نشكر آن ماري ديون-كوت للمناقشات التي تؤدي إلى تطوير الأسلوب. JK وRB هي FQNRT العلماء الدكتوراه، M.-MG هو باحث فانييه CIHR، وJ.-YM هو أحد كبار الباحثين FRSQ. وأيد هذا العمل من جانب صناديق من العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث لJY. M.

1. إنتاج المؤتلف الفيروسة العصوية يتم إنشاؤها لمراقبة الحشرات باستخدام نظام التعبير الفيروسة العصوية باك إلى باك من إينفيتروجن أساسا وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة مع تعديلات طفيفة فقط: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تم إنشاء تعديل pFastBac1 ناقلات (GIBCO، والحياة) الذي يحتوي على GST-وصاحب العلامات (الشكل 2). الموقع MultiCloning (MCS) من PET-52B (+) ناقلات (Novagen)، تحتوي على 10xHis علامة، تم إدراجها في MCS من ناقلات pFastBac1 لتوليد pFastBac1-بكتيريا-10xHis. وكان تسلسل MCS-52B الحيوانات الأليفة (+) PCR تضخيم بين المواقع تقييد XbaI وBlpI، إضافة موقع تقييد BglII في 5 &#39;أقصى وموقع تقييد HindIII في 3&#39; أقصى. ثم تم استنساخ المنتج PCR بين BamHI وHindIII موقع تقييد pFastBac1، وذلك باستخدام توافق BamHI وBglII تسلسل قيود. منذ كان الهدف هو توليد pFastBac1 السماح للتعبير عنالبروتين المؤتلف مع streptavidin و10xHis-العلامات، وكان موقع تقييد BamHI من PET-52B (+) لا تستخدم تسلسل MCS. أيضا، لم يستخدم موقع تقييد XbaI لتجنب التكرار من المواقع قيود التي تحدث بين المواقع بالفعل في MCS من pFastBac1 وهذه إدراجها مع MCS من PET-52B (+). ثم تم إدراج تسلسل الترميز GST مع موقع PreScission البروتياز الاعتراف (LeuGluValLeuPheGln / GlyPro) في pFastBac1-بكتيريا-10xHis. تسلسل GST كدنا] من pGEX-6P-2 (GE للرعاية الصحية) تم تضخيم PCR مع الاشعال تحتوي على راسي وKpnI مواقع التقييد في 5 &#39;و 3&#39; الأطراف، على التوالي. موقع روسي يسمح بإضافة كودون البداية ولكن أيضا ألانين إلى GST. ثم تم استنساخ المنتج PCR في pFastBac1-بكتيريا-10xHis بين المواقع تقييد راسي وKpnI، مما أدى إلى حذف Streptavidin البطاقات. كان اسمه الانصهار ناقلات جديدة وبالتالي الحصول على pFastBac1-GST-10xHis. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استنساخ [كدنا] الترميز للعلاقات العامةotein من الفائدة في ناقلات pFastBac-GST-10xHis بين ضريبة السلع والخدمات (N-محطة) وصاحب العلامة (C-محطة). كن حذرا لإزالة كودون وقف كدنا] للسماح للاندماج مع محطة C صاحب العلامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل E. القولونية DH10Bac مع pFastBac المؤتلف (حصلت عليه في الخطوة 1.2) لتوليد bacmid. السماح لتنمو المستعمرات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، وعدة ساعات في 30 درجة مئوية على لوحات تحتوي على اختيار Bluo غال وIPTG (10 ميكروغرام / مل تتراسايكلين، 50 ميكروغرام / مل الكاناميسين، 7 ميكروغرام / مل جنتاميسين، و 100 ميكروغرام / مل Bluo- غال، 40 ميكروغرام / مل IPTG). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتقاء وrestreak 2 مستعمرات بيضاء (من الخطوة 1.3) على لوحات مختارة لتأكيد النمط الظاهري الأبيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطعيم 2 مل من LB تحتوي على 10 ميكروغرام / مل تتراسايكلين، 50 ميكروغرام / مل الكاناميسين، 10 ميكروغرام / مل جنتاميسين مع اثنين من المستعمرات بيضاء من الخطوة 1.4 والسماح لهم تنمو بين عشية وضحاها في إطار التحريض (250 دورة في الدقيقة) عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل تنقية الحمض النووي bacmid، تكوير البكتيريا من الخطوة 1.5،resuspend الخلايا في 300 ميكرولتر من الحل الأول وإضافة 300 ميكرولتر من الحل الثاني (Maxiprep عدة من في Qiagen). احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، إضافة 300 ميكرولتر من 3 M KOAc درجة الحموضة 5.5 واحتضان لمدة 10 دقيقة على الجليد. الطرد المركزي العينات في 4 درجات