت الرحيم كانت الفئران على قيد الحياة في الوقت المشار إليه نقاط، وكانت تحصد الرئتين، المتجانس، ومثقف على لوحات TSA لتحديد الحمولة الجرثومية. وتظهر منحنيات نمو سلالات PAO1 وRP73 في الرئتين الفئران (C و D). تمثل النقاط القياسات الفردية وخطوط أفقية تمثل القيم الوسيطة. يشار دلالة إحصائية بواسطة اختبار فيشر: * ع &lt;0.05، ** ع &lt;0.01 ***، ع &lt;0.001. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51019/51019fig2highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> . <img alt="الجدول 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51019/51019table1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51019/51019table1.jpg" width="500px" /> الجدول 1. بالطبع وقت P. الزنجاريةعدوى مزمنة مع PAO1 سلالة المرجعية وRP73 سلالة السريرية. وتظهر النسب المئوية للوفيات والإصابة المزمنة من PAO1 وRP73 الفئران المصابة وعدد من CFUs في الرئة (الوسيط). ويتم اختيار القيم 2-4 تجارب مختلفة. ن، لا. من الفئران المجمعة تحليل لكل حالة. يشار دلالة إحصائية بواسطة اختبار فيشر: * ع &lt;0.05، ** ع &lt;0.01 ***، ع &lt;0.001. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51019/51019table1highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> . <img alt="الرقم 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51019/51019fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51019/51019fig3.jpg" width="500px" /> الرقم 3. تقييم التهاب في السائل BAL بعد 7 أيام من العدوى المزمنة مع RP73 سلالة السريرية. (A) ويبين الرسم البياني المحتوى من الكلالكريات البيض، العدلات وحيدات / الضامة تعافى في السائل BAL من الفئران المصابة RP73 مزمنة بعد 7 أيام من التحدي بالمقارنة مع الفئران غير المصابة (مراقبة). يتم تمثيل القيم المتوسطة ووزارة شؤون المرأة. (ب) في المربع أدناه تبين الأسهم العدلات والبلاعم كما رأينا في بقعة على الشريحة بعد cytospin. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51019/51019fig3highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> . <img alt="الرقم 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51019/51019fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51019/51019fig4.jpg" width="500px" /> الشكل 4. الهيماتوكسيلين ويوزين تلطيخ على المقاطع النسيجية من الرئتين بعد 7 أيام من العدوى المزمنة مع RP73 سلالة السريرية. تظهر لوحة الهيماتوكسيلين ويوزين تلطيخ أقسام الرئة لدى الفئران غير المصابة (A و D) والفئران حتدياإد مع أجار حبات تحتوي على RP73 (B، C، E، F). العدوى هو التعدد البؤرية وينطوي عموما واحدا أو أكثر من فصوص الرئة (C و F)، في حين أن البعض الآخر لم يتأثر أو تشارك بشكل هامشي (B و E). السهام تشير الخرز أجار المودعة في الشعب الهوائية التجويف (ب). خطوط (A، B، C) 250 ميكرومتر؛ خطوط (D، E، F) 100 ميكرون <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51019/51019fig4highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice at JoVE.com

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

نحن تصف طريقة أجار حبات لإقامة عدوى مجرى الهواء المستمر على المدى الطويل المزمن الزائفة الزنجارية في نموذج الفأر.

على المدى الطويل المزمن<em&gt; الزائفة الزنجارية</em&gt; عدوى مجرى الهواء في الفئران

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

long-term-chronic-pseudomonas-aeruginosa-airway-infection-in-mice

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

22.3K Views.  San Raffaele Scientific Institute.  نحن تصف طريقة أجار حبات لإقامة عدوى مجرى الهواء المستمر على المدى الطويل المزمن الزائفة الزنجارية في نموذج الفأر. 

Video: Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living surfaces. In this paper, we describe protocols for forming Pseudomonas aeruginosa biofilms on human airway epithelial cells (CFBE cells) grown in culture. In the first method (termed the Static Co-culture Biofilm Model), P. aeruginosa is incubated with CFBE cells grown as confluent monolayers on standard tissue culture plates. Although the bacterium is quite toxic to epithelial cells, the addition of arginine delays the destruction of the monolayer long enough for biofilms to form on the CFBE cells. The second method (termed the Flow Cell Co-culture Biofilm Model), involves adaptation of a biofilm flow cell apparatus, which is often used in biofilm research, to accommodate a glass coverslip supporting a confluent monolayer of CFBE cells. This monolayer is inoculated with P. aeruginosa and a peristaltic pump then flows fresh medium across the cells. In both systems, bacterial biofilms form within 6-8 hours after inoculation. Visualization of the biofilm is enhanced by the use of P. aeruginosa strains constitutively expressing green fluorescent protein (GFP). The Static and Flow Cell Co-culture Biofilm assays are model systems for early P. aeruginosa infection of the Cystic Fibrosis (CF) lung, and these techniques allow different aspects of P. aeruginosa biofilm formation and virulence to be studied, including biofilm cytotoxicity, measurement of biofilm CFU, and staining and visualizing the biofilm.

