نشكر EUROSARF لإرسال لنا الخميرة TAP البلازميدات التعبير. ونحن ممتنون أيضا للحصول على مساعدة من التحرير ريان Labadens. وأيد هذا العمل من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة / NINDS (R01NS070962) لCW

1. توليد UAS-الموسومة TAP الذباب المعدلة وراثيا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توليد pUAST-الموسومة TAP بنيات الحمض النووي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقرر أي جانب (N-أو C-محطة) من البروتين الطعم يجب أن تنصهر العلامة TAP ل، على أساس هيكل / وظيفة البروتين. انظر المناقشة لمزيد من التفاصيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Subclone المنطقة الترميز كدنا] من الجين من الفائدة في مواقع الاستنساخ متعددة (MCS) من pUAST-NTAP أو pUAST-CTAP ناقلات لتوليد N-أو C-محطة الموسومة الجينات المحورة UAS-TAP، على التوالي. انظر الشكل 1 لخرائط مفصلة وقابلة للاستخدام مواقع التقييد وإطارات القراءة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توليد UAS-الموسومة TAP الذباب المعدلة وراثيا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تولد الذباب المعدلة وراثيا باستخدام البروتوكولات القياسية التالية ف بوساطة عنصر الإدراج 11. تتوفر تجاريا عدد من الخدمات الحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عبور العصبية السائق GAL4 (أي BG380-GAL4) إلى كل سطر المعدلة وراثيا الفردية وتحديد مستويات بروتين تعبيركل سطر من قبل لطخة غربية (مع البيروكسيداز مكافحة البيروكسيداز الضد) و / أو المناعية (مع مكافحة TAP الضد). بشكل عام، ينصح خط المعدلة وراثيا مع مستوى التعبير البروتين الذي هو على مقربة من البروتين الذاتية لإجراءات TAP. انظر المناقشة لمزيد من التفاصيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PerformGAL4/UAS-based تجارب الانقاذ لتأكيد وظيفة الجينات المحورة الموسومة TAP إذا كانت الخسارة من وظيفة المسوخ من الجينات ذات الاهتمام المتاحة. اختيار التحوير التي يمكن أن تنقذ كثيرا من الظواهر متحولة للتجارب TAP التالي. </li></ol></li></ol> 2. تحضير العينات لإجراء TAP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توليد مخزون ذبابة الذي يحمل كلا من السائق GAL4 العصبية (مثل BG380-GAL4) واختار التحوير الموسومة TAP من أجل تخفيف توسع عينات الطاير. جمع السلالات F1 السائق GAL4 وعبر UAS التحوير في حالات نادرة عندما يتسبب مزيج أعلاه البقاء والنمو غير مؤات. &lt;/ لى&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع العينات الصغيرة وتحسين حالة تحلل لsolubilizing البروتين الموسومة TAP. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل سلسلة من مخازن تحلل باستخدام مزيج من المنظفات غير أيوني NP-40 (0.1-1٪)، NaDOC (0.1-1٪) وتريتون X-100 (،05-،5٪). انظر الجدول رقم 1 والمناقشة لمزيد من المعلومات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على رأس وسادة CO2، استخدام # 5 ملقط لتشريح 20 رؤساء الكبار من التحوير TAP معربا عن الذباب وجمعها في أنبوب 1.5 مل لاختبار كل حالة تحلل العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 UL العازلة اختبار تحلل إلى أنبوب والتجانس رؤساء بواسطة التمسيد صعودا وهبوطا مع مدقة البلاستيك، ثم يضاف اختبار عازلة آخر 100 UL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور المحللة في الرأس 21،500 x ج لمدة 10 دقيقة (4 ° C)، وفصل طاف بيليه وبعد الطرد المركزي. إضافة 25 شباط 2X العازلة تحميل SDS لبيليه و10 ماي 4X العازلة تحميل SDS إلى 30 ماي من طاف على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غلي العينتين لمدة 5 دقائق وتحليلها جنبامن جانب باستخدام SDS-PAGE واللاحقة البقعة الغربية مع الأجسام المضادة PAP. تحديد الذوبان من نسبة مستويات TAP-البروتين في طاف مقابل بيليه. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير العينة في نطاق واسع <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توسيع وجمع الذباب الكبار. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توسيع المخزون neuronal-GAL4/UAS-TAP-transgene في زجاجات والوجه الزجاجات وتستخدم كل 3 أيام حتى التراكمي 250 زجاجات لجمع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الذباب الكبار جمع 1-3 أيام القديمة إلى 50 مل أنابيب مخروطية، ووضع أنبوب في النيتروجين السائل على الفور لتجميد عميق الذباب. تخزين الذباب في الفريزر -80 درجة مئوية. لاحظ أن حجم الذباب يجب أن لا تتجاوز 2/3 من أنبوب 50 مل. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع رؤساء ذبابة (تنفيذ هذه الخطوة على رأس الثلج الجاف المجفف). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اخراج المناخل prechilled وهاون ومدقة من -80 درجة مئوية الفريزر ووضعها على الثلج الجاف، من الناحية المثالية داخل دلو الثلج الكبيرة. كومة اثنين من الولايات المتحدة الأمريكية مناخل الاختبار القياسية مع رقم 25 على الأعلى الإلكترونية ورقم 40 في الجزء السفلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أخذ الذباب المجمدة خارج وإفلاتها في النيتروجين السائل والحفاظ على الذباب في هناك لمدة 10 دقيقة. دوامة أو تهزه بقوة أنابيب لكسر رؤساء والساقين، وأجنحة من الجثث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب الخليط في منخل أعلى، ثم يهز المناخل بقوة حين عقد كل من المناخل معا. بعد غربلة، فإن الهيئات البقاء على المنخل العلوي، ويطير سيتم الاحتفاظ الرؤوس على غربال القاع، وسوف الساقين، وأجنحة، وغيرها من الحطام يسقط على الثلج الجاف. فصل اثنين من المناخل وبعناية نقل رؤساء يطير إلى هاون الباردة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التجانس رؤساء ذبابة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على قمة الثلج الجاف، طحن رؤساء مع هاون ومدقة لجزيئات مسحوق، ثم نقل إلى مسحوق الزجاج 15 مل Dounce الأنسجة المطحنة التي كانت prechilled على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس أوزان طاحونة قبل وبعد سكب العينة رئيس في ذلك، ومن ثم حساب مدى عصيدة رئيسلو يزن. وهناك ما مجموعه 6-15 غرام من رؤساء ذبابة تكون كافية لكل تجربة TAP تعديل وفقا لذلك إلى مستويات التعبير من البروتين. إضافة 15 مل من العازلة التجانس الجليد الباردة (تحلل العازلة الأمثل في الخطوة 2.2) إلى مسحوق ثم السكتة الدماغية مع مدقة تخليص كبير حتى أنه من السهل للمدقة للذهاب إلى أعلى وأسفل. الحفاظ على طاحونة الزجاج على الجليد في جميع الأوقات. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد طاف لTAP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل جناسة لأنبوب الطرد المركزي عالية السرعة وتدور لمدة 20 دقيقة في ~ 50،000 x ج (4 درجات مئوية). نقل طاف إلى عالية السرعة أنبوب الطرد المركزي الجديدة وتكرار الطرد المركزي مرة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل طاف إلى أنبوب نابذة فائقة السرعة وإجراء 40 دقيقة ~ 250،000 x ج تدور لمزيد من مسح طاف. طاف مستعدة للإجراءات تنقية تقارب جنبا إلى جنب بعد تنبيذ فائق. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. TAP تنقية </p&gt; وقد استمدت الأقسام التالية من المختبر TAP سيرافين protocol 12 (http://web.as.uky.edu/Biology/faculty/rymond/BIO%20510/Bertran%20Seraphin%27s%20TAP%20page.pdf ) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء مفتش حبة تنقية تقارب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مفتش sepharose و حبة في حين يتم طرد العينات. غسل 400 ميكرولتر 3X حبة مفتش في أنبوب فالكون 15 مل مع 10 مل الباردة مفتش غسل العازلة. لكل غسل، صخرة الأنبوب برفق لمدة 2 دقيقة، ثم تدور باستمرار حبات في 1،000 x ج لمدة 2 دقيقة أخرى. في نهاية غسل ثالث، وإزالة العازلة وترك فقط حبات في الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل بعناية طاف تطهيرها (~ 15 مل) في أنبوب 15 مل تحتوي على حبات مفتش. احتضان حبات ومزيج المحللة الدماغ في 4 º C على nutator لمدة 2 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد عمود الصغيرة نظيفة وفارغة مع حوالي 15 مل الحجم الإجمالي في غرفة باردة. تحميل الخليط حبة مفتش بصب المزيج بشكل مطرد في العمود؛ ليس محاولة لاعتراض أيفقاعات الهواء داخل العمود. السماح حبات لتسوية في العمود والمخزن المؤقت لاستنزاف ببطء عن طريق تدفق الجاذبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل العمود تماما مع 10 مل من البرد العازلة غسل مفتش بعد كل من المحللة الدماغ قد تدفقت من خلال العمود مفتش تسويتها. تكرار غسل 2X. ملاحظة: لا تدع حبة الجافة في الهواء. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء TEV انشقاق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد غسل الثالث، وغسل العمود مرة أخرى مع 10 مل TEV العازلة الانقسام. هذه الخطوة تعد حبة مفتش أن sequestrates مجمع الطعم لTEV انشقاق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحق قبل آخر قطرة من العازلة TEV على وشك الخروج بالتنقيط، ووضع غطاء على الجزء السفلي من العمود لمنع التدفق، إضافة 1.3 مل TEV العازلة التي تحتوي على 130 وحدة من إنزيم TEV إلى العمود، ثم سقف آمن أعلى العمود. تأكد من اغلاق العمود جيدا في كلا الجانبين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدوير العمود في 18 درجة مئوية لمدة 2 ساعة للسماح للانزيم TEV ليلتصق الببتيد في موقع TEV والافراج عن بروتين معقد مبادرة الخوذ البيضاءلو ترك وراء بروتين الببتيد نطاق منضمة إلى الخرز ومفتش sepharose و. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء كالمودولين حبة تنقية تقارب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد حبات كالمودولين حين يتم تحضين حبات مفتش مع انزيم TEV. تغسل حبات 200 ميكرولتر كالمودولين في 15 مل فالكون 3X أنبوب، في كل مرة مع 10 مل من كالمودولين الباردة العازلة ملزمة. لكل غسل، صخرة بلطف الأنبوب لمدة 2 دقيقة على nutator، ثم تدور باستمرار حبات في 1،000 x ج لمدة 2 دقيقة. في نهاية غسل ثالث، واخراج كل المخزن المؤقت وترك فقط حبات في الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في نهاية الحضانة TEV (الخطوة 3.2.3)، والعودة العمود مفتش مرة أخرى إلى الغرفة الباردة وضعه بشكل مستقيم. اسمحوا حبات تسوية لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الغطاء العلوي ثم السفلي الغطاء، ثم جمع 1.3 مل TEV المنتج الانقسام في أنبوب فالكون 15 مل. السماح للاستنزاف عازلة تماما. إضافة مبلغ إضافي قدره 200 TEV العازلة ميكرولتر إلى العمود على طرد حجم القتلى من العمود، وجمع ومنخفض خارج في نفس الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 4.5 مل من كالمودولين العازلة و 4.5 ميكرولتر 1 M و CaCl 2 ملزما للانشقاق المنتج 1.5 مل TEV جمعت أعلاه. وو CaCl 2 يعمل على عاير على EDTA في المخزن المؤقت TEV. نقل 6 مل الخليط إلى أنبوب يحتوي على حبات كالمودولين وتدوير الأنبوب في 4 º C على nutator لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء عمود الصغيرة نظيفة وفارغة أخرى مع حوالي 10 مل الحجم الكلي في غرفة باردة. تحميل الخليط حبة كالمودولين إلى العمود والسماح لها استنزاف بفعل الجاذبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما تدفقت كل حل من خلال العمود كالمودولين استقر، وغسل العمود مرتين، ولكل منها 10 مل من كالمودولين الباردة العازلة ملزمة. ملاحظة: تجنب إزعاج الخرز كالمودولين ومحاولة للحفاظ على السطح من الخرز شقة ممكن أثناء الغسيل. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أزل مجمع الطعم من العمود كالمودولين. الحق بعد الغسيل، أزل العمود كالمودولين مع خمسة كسور 200 ميكرولتر Calmodu الباردةلين شطف العازلة. لكل جزء، إضافة بلطف 200 ميكرولتر من شطف العازلة إلى العمود وجمع شطافة مع علامة 1.5 مل أنبوب إيبندورف. كرر هذه 4X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل بروتين معقد بواسطة SDS-PAGE <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتخاذ قسامة صغيرة من كل من الكسور خمسة (حوالي 30 ميكرولتر) وإضافة SDS العازلة تحميل. تغلي العينات لمدة 5 دقائق وتحميل العينات جنبا إلى جنب مع الواسمات الجزيئية البروتين في الانحدار (4-15٪) هلام SDS-PAGE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد عينات وحلها بالكامل في هلام، ووقف الكهربائي وصمة عار الجل مع أي حساسية الغروية إجراءات تلطيخ Coomassie مقرها G-250-مثل &#39;الفضة الأزرق&#39; تلطيخ 13. الفضة تلطيخ هو اختياري ولكن ليس الأفضل لأنها ليست متوافقة تماما مع لاحقة تحليل الطيف الكتلي. تخزين ما تبقى من شطافة في الفريزر -80 ° C لمزيد من التحليل مثل مطياف الكتلة للكشف عن هويات الجزيئي للبروتين معقد المنقى. حد ذاتهاالمناقشة الإلكترونية. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Rigaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration.">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nat. Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).