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

This paper describes different methods of growing Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured human airway epithelial cells. These protocols can be adapted to study different aspects of biofilm formation, including visualization of the biofilm, staining of the biofilm, measuring the colony forming units (CFU) of the biofilm, and studying biofilm cytotoxicity.

شارك في نماذج من الثقافة الزائفة الزنجارية الأغشية الحيوية نمت على خلايا حية إيرواي الإنسان

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological properties compared to free living microorganisms. Biofilms in nature are often difficult to investigate and reside under poorly defined conditions1. Using a transparent substratum it is possible to device a system where simple biofilms can be examined in a non-destructive way in real-time: here we demonstrate the assembly and operation of a flow cell model system, for in vitro 3D studies of microbial biofilms generating high reproducibility under well-defined conditions2,3.
The system consists of a flow cell that serves as growth chamber for the biofilm. The flow cell is supplied with nutrients and oxygen from a medium flask via a peristaltic pump and spent medium is collected in a waste container. This construction of the flow system allows a continuous supply of nutrients and administration of e.g. antibiotics with minimal disturbance of the cells grown in the flow chamber. Moreover, the flow conditions within the flow cell allow studies of biofilm exposed to shear stress. A bubble trapping device confines air bubbles from the tubing which otherwise could disrupt the biofilm structure in the flow cell.
The flow cell system is compatible with Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) and can thereby provide highly detailed 3D information about developing microbial biofilms. Cells in the biofilm can be labeled with fluorescent probes or proteins compatible with CLSM analysis. This enables online visualization and allows investigation of niches in the developing biofilm. Microbial interrelationship, investigation of antimicrobial agents or the expression of specific genes, are of the many experimental setups that can be investigated in the flow cell system.

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Protocol describing the application of a flow cell system for growing and analyzing microbial biofilms for Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM).

والزائفة الزنجارية السكيراء بيوفيلم في خلايا خميرة تدفق

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

عزل الحمض النووي الريبي الزائفة الزنجارية استعمار الهضمي المسالك الفئران

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

استخدام متوسط ​​البلغم الاصطناعي لاختبار فعالية المضادات الحيوية لمكافحة<em&gt; الزائفة الزنجارية</em&gt; في شروط أكثر ملاءمة لالرئة التليف الكيسي

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. Here we have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa or PA). Using this model, we were able to show lung inflammation at the early phase of injury. In addition, alveolar epithelial barrier leakiness was observed by analyzing bronchoalveolar lavage (BAL); and alveolar cell death was observed by Tunel assay using tissue prepared from injured lungs. At a later phase following injury, we observed cell proliferation required for the repair process. The injury was resolved 7 days from the initiation of P. aeruginosa injection. This model mimics the sequential course of lung inflammation, injury and repair during pneumonia. This clinically relevant animal model is suitable for studying pathology, mechanism of repair, following acute lung injury, and also can be used to test potential therapeutic agents for this disease.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

We have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa. This model mimics lung injury during pneumonia and is clinically relevant.

الزائفة الزنجارية المستحثة الرئة الإصابات نموذج

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. Chronic mouse wounds models have been used to understand the underlying interactions between the microorganisms and the host. The models developed to date rely on the use of haired animals and terminal collection of wound tissue for determination of viable bacteria. While significant insight has been gained with these models, this experimental procedure requires a large number of animals and sampling is time consuming. We have developed a novel murine model that incorporates several optimal innovations to evaluate biofilm progression in chronic wounds: a) it utilizes hairless mice, eliminating the need for hair removal; b) applies pre-formed biofilms to the wounds allowing for the immediate evaluation of persistence and effect of these communities on host; c) monitors biofilm progression by quantifying light production by a genetically engineered bioluminescent strain of Pseudomonas aeruginosa, allowing real-time monitoring of the infection thus reducing the number of animals required per study. In this model, a single full-depth wound is produced on the back of STZ-induced diabetic hairless mice and inoculated with biofilms of the P. aeruginosa bioluminescent strain Xen 41. Light output from the wounds is recorded daily in an in vivo imaging system, allowing for in vivo and in situ rapid biofilm visualization and localization of biofilm bacteria within the wounds. This novel method is flexible as it can be used to study other microorganisms, including genetically engineered species and multi-species biofilms, and may be of special value in testing anti-biofilm strategies including antimicrobial occlusive dressings.

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Here we describe a novel diabetic murine model utilizing hairless mice for real-time, non-invasive, monitoring of biofilm wound infections of bioluminescent Pseudomonas aeruginosa. This method can be adapted to evaluate infection of other bacterial species and genetically modified microorganisms, including multi-species biofilms, and test the efficacy of antibiofilm strategies.