</li><li>Collins, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+comprehensive+atlas+of+the+physical+interactome+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Toward a comprehensive atlas of the physical interactome of Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol. Cell. Proteomics. 6, 439-450 (1074).</li><li>Gavin, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+survey+reveals+modularity+of+the+yeast+cell+machinery.">Proteome survey reveals modularity of the yeast cell machinery.</a> Nature. 440, 631-636 (2006).</li><li>Krogan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+landscape+of+protein+complexes+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 440, 637-643 (2006).</li><li>Forler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+protein+complex+purification+method+for+functional+proteomics+in+higher+eukaryotes.">An efficient protein complex purification method for functional proteomics in higher eukaryotes.</a> Nat. Biotechnol. 21, 89-92 (2003).</li><li>Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+protein+complexes+in+Drosophila+with+tandem+affinity+purification-mass+spectrometry.">Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry.</a> Dev. Dyn. 232, 827-834 (2005).</li><li>Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tandem+affinity+purification+technology:+an+overview.">The tandem affinity purification technology: an overview.</a> Biotechnol. Lett. 33, 1487-1499 (2011).</li><li>Volkel, P., Le Faou, P., Angrand, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+proteomics:+characterization+of+protein+complexes+using+tandem+affinity+purification-mass+spectrometry.">Interaction proteomics: characterization of protein complexes using tandem affinity purification-mass spectrometry.</a> Biochem. Soc. Trans. 38, 883-887 (2010).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tandem+affinity+purification+method:+an+efficient+system+for+protein+complex+purification+and+protein+interaction+identification.">The tandem affinity purification method: an efficient system for protein complex purification and protein interaction identification.</a> Protein Expr. Purif. 72, 149-156 (2010).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Bachmann, A., Knust, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+P-element+transposons+to+generate+transgenic+flies.">The use of P-element transposons to generate transgenic flies.</a> Methods Mol. Biol. 420, 61-77 (2008).</li><li>Puig, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tandem+affinity+purification+(TAP)+method:+a+general+procedure+of+protein+complex+purification.">The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24, 218-229 (2001).</li><li>Candiano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+silver:+a+very+sensitive+colloidal+Coomassie+G-250+staining+for+proteome+analysis.">Blue silver: a very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis.</a> Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).</li><li>Tian, X., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+ubiquitin-mediated+pathways+in+regulating+synaptic+development,+axonal+degeneration+and+regeneration:+insights+from+fly+and+worm.">The role of ubiquitin-mediated pathways in regulating synaptic development, axonal degeneration and regeneration: insights from fly and worm.</a> J. Physiol. , (2013).</li><li>Wu, C., Wairkar, Y. P., Collins, C. A., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highwire+function+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction:+spatial,+structural,+and+temporal+requirements.">Highwire function at the Drosophila neuromuscular junction: spatial, structural, and temporal requirements.</a> J. Neurosci. 25, 9557-9566 (2005).</li><li>Wu, C., Daniels, R. W., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DFsn+collaborates+with+Highwire+to+down-regulate+the+Wallenda/DLK+kinase+and+restrain+synaptic+terminal+growth.">DFsn collaborates with Highwire to down-regulate the Wallenda/DLK kinase and restrain synaptic terminal growth.</a> Neural Dev. 2, 16 (2007).</li><li>Tian, X., Li, J., Valakh, V., DiAntonio, A., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Rae1+controls+the+abundance+of+the+ubiquitin+ligase+Highwire+in+post-mitotic+neurons.">Drosophila Rae1 controls the abundance of the ubiquitin ligase Highwire in post-mitotic neurons.</a> Nat. Neurosci. 14, 1267-1275 (2011).</li><li>Burckstummer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+tandem+affinity+purification+procedure+for+interaction+proteomics+in+mammalian+cells.">An efficient tandem affinity purification procedure for interaction proteomics in mammalian cells.</a> Nat. Methods. 3, 1013-1019 (2006).</li><li>Kyriakakis, P., Tipping, M., Abed, L., Veraksa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+affinity+purification+in+Drosophila:+the+advantages+of+the+GS-TAP+system.">Tandem affinity purification in Drosophila: the advantages of the GS-TAP system.</a> Fly. 2, 229-235 (2008).</li><li>Bailey, D., Urena, L., Thorne, L., Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+protein+interacting+partners+using+tandem+affinity+purification.">Identification of protein interacting partners using tandem affinity purification.</a> J. Vis. Exp. (60), e3643 (2012).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+model+for+Angelman+syndrome.">A Drosophila model for Angelman syndrome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 12399-12404 (2008).</li><li>Liao, L., McClatchy, D. B., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shotgun+proteomics+in+neuroscience.">Shotgun proteomics in neuroscience.</a> Neuron. 63, 12-26 (2009).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

يقدم طريقة تنقية تقارب جنبا إلى جنب (وات) بروتوكول تنقية المزدوجة التي تسمح للعزلة وإثراء المجمعات البروتين من خلال خطوتين مستقلة تنقية تقارب. ولا يقتصر تصميم علامة TAP إلى ما يرد في هذا البروتوكول، والمجالات الأخرى ملزمة البروتين والزخارف تنطبق أيضا إذا تم تعديل شروط العازلة وفقا لذلك. وخير مثال على TAP به الآخر هو علامة GS-TAP، وهو مزيج من بروتين G وعزر ملزم streptavidin، الذي صممه مجموعة جوليو Superti-Furga الرامية إلى تنقية معقدة البروتين في خطوط خلايا الثدييات مثقف 18. تم تعديل GS-TAP في وقت لاحق لدراسة التفاعل البروتين البروتين في خلايا ذبابة الفاكهة S2 والأجنة 19. إن الرب منشور صدر مؤخرا عن بيلي وآخرون. أظهرت كيف تم تنفيذ الإجراء GS-TAP مع زراعة الخلايا المحللة 20. نحن هنا قدم استخدام TAP-العلامة في الأنسجة العصبية ذبابة الفاكهة (الإعلانرؤساء ULT) لنطاق واسع فحص البروتين. هذا البروتوكول يمكن تكييفها يحتمل أن الأنسجة الأخرى التي تسمح جمع العينات على نطاق واسع، مثل الأجنة. ويمكن أيضا أن تستخدم الهيئات الكبار جمعها على المنخل العلوي (خطوة 2.3.2.3) لTAP، والتي يمكن أن يكون مهمة صعبة للغاية. يجب أن يتم تعديل وتكييف تحلل العازلة لمنع البروتياز ضخمة موجودة في الجهاز الهضمي في معظم واختصارها الإجراء تنقية الأول بشكل كبير من أجل تقليل زمن التعرض للبروتينات إلى البروتياز. على الرغم من أن العلامات TAP مختلفة تتطلب المناولة المختلفة والظروف عازلة للالتنقيات تقارب، المبادئ العامة لTAP هي نفسها. أدناه نناقش المسائل التي من شأنها أن تؤثر على جودة نتائج TAP. نجاح النهج TAP يعتمد على توليد التحوير الحق. أولا، يجب على علامة TAP نفسها لا تغيير التشكل العام للبروتين الطعم، وهو أمر حاسم في الاحتفاظ بقدرتهاللتفاعل مع شركائها ملزمة الفسيولوجية. وبالتالي، من الأهمية بمكان أن تقرر أين صهر العلامة TAP لهذا الجين من الفائدة. يمكن اتخاذ قرار بناء على الدراسات السابقة من البروتين، وخصوصا المعلومات حول هيكلها أو الجينات المحورة الموسومة epitode الوظيفية. في حالة مثل هذه المعلومات غير متوفرة، ووضع علامات البروتين في الطعم أو N-C-محطة بالتوازي ينصح. ثم تجارب الانقاذ وظيفية لا يمكن أن يؤديها لتحديد أي التحوير ينبغي استخدامها. ثانيا، ينبغي أن مستويات التعبير من البروتين المعدلة وراثيا أن تكون قريبة من البروتين الذاتية. هذا مهم خاصة أن نظام GAL4/UAS تدفع عادة للتعبير عن التحوير في توقيت مختلف وعلى مستوى أعلى بكثير بالمقارنة مع البروتينات الذاتية، والتي قد إما زيادة ايجابيات كاذبة أو يسبب عواقب غير متوقعة تغير الملف الشخصى التفاعل البروتين الشبكات في الخلايا. على سبيل المثال، قد overexpressing البروتينات سقالات مركز دراسات الوحدة العربيةه الآثار السلبية المهيمنة وoverexpressing البروتينات التي تمتلك الأنشطة الأنزيمية، مثل تحركات، في كثير من الأحيان يسبب زيادة من وظيفة الآثار، وكلاهما قد بدوره يؤثر على قدرة الشركاء ملزمة الذاتية الخاصة بهم للتفاعل معها. وبالتالي، فإن نظام GAL4/UAS يجب تجنبها عند توقيت ومستوى التعبير عن الجينات في المصالح أمر بالغ الأهمية للحفاظ على التفاعلات الذاتية التي تقدم فقط في ظل ظروف طبيعية. بدلا من ذلك، ينبغي أن تسيطر التعبير عن التحوير الموسومة TAP تحت المروج الخاصة. ويمكن تحقيق ذلك إما عن طريق استبدال تسلسل UAS مع تسلسل المروج الذاتية، أو عن طريق التفجير تسلسل TAP في الإطار مع تسلسل exonal في جزء الحمض النووي الجيني الذي يحتوي على مواضع كاملة من الجينات في المصالح 21. في بعض الحالات، فإن التجربة التونسية يمكن أن يؤديها في فقدان وظيفة خلفية متحولة من الجينات في المصالح للحد من المنافسة من البروتين الذاتية للالمؤتمر الوطني العراقيorporating في المجمعات multiprotein. لهذا المثال، خلفية فارغة البروتين، إن وجدت، ويوفر حالة مثالية للقضاء تماما على البروتين الذاتية. وسوف تستخدم الخلفية متحولة الوراثية دائما زيادة فرصة لتحقيق نتائج ذات جودة أعلى. ذوبان البروتين الطعم هو عامل حاسم آخر للنجاح. وتستخدم المنظفات غير أيوني عادة في تحلل العازلة لإذابة غشاء البلازما والإبقاء على بروتين معقد، قابل للذوبان وسليمة، في الحالة التي هي قريبة من البيئة الفسيولوجية. ولكن اعتمادا على ما إذا كان أو لم يكن البروتينات ذات الاهتمام هي بروتينات أو المرتبطة متكاملة الغشاء، يمكن تكوين وتركيز المنظفات غير أيوني تكون حاسمة لsolubilizing البروتين الطعم. 0.1-0.3٪ NP40 غالبا ما تكون كافية لذوبان البروتينات عصاري خلوي. للبروتينات الغشاء، وهو مزيج من NP40 (0.1-1٪)، NaDOC (0.1-1٪)، وتريتون X-100 (،05-،5٪) مطلوب في بعض الأحيان إلى solubiليز وإثراء ما يكفي من البروتينات للتجربة التونسية. ومع ذلك، منذ العازلة تحلل صارمة تميل إلى تعطيل أضعف البروتين البروتين التفاعلات، يحتاج إلى توازن التي سيتم التوصل إليها في البروتينات التي الطعم بما فيه الكفاية القابلة للذوبان الموجودة في العينة، وفي الوقت نفسه يتم الحفاظ على غالبية تفاعلات البروتين البروتين. والمبدأ العام هو أن نحاول دائما إلى استخدام أقل عدد من أنواع المنظفات بأقل تركيز. لتسهيل استكشاف الأخطاء وإصلاحها، فإنه يوصى بشدة لحفظ قسامة صغيرة من العينة من كل خطوة من التنقيات اثنين. اللاحقة SDS-PAGE والبروتين تلطيخ / تحليل الغربية على مأخوذة تسمح مستويات البروتين الطعم وتخصيب متتابعة من الأنواع البروتين معينة ليتم رصدها. على سبيل المثال، إذا تم الكشف عن انخفاض مفاجئ من البروتين الطعم في قسامة من تدفق المغادرة بعد انشقاق TEV (الخطوة 3.3.3)، فمن المرجح أن البروتين الطعم ضاعت خلال مفتش حبة الغسيل (الخطوة 3.1.4) . A POSSالسبب إيبل قد يكون تركيبة المنظفات عدم كفاية غسل العازلة مفتش. هناك انخفاض حاد على تكوين وتركيز المنظفات في غسل العازلة مفتش (0.1٪ NP-40 فقط) بالمقارنة مع تحلل العازلة. قد يكون الطعم البروتين الحساسة لهذه التغيرات وتنأى عن شاردة مفتش على الخرز. ضبط غسل مفتش نحو تحلل العازلة قد تساعد في حل المشكلة. بدلا من ذلك، على الرغم من أن أقل احتمالا، وانشقاق TEV (الخطوة 3.2) قد لا يكون عملت بما فيه الكفاية للافراج عن مجمع يحتوي على الطعم من الخرز مفتش. الخطوات تستحق التفتيش الثانية هي موازنة من الخرز مفتش مع العازلة TEV (الخطوة 3.2.1) ونشاط انزيم، سوء قد أمات الانزيم. نأخذ في الاعتبار أنه حتى مع تنقية من خطوتين، وسوف تكون هناك ايجابيات كاذبة والبروتينات التي يتم هدم الحاضر nonspecifically في مجمع تنقية TAP النهائي. طريقة واحدة لتحديد تلك التفاعلات غير محددة، فيالأقل جزئيا، هو لتشمل TAP التحكم باستخدام التحوير TAP فقط بالتوازي مع الموسومة TAP-التحوير في تجارب تنقية TAP. يجب إزالة البروتينات التي تم تحديدها في الإجراء-TAP فقط من القائمة التي تم تحديدها في تنقية TAP-التحوير. وهناك TAP ناجحة تنقية خليط من البروتينات التي يحتمل أن تكون مرتبطة بروتين من الفائدة في الجسم الحي. فإن الخطوة التالية هي تحديد الجزيئية لهذه البروتينات، ويستخدم الطيف الكتلي عادة لهذا الغرض. اعتمادا على نتائج من SDS-PAGE واحتياجات التجربة، ويمكن تحديد الهويات الجزيئية في مجمع البروتين النقي في اثنين من الطرق التالية: 1) يمكن قطع كل فرقة البروتين الفردية للخروج من الجل وتعرض لأدنى مستوى LC-MS/MS التعقيد، أو 2) الكسر أزل التي تحتوي على محتوى البروتين الذروة (عادة شطف الثانية) يمكن أن يتعرض مباشرة الى متوسطة التعقيد LC-MS/MS. هذا ع النار بندقيةسوف نهج roteomic يحتمل تحديد جميع البروتينات في المجمع، اعتمادا على مجموعة ديناميكية من MS المعدات 22. وباختصار، فإننا نقدم وسيلة لتحديد تفاعلات البروتين البروتين في الأنسجة العصبية من طراز كائن الوراثية - ذبابة الفاكهة. هناك عدد من المزايا من تطبيق طريقة لTAP الطاير: 1) ذباب الفاكهة لها دورة حياة قصيرة، ولذلك فمن سريعة وسهلة نسبيا لتوليد الذباب المعدلة وراثيا والحصول على الأنسجة في كمية كبيرة، وكلاهما تعتبر حيوية بالنسبة لTAP النهج؛ 2) ومشروحة الجينوم ذبابة كاملة ويحتوي على 70٪ من الجينات المسببة للأمراض البشرية، و3) الأهم من ذلك، فمن السهل للتحقق من صحة وظيفيا وتميز المرشح التفاعل البروتينات في الذباب. هناك موارد الشاملة المتاحة في المجتمع البحثي ذبابة لتوصيف جين معين، مثل القائم على جمع رني المعدلة وراثيا مفيدة لدراسة الأنسجة محددة الخسارة من وظيفة أغلبية الجيناتق، الأليلات الطافرة ونقص لمعظم مواضع الجينات، وكذلك استنساخ [كدنا] والجينات المحورة مفيدة لتحقيق مكاسب من وظيفة الدراسات. نحن نعتقد أن الطريقة ذبابة TAP سيكون إضافة قيمة إلى صندوق الأدوات المستخدمة في مختبرات الطاير. في منظور المستقبل، وهذه الطريقة يمكن دمجها مع ذبابة النماذج السلوكية والنماذج الأمراض التي تصيب البشر، لفحص التغير في البروتين البروتين شبكة التفاعل استجابة لظروف ومؤثرات معينة.