تأتي إلى "جانب الضوء": "في فيفو" الرصد الزائفة الزّنجاريّة بيوفيلم الالتهابات في "الجروح المزمنة" في "نموذج مورين أصلع السكري"

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary tissue during pneumonia results in the production of long-lived cytotoxins that can lead to subsequent end organ failure. We have developed in vitro assays to test the hypothesis that cytotoxins are produced during pulmonary infection. Isolated rat pulmonary endothelial cells and the bacterium Pseudomonas aeruginosa are used as model systems, and the production of cytoxins following infection of the endothelial cells by the bacteria is demonstrated using cell culture followed by direct quantitation using lactate dehydrogenase assays and a novel microscopic method utilizing ImageJ technology. The amyloid nature of these cytotoxins was demonstrated by thioflavin T binding assays and by immunoblotting and immunodepletion using A11 anti-amyloid antibody. Further analyses using immunoblotting demonstrated that oligomeric tau and A&#946; were produced and released by endothelial cells following infection by P. aeruginosa. These methods should be readily adaptable to analyses of human clinical samples.

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Simple methods are described for demonstrating the production of cytotoxic amyloids following infection of pulmonary endothelium by Pseudomonas aeruginosa.

طرق "كشف السامة للخلايا أميلويدس التالية العدوى من الرئة خلايا بطانية" الزائفة الزّنجاريّة

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, innate immune cells perform a number of essential functions, such as fighting infection, clearing necrotic debris, and stimulating matrix deposition. In order to fully understand the diverse signaling events that regulate this immune response, it is crucial to observe the complex behaviors of (and interactions that occur between) multiple cell lineages in vivo, and in real-time, with the high spatio-temporal resolution. The optical translucency and the genetic tractability of Drosophila embryos have established Drosophila as an invaluable model to live-image and dissect fundamental aspects of inflammatory cell behavior, including mechanisms of developmental dispersal, clearance of apoptotic corpses&#160;and/or microbial pathogens, and recruitment to wounds. However, more recent work has now demonstrated that employing a much later stage in the Drosophila lifecycle &#8211; the Drosophila pupa &#8211; offers a number of distinct advantages, including improved RNAi efficiency, longer imaging periods, and significantly greater immune cell numbers. Here we describe a protocol for imaging wound repair and the associated inflammatory response at the high spatio-temporal resolution in live Drosophila pupae. To follow the dynamics of both re-epithelialization and inflammation, we use a number of specific in vivo fluorescent markers for both the epithelium and innate immune cells. We also demonstrate the effectiveness of photo-convertible fluorophores, such as Kaede, for following the specific immune cell subsets, to track their behavior as they migrate to, and resolve from, the injury site.

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

Here we present a protocol for live-imaging wound repair and the associated inflammatory response at high spatio-temporal resolution in vivo. This method utilizes the pupal stage of Drosophila development to enable long-term imaging and tracking of specific cell populations over time and is compatible with efficient RNAi-mediated gene inactivation.

طويلة الأمد في فيفو تتبع ديناميات الخلايا التحريضية داخل الخوادر المورفولوجية

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, ...

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype called mucoidy. Alginate is linked to chronic lung infections resulting in poor prognosis in patients with cystic fibrosis (CF). Understanding the pathways that regulate the production of alginate can aid in the development of novel therapeutic strategies targeting the alginate formation. Another disease-related phenotype is the small colony variant (SCV). SCV is due to the slow growth of bacteria and often associated with increased resistance to antimicrobials. In this paper, we first show a method of culturing a genetically defined form of P. aeruginosa SCV due to pyrimidine biosynthesis mutations. Supplementation of nitrogenous bases, uracil or cytosine, returns the normal growth to these mutants, demonstrating the presence of a salvage pathway that scavenges free bases from the environment. Next, we discuss two methods for the measurement of bacterial alginate. The first method relies on the hydrolysis of the polysaccharide to its uronic acid monomer followed by derivatization with a chromogenic reagent, carbazole, while the second method uses an ELISA based on a commercially available, alginate-specific mAb. Both methods require a standard curve for quantitation. We also show that the immunological method is specific for alginate quantification and may be used for the measurement of alginate in the clinical specimens.

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Here, we describe a growth condition to culture the small colony variant of Pseudomonas aeruginosa. We also describe two separate methods for the detection and quantitation of the exopolysaccharide alginate produced by P. aeruginosa using a traditional uronic acid carbazole assay and an alginate-specific monoclonal antibody (mAb) based ELISA.

ثقافة البديل مستعمرة صغيرة من Pseudomonas aeruginosa وكمية من Alginate لها

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype ...

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of chronic wound infections in diabetic and hospitalized patients. There is an urgent need for chronic infection models to aid in the investigation of wound pathogenesis and the development of new therapies against this pathogen. Here, we describe a protocol that uses delayed inoculation 24 hours after full-thickness excisional wounding. The infection of the provisional wound matrix present at this time forestalls either rapid clearance or dissemination of infection and instead establishes chronic infection lasting 7&#8211;10 days without the need for implantation of foreign materials or immune suppression. This protocol mimics a typical temporal course of post-operative infection in humans. The use of a luminescent P. aeruginosa strain (PAO1:lux) allows for quantitative daily assessment of bacterial burden for P. aeruginosa wound infections. This novel model may be a useful tool in the investigation of bacterial pathogenesis and the development of new therapies for chronic P. aeruginosa wound infections.

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

We describe a delayed inoculation protocol for generating chronic wound infections in immunocompetent mice.

نموذج التلقيح المتأخر لعدوى الجروح المزمنة الزائفة الجيروجينوسا

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of ...