تحديد المسارات الجزيئية أو الشبكات التي تتوسط عملية بيولوجية معينة هي واحدة من الأهداف النهائية للبحوث الطبية الحيوية. يطير علماء الوراثة قد تعتمد اعتمادا كبيرا على الوراثة إلى الأمام، وخاصة معدل شاشات الجينية (سواء محسن وشاشات القامع)، لتحديد العوامل التي تعمل معا، بالتوازي مع، أو المنبع أو المصب من الجينات في المصالح. ومع ذلك، وشاشات الوراثة إلى الأمام في كثير من الأحيان تفشل مرات لتحديد الجينات الأساسية التي، عندما تحور، يسبب الفتك في مراحل النمو المبكرة، أو الجينات مع التكرار وظيفية والتعويض الذي يسبب فقدان وظيفة العيوب الخفية التي هي سكنت الشباك فقط. طريقة واحدة للتغلب على هذه الصعوبة هو للكشف عن مباشرة تفاعلات البروتين البروتين. لأكثر من عقد من الزمن، قائمة متزايدة من أساليب الكيمياء الحيوية، بما في ذلك الخميرة اثنين الهجين، وعرض فج والكيميائية عبر ربط، المشارك IP، جنبا الى جنب الانجذاب تنقية (وات)، الخ. وقد استخدمت للتحقيق في البروتينتفاعلات البروتين. كل من هذه الأساليب لديها مجموعة من نقاط القوة والضعف في ما يخص الحساسية والنوعية. فيما بينها، ويسمح أسلوب TAP للكشف عن التفاعل المادي في ظل ظروف شبه الفسيولوجية، ويحافظ على خصوصية والاتساق 2 ويشمل القدرة على تمتد إلى الإنتاجية العالية يحلل 3،4. طريقة TAP وضعت أصلا من قبل الزملاء في الخميرة Rigautand 1. في هذه الطريقة، يتم التعبير عن بروتين في المصالح مع علامة TAP. علامة TAP تؤوي اثنين من المستقلين ملزم تقارب المجالات: بروتين A المجال الذي يربط مفتش ومجال كالمودولين ملزم. يتم فصل اثنين من المجالات من قبل TEV (التبغ إحفر الفيروسات) موقع الانقسام. مثل هذا الجمع يسمح للجولتين مستقلة عن التنقيات تقارب بما فيه الكفاية للحد من الارتباطات غير محددة وإثراء الارتباطات محددة 1. لهذا المثال، الأسلوب TAP هو metho قوية جداد لتحديد التفاعلات في الجسم الحي من بروتين معين، على الرغم من overexpressing البروتين الخارجية قد جعلها أكثر عرضة للربط مع البروتينات التي تفعل عادة يست معقدة مع نظيرتها المحلية. منذ تطورها، وقد تم تطبيق الأسلوب TAP في العديد من الأنظمة الأخرى، بما في ذلك المستندة إلى خلية ثقافة النظم 5،6 وغيرها من النظم في الجسم الحي نموذج 6-9. نحن هنا وصف التكيف للأسلوب TAP في ذبابة الفاكهة. علينا أولا توليد pUAST-NTAP وpUAST-CTAP ناقلات لتسهيل الاستنساخ والانصهار للعلامة TAP إما إلى N-أو C-محطة من الجينات في المصالح. ثم يتم أعرب الموسومة TAP UAS التحوير في الجهاز العصبي تحت سيطرة السائق GAL4 العصبية 10. المقبل، وسيتم جمع عدد كبير من رؤساء ذبابة الكبار، التي لديها نسبة عالية من الخلايا العصبية وسهلة لفصل من أجزاء أخرى من الجسم بعد تجميد بناء على حجم الخلافات. رؤساء الكبار هي المتجانس وتطهيرها بcentrifugations متتابعة ذ، وطاف يخضع لإجراء TAP هو موضح أدناه.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="697">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">U.S.A. standard test sieve No. 25</td>
			<td style="width:104px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">04-881-18&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">U.S.A. standard test sieve No. 40</td>
			<td style="width:104px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">04-881-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Kontes Dounce Tissue Grinders 15 ml</td>
			<td>Kimble Chase</td>
			<td>885300-0015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IgG sepharose beads</td>
			<td>Pharmacia</td>
			<td style="width:119px;">17-0969-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Econo-column 0.7 cm x 20 cm</td>
			<td style="width:104px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">737-4721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Econo-column 0.5 cm x 15 cm</td>
			<td style="width:104px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">737-4716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calmodulin beads</td>
			<td style="width:104px;">Stratagene</td>
			<td style="width:119px;">214303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coors Mortar and Pestle</td>
			<td style="width:104px;">CoorsTek</td>
			<td>60311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AcTEV Protease</td>
			<td style="width:104px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">12575-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:104px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease Inhibitor Mix</td>
			<td style="width:104px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying protein-protein interaction in drosophila adult heads by tandem affinity purification (tap)

جعلت شاشات الجينية التي أجريت باستخدام ذبابة الفاكهة السوداء البطن (ذبابة الفاكهة) العديد من الاكتشافات بارزة في تقدم العلوم البيولوجية. ومع ذلك، تم استكشاف استخدام شاشات البيوكيميائية التي تهدف إلى توسيع نطاق المعرفة المكتسبة من التحليل الجيني في الآونة الأخيرة فقط. نحن هنا تصف طريقة لتنقية معقدة البروتين الذي الزميلة مع أي بروتين من الفائدة من رؤساء ذبابة الكبار. هذا الأسلوب يستفيد من نظام ذبابة الفاكهة GAL4/UAS للتعبير عن البروتين الطعم تنصهر مع علامة جنبا الى جنب الانجذاب تنقية (وات) في الخلايا العصبية ذبابة في الجسم الحي، ومن ثم تطبق جولتين من تنقية باستخدام إجراء TAP مماثلة لتلك التي أنشئت أصلا في الخميرة 1 لتنقية معقدة البروتين التفاعل. في نهاية هذا الإجراء، يتم الحصول على خليط من البروتين المجمعات متعددة الذي يمكن تحديده من خلال مطياف الكتلة الهويات الجزيئية. سوف المصادقة على البروتينات مرشح الاستفادة من صesource وسهولة أداء الخسارة من وظيفة الدراسات في الذباب. نهج مماثلة يمكن تطبيقها على الأنسجة ذبابة أخرى. ونحن نعتقد أن الجمع بين التلاعب الجيني وهذا النهج البروتين في النظام النموذجي ذبابة يحمل إمكانات هائلة لمعالجة المشاكل الأساسية في مجال بيولوجيا الأعصاب وخارجها.

نحن هنا لشرح الجهود التي نبذلها في تحديد البروتينات موقع HighWire-التفاعل في الدماغ الطاير. موقع HighWire (HIW) والفقاريات واللافقاريات المتماثلات لها هي ligases اليوبيكويتين الضخمة التي تنظم تطوير وإصلاح الجهاز العصبي 14. أنها تشترك في عدد من المجالات الوظيفية حفظا للغاية. ومع ذلك، أفعالهم الجزيئية ليست واضحة تماما. العمل المنجز في دودة، ويطير وأدى الماوس إلى نموذج العمل الحالي الذي يعمل بمثابة يغاز HIW E3 وكما بروتين السقالات لتسهيل تشكيل مجمع ubiquitination متعددة الوحيدات، الذي ينظم نوع محدد ظائف الخلايا العصبية والخلايا وقت من خلال مزيج من التفاعل مع العوامل المساعدة المختلفة، واستهداف ركائز اليوبيكويتين مختلفة. لتحديد مجمع ubiquitination HIW المصاحب، ونحن ولدت لأول مرة N-محطة الموسومة التحوير UAS-TAP-HIW أن تعمل بكامل طاقتها في إنقاذ النمط الظاهري متحولة HIW 15. حوالي 10 غرام من الكبار فلوريدا<html> تم جمع رؤساء ذ التي تعبر عن TAP TAP-فقط أو HIW البروتينات المعدلة وراثيا وتعرض لإجراءات الجانب TAP إلى جنب كما هو موضح أعلاه. وقد تم تحليل eluates النهائي من كلا التنقيات بواسطة SDS-PAGE ثم الفضة تلطيخ. حدد قياس الطيف الكتلي قائمة من البروتينات في عينة TAP-HIW فقط، بما في ذلك ذبابة الفاكهة FSN (DFsn، وهو البروتين F-مربع) وRae1 (الشكل 2). وكشفت التحليلات الجينية والبيوكيميائية اللاحقة التي HIW وDFsn العمل معا كما SCF-E3 معقدة مثل يغاز اليوبيكويتين لتنظيم هيكل متشابك وظيفة 16، والزميلة Rae1 مع HIW في الجسم الحي ويقيد فرط متشابك 17. هذه الوظيفة من Rae1 على الأقل من خلال قدرتها على تعزيز الاستقرار HIW البروتين عن طريق حماية HIW من تدهور ذاتية البلعمة، والذي يكشف عن آلية الرواية التي تسيطر بشكل انتقائي HIW البروتين وفرة خلال تطوير متشابك 17 تحقق جزئيا. gether.within صفحة = &quot;دائما&quot;&gt; <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50968/50968fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50968/50968fig1.jpg" width="600px" /> الشكل 1. المتجهات لتوليد-TAP الموسومة الذباب المعدلة وراثيا. (A) وخريطة للpUAST-NTAP بناء. (ب) خريطة للpUAST-CTAP بناء. يتم وضع علامة على المواقع استنساخ متعددة (MCS) في كل من يبني مع شريحة، حيث يتم عرض المواقع تقييد واحد قطع مع اللون الأحمر. (C) تسلسل الأولية تبين مواقع الاستنساخ متعددة من ناقلات TAP مع إطار القراءة للعلامة TAP. لتسهيل subcloning، يتم إنشاء اثنين من أكثر البنى NTAP من الأصل pUAST-NTAP: pUAST-NTAP +1 وpUAST-NTAP +2. معا NTAP ثلاثة يبني يغطي جميع الأطر القراءة الثلاثة الممكنة لاستيعاب استخدام MCS. هي التي شيدت جميع ناقلات باستخدام NTAP أو شظايا CTAP ولدت أصلا فيلاب سيرافين 1. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50968/50968fig1highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.</a> <img alt="الرقم 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50968/50968fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50968/50968fig2.jpg" width="400px" /> . الرقم 2 تنقية موقع HighWire-التفاعل البروتينات من الدماغ عن طريق ذبابة تنقية TAP رؤساء الكبار من الذباب معربا عن TAP. (BG380-GAL4؛ UAS-TAP) أو TAP-HIW (BG380-GAL4؛ UAS-TAP-HIW) في الجهاز العصبي يتم جمعها، المتجانس، وتعرض لتنقية TAP، على التوالي. تم تحليل eluates النهائي ذات بعد واحد هلام SDS-PAGE تليها الفضة تلطيخ. رأس السهم يشير إلى الطعم البروتين HIW والنجمة يشير إلى وجود البروتين TAP اقتطاع بسبب الانقسام TEV. في العينة TAP-HIW، ويتم تحديد قائمة من البروتينات التي كتبها الشاملالطيف، بما في ذلك شهادة الثانوية العامة-70، β-تويولين، Rae1 وDFsn (المشار إليها السهام). يتم تعديل هذا الرقم من الشكل 1A تيان آخرون 17 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50968/50968fig2highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><colgroup><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="22"><td> العازلة </td><td> تركيب </td><td> تعليقات </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> تحلل العازلة </td><td style="width:387px;"> 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.5 </td><td> ملاحظة: 1) إضافة DTT والبروتيني ومثبطات proteasome وفقط قبل الاستخدام. </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td style="width:387px;"> 125 ملي مول كلوريد الصوديوم </td><td> 2) عرض هنا هو تحلل العازلة مع 0.5٪ NP40. انظر مناقشة للتعديلات على المنظفات غير أيوني. </tد&gt; </tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td style="width:387px;"> 5٪ الجلسرين </td><td></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td style="width:387px;"> 0.5٪ NP40 </td><td></td></tr><tr height="25"><td height="25" style="height:25px;"></td><td style="width:387px;"> 1.5 ملي MgCl 2 </td><td></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td style="width:387px;"> 25 ملي ناف </td><td></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td style="width:387px;"> 0.2 ملي DTT </td><td></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td style="width:387px;"> (وفيما يلي البروتيني وproteasome ومثبطات) </td><td></td></tr><tr height="25"><td height="25" style="height:25px;"></td><td style="width:387px;"> 1 ملم نا 3 VO 4 </td><td></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td style="width:387px;"> 0.05 ملي MG-115 </td><td></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td style="width:387px;"> 1 ملم PMSF </td><td></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td style="width:387px;"> البروتيني مزيج المانع (سيغما P8340) </td><td></td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;"></td><td style="width:387px;"> مثبط البروتياز كوكتيل (روش 04693159001) </td><td></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> مفتش غسل العازلة </td><td> 10 ملي تريس، الكلور ودرجة الحموضة 8.0 (0.5 مل من 2 M الأسهم) </td><td></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 150 ملي مول كلوريد الصوديوم (3 مل من 5 M الأسهم) </td><td></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 0.1٪ NP40 (1.0 مل من الأسهم 10٪) </td> &lt;الدفتيريا&gt; </td></tr><tr height="25"><td height="25" style="height:25px;"></td><td> H 2 0 إلى 100 ​​مل النهائي </td><td></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> عازلة انشقاق TEV </td><td> 10 ملي تريس، الكلور ودرجة الحموضة 8.0 (0.5 مل من 2 M الأسهم) </td><td> ملاحظة: إضافة DTT فقط قبل الاستخدام. </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 150 ملي مول كلوريد الصوديوم (3 مل من 5 M الأسهم) </td><td></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 0.1٪ NP40 (1.0 مل من الأسهم 10٪) </td><td></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 0.5 ملي EDTA (100 ميكرولتر من 0.5 M الأسهم) </td><td></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 1 ملم DTT (100 ميكرولتر من 1 M الأوراق المالية) </td><td></td></tr><tr height="25"><td height="25" style="height:25px;"></td><td> H 2 O إلى 100 ​​مل النهائي </td><td></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> العازلة ملزمة كالمودولين </td><td> 10 ملي β-المركابتويثانول (69.7 ميكرولتر من الأسهم) </td><td></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 10 ملي تريس، الكلور ودرجة الحموضة 8.0 (0.5 مل من 2 M الأسهم) </td><td></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 150 ملي مول كلوريد الصوديوم (3 مل من 5 M الأسهم) </td><td></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 1 ملي المغنيسيوم خلات (100 ميكرولتر من 1 M الأوراق المالية) </td><td></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 1 ملي إيميدازول (100 ميكرولتر من 1 M الأوراق المالية) </td><td></td></tr><tr height="25"><td height="25" style="height:25px;"></td><td> 2 مم CaCl 2 (200 ميكرولتر من 1 M الأوراق المالية) </td><td></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 0.1٪ NP40 (1 مل من الأسهم 10٪) </td><td></td></tr><tr height="25"><td height="25" style="height:25px;"></td><td> H 2 O إلى 100 ​​مل النهائي </td><td></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> العازلة كالمودولين شطف </td><td> 10 ملي β-المركابتويثانول (69.7 ميكرولتر من الأسهم) </td><td></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 10 ملي تريس، الكلور ودرجة الحموضة 8.0 (0.5 مل من 2 M الأسهم) </td><td></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 150 ملي مول كلوريد الصوديوم (3 مل من 5 M الأسهم) </td><td></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 1 ملي المغنيسيوم خلات (100 ميكرولتر من 1 M الأوراق المالية) </td><td></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 1 ملي إيميدازول (100 ميكرولتر من 1 M الأوراق المالية) </td><td></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 10 ملي EGTA (2 مل من 0.5 M الأسهم) </td><td></td></tr><trارتفاع = &quot;21&quot;&gt; <td height="21" style="height:21px;"></td><td> 0.1٪ NP40 (1 مل من الأسهم 10٪) </td><td></td></tr><tr height="25"><td height="25" style="height:25px;"></td><td> H 2 O إلى 100 ​​مل النهائي </td><td></td></tr></tbody></table> الجدول 1. تكوين مخازن.

Watch this Scientific Journal Video about Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP at JoVE.com

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

ذبابة الفاكهة تشتهر التلاعب وراثية قوية، ولكن ليس لمدى ملاءمتها من التحليل المتعمق البيوكيميائية. هنا نقدم الداخلي القائم على TAP لتحديد الشركاء التفاعل من أي بروتين من الفائدة من الدماغ الطاير. يمكن لهذا الإجراء أن تؤدي إلى طرق جديدة للبحث.

تحديد البروتين البروتين التفاعل في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; رؤساء الكبار حسب جنبا الى جنب الانجذاب تنقية (وات)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

identifying-protein-protein-interaction-drosophila-adult-heads-tandem

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

13.8K Views.  Louisiana State University Health Sciences Center.  ذبابة الفاكهة تشتهر التلاعب وراثية قوية، ولكن ليس لمدى ملاءمتها من التحليل المتعمق البيوكيميائية. هنا نقدم الداخلي القائم على TAP لتحديد الشركاء التفاعل من أي بروتين من الفائدة من الدماغ الطاير. يمكن لهذا الإجراء أن تؤدي إلى طرق جديدة ...

Video: Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite morphogenesis at the functional and molecular levels. To aid in these analyses, we have developed a strategy for the isolation of a subclass of PNS neurons called dendritic arborization (da) neurons that have been widely used for studying dendrite morphogenesis1,2. These neurons are very difficult to isolate as a pure population, due in part to their extremely low occurrence and their difficult-to-reach location below the tough chitinous larval cuticle. Our newly developed method overcomes these challenges, and is based on a fast and specific cell enrichment using antibody-coated magnetic beads. For our magnetic bead sorting studies, we have used age-matched third instar larvae expressing a mouse CD8 tagged GFP fusion protein (UAS-mCD8-GFP)3 under the control of either the class IV dendritic arborization (da) neuron-specific pickpocket (ppk)-GAL4 driver4 or the control of the pan-da neuron-specific GAL421-7 driver5. Although this protocol has been optimized for isolating PNS cells which are attached to the inner wall of the larval cuticle, by varying a few parameters, the same protocol could be used to isolate many different cell types attached to the cuticle at larval or pupal stages of development (e.g. epithelia, muscle, oenocytes etc.), or other cell types from larval organs depending upon the GAL4-specific driver expression pattern. The RNA isolated by this method is of high quality and can be readily used for downstream genomic analyses such as microarray gene expression profiling studies. This approach offers a powerful new tool to perform studies on isolated Drosophila dendritic arborization (da) neurons thereby providing novel insights into the molecular mechanisms underlying dendrite morphogenesis.

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In this video-article we present a method for the isolation and purification of Drosophila peripheral neurons using a fast magnetic bead assisted cell sorting strategy. RNA obtained from the isolated cells can be readily used for downstream applications including microarray analyses.

عزل وتنقية ذبابة الفاكهة الخلايا العصبية الطرفية بواسطة حبة فرز المغناطيسي

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

متعامد تنقية البروتين الميسر عن طريق بطاقات تقارب Bispecific الصغيرة

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

تحديد الشركاء البروتين عن طريق التفاعل جنبا الى جنب الانجذاب تنقية

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

لونين عزل من قبل تنقية الحمض النووي الريبي (السقسقة)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein labeled, this method can be implemented for the investigation of protein-protein interactions. It is based on one hand on the recognition of the tagged protein by cobalt coated magnetic beads and on the other hand on the interaction between the tagged protein and a second specific protein that is labeled. First, the labeled and tagged proteins are mixed and incubated at room temperature. The magnetic beads, that recognize the tag, are added and the bound fraction of labeled protein is separated from the unbound fraction using magnets. The amount of labeled protein that is captured can be determined in an indirect way by measuring the signal of the labeled protein remained in the unbound fraction. The described liquid phase affinity assay is extremely useful when conformational conversion sensitive proteins are assayed. The development and application of the assay is demonstrated for the interaction between poliovirus and poliovirus recognizing nanobodies1. Since poliovirus is sensitive to conformational conversion2 when attached to a solid surface (unpublished results), the use of ELISA is limited and a liquid phase based system should therefore be preferred. An example of a liquid phase based system often used in polioresearch3,4 is the micro protein A-immunoprecipitation test5. Even though this test has proven its applicability, it requires an Fc-structure, which is absent in the nanobodies6,7. However, as another opportunity, these interesting and stable single-domain antibodies8 can be easily engineered with different tags. The widely used (His)6-tag shows affinity for bivalent ions such as nickel or cobalt, which can on their turn be easily coated on magnetic beads. We therefore developed this simple quantitative affinity capture assay based on cobalt coated magnetic beads. Poliovirus was labeled with 35S to enable unhindered interaction with the nanobodies and to make a quantitative detection feasible. The method is easy to perform and can be established with a low cost, which is further supported by the possibility of effectively regenerating the magnetic beads.

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. It is a reliable technique based on the interaction between magnetic beads and tagged proteins (e.g. nanobodies) on one hand and the affinity between the tagged protein and a second, labeled protein (e.g. poliovirus) on the other.

تقارب المرحلة السائلة الفحص التقاطها باستخدام الخرز المغناطيسي لدراسة البروتين البروتين التفاعل: المثال فيروس شلل الأطفال، Nanobody

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

تحديد بروتين في مجمعات<em&gt; كولاي</em&gt; استخدام المتعاقبة تنقية تقارب الببتيد في تركيبة مع جنبا إلى جنب الطيف الكتلي

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

تنقية النصوص والأيضات من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; رؤساء

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

البروتين طريقة خالية من تنقية تجليد تحديد الانجذاب من قبل Thermophoresis الميكروسكيل

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

في فيفو تتبع 4 الأبعاد للالجذعية المكونة للدم والسلف الكبار في خلايا الفأر قبي نخاع العظم

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

تحديد مواقع التفاعل البروتين البروتين عن طريق الببتيد صفائف

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...