مئوية، وأقصى سرعة لمدة 10 دقيقة. إضافة 800 ميكرولتر من الأيزوبروبانول إلى supernatants واحتضان لمدة 10 دقيقة على الجليد. الطرد المركزي العينات لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية، ويغسل بيليه مع 500 ميكرولتر من الايثانول 70٪. السماح بيليه الجافة و resuspend تحت ظروف معقمة في 40 ميكرولتر من EDTA تريس، ودرجة الحموضة 8.0. يجب أن يتم تخزين الحمض النووي bacmid في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تولد لمراقبة الحشرات كما هو موضح في بروتوكول الشركة المصنعة. يمكن تخزينها لمراقبة الحشرات في 4 درجات مئوية محمية من الضوء. </li></ol> 2. المؤتلف التعبير البروتين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل اختيار الأكثر كفاءة الفيروسة العصوية لتنقية ورصد أي وقت يتم الوصول إلى الذروة من البروتين التعبير، إجراء فحص الإصابة مصغرة لق يلي: تصيب 2 × 10 7 من المصابين Sf9 الخلايا المستزرعة في 27 درجة مئوية في وسائل الإعلام غريس (تستكمل مع FBS 10٪ و 1٪ P / S) مع 133 ميكرولتر (1/150) من الفيروسة العصوية. جمع aliquots من 1.5 مل في 0، 24، 48، و 72 ساعة بعد العدوى. بيليه الخلايا وتحليل مستوى التعبير عن بروتين من الفائدة عن طريق النشاف الغربية باستخدام الأجسام المضادة للعلامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الفيروسة العصوية الأكثر كفاءة من الخطوة 2.1 لتصيب الدوار تحتوي على 1.0 × 10 6 خلايا Sf9 لكل مل في 500 مل من وسائل الإعلام مع نسبة 1/150 بين الفيروس وسائل الإعلام. السماح للخلايا المصابة تنمو في التعليق حتى 27 درجة مئوية وحصاد الخلايا عند بلوغ الحد الأقصى للتعبير البروتين (كما هو محدد في الخطوة 2.1 أعلاه). الخلايا مكعبات يمكن تخزينها في -80 درجة مئوية حتى مزيد من الاستخدام. </li></ol> 3. إعداد المحللة للذوبان الخليوي يتم تنفيذ كافة الخطوات التالية من الحضانة في 4 درجات مئوية تحت دوران خفيفة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ليز Sالخلايا F9 التعبير عن بروتين اهتمامك في ~ 20 مل من العازلة ملزمة GST (150 ملي مول كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA، 0.05٪ تريتون-X-100، 1 ملم DTT في PBS1X لتركيز النهائي من كلوريد الصوديوم 250 ملم، ومثبط البروتياز كوكتيل (روش). في حمام الماء المثلج، dounce الحل 20x ومع الخالط dounce، يصوتن كل 3X 30 ثانية (إخراج 70٪)، ومرة ​​أخرى dounce 20x و. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (اختياري). احتضان مجموع المحللة الخلية مع 1 ملي MgCl 2 و 7 benzonase نوكلياز (2.5 U / مل) لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية لإزالة الحمض النووي RNA أو التلوث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 18،000 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. إبقاء طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (اختياري). الطرد المركزي طاف مرة أخرى لمدة 30 دقيقة في 18،000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية للحصول على المحللة للذوبان واضحة. تمرير طاف من خلال مرشح 0.2 ميكرون أو 0.45 لتجنب انسداد. </li></ol> 4. ملزمة البروتين على GST الخرز <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا المحللة للذوبان مع 1 مل من الخرز GST (prewashed مرتين مع10 مل من العازلة GST) ملزمة لمدة 1 ساعة في 4 درجات مئوية تحت التناوب لطيف. </li></ol> التعليق: الساعة الحضانة يحتاج إلى أن يكون الأمثل وفقا لاستقرار وكفاءة البروتين ملزمة. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور سريعة على 700 دورة في الدقيقة وإزالة طاف تحتوي على بروتينات غير منضم (وهذا يمكن أن تبقى لمزيد من التحليل). غسل البروتينات ملزمة GST (الشكل 3B، حارة 1) مع GST غسل العازلة (GST العازلة ملزمة مع 350 ملي مول كلوريد الصوديوم النهائية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 4.2 2X. في غسل الماضي، وإزالة طاف قدر ممكن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان حبات مع 5 ملي ATP و 15 ملي MgCl 2 (في 10 مل العازلة ملزمة GST) لمدة 1 ساعة عند 4 درجة مئوية لتجنب الربط غير محدد من البروتينات حرارة صدمة 8. تغسل حبات ثلاث مرات مع GST غسل العازلة. </li></ol> 5. PreScission الشق من ضريبة السلع والخدمات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي حبات GST، وإزالة طاف وتغسل حبات GST مع P5 BUFفر (50 ملي NaHPO 4 درجة الحموضة 7.0، 500 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 10٪ الجلسرين، 0.05٪ تريتون-X-100، 5 ملي إيميدازول). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان GST-الخرز مع PreScission الانزيم في المنطقة العازلة من 3 P5 ساعة ليلة وضحاها في 4 درجات مئوية. (اقسم حبات GST في كسور 100 ميكرولتر وإضافة وحدات 4-8 (2-4 ميكرولتر) من انزيم مخففة في 100 ميكرولتر من العازلة P5). </li></ol> التعليق: فترة حضانة من خطوة PreScission يحتاج إلى أن يكون الأمثل وفقا للوزن الجزيئي فضلا عن الاستقرار من البروتين. إذا لوحظ تدهور، يمكن تخفيض هذا الوقت الحضانة لمدة لا تقل عن 2 ساعة بدلا من ليلة وضحاها. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور السريع وجمع طاف. كرر هذه الخطوة مرتين بعد إضافة 100 ميكرولتر من P5 العازلة إلى الخرز وتجميع جميع أجزاء (الشكل 3B، 2 لين). </li></ol> التعليق: حبات المتبقية يمكن استخدامها لتحليل كفاءة الانقسام (الشكل 3B </stroنانوغرام&gt;، حارة 3). عادة، يتم المشقوق 70-80٪ من البروتين. 6. لTALON المعادن تقارب الراتنج ملزمة البروتين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقسيم شطف من فوق إلى 3 أجزاء من 1 مل واحتضان كل مع 100 ميكرولتر الخرز الراتنج تالون تقارب المعدن الجافة (prewashed مرتين مع العازلة P5) لمدة 1 ساعة تحت التناوب. </li></ol> التعليق: تقسيم شطف في عدة كسور يزيد من كفاءة ملزمة / يغسل. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الراتنج 5 دقائق مع العازلة P30 (P5 عازلة مع تركيز النهائي من 30 ملي إيميدازول). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 6.2 2X وتجميع الخرز في أنبوب واحد. قبل غسل الماضي، وإزالة طاف قدر ممكن. </li></ol> التعليق: هذا يتوافق مع TALON ملزمة العينة (الشكل 3B، حارة 4). 7. شطف من البروتين النقي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان البروتين ملزمة الراتنج تالون لمدة 5 دقائق تحت تناوب مع P500 العازلة (P5 عازلة مع تركيز النهائي من 500 ملي إيميدازول). استخدام النسبة بين العازلة والخرز 1:1 ت / ضد (على سبيل المثال، إذا كنت قد اتخذت 200 ميكرولتر من الخرز جافة، سيكون لديك لإضافة 200 ميكرولتر من P500). كرر هذه الخطوة مرتين والحفاظ على كل جزء على حدة مزال (اسمه شطف 1 (E1)، شطف 2 (E2) وشطف 3 (E3)؛ الشكل 3B، الممرات 5-7). </li></ol> التعليق: حبات المتبقية يمكن استخدامها لتحليل فعالية شطف (الشكل 3B، حارة 8). عادة، يتم مزال 60-80٪ من البروتين في المجموع. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل كمية ونوعية البروتين النقي الخاص بك عن طريق تحميل ما يقرب من 20-40 ميكرولتر من كل جزء مع تركيز BSA القياسية على SDS-PAGE وصمة عار مع Coomassie الأزرق (الشكل 3B) أو SYPRO البروتين وصمة عار لتصور. </li></ol> التعليق: البروتين من الفائدة يمكن أيضا الكشف عن تروughout الإجراء تنقية استخدام الألغام المضادة للضريبة السلع والخدمات ومكافحة صاحب الأضداد (الشكل 3C). 8. تخزين البروتين النقي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dialyze البروتين النقي ضد وجود مخزن مؤقت التخزين المناسبة (على سبيل المثال 20 ملي تريس درجة الحموضة 8.0 خلات، 200 ملي شركة الخطوط الجوية الكويتية، 10٪ الجلسرين، 1 ملم EDTA، 0.5 ملي DTT) في 4 درجات مئوية. فمن المهم للتحقق من هطول الأمطار من البروتين النقي أثناء غسيل الكلى. نحن عادة dialyze 2X لمدة 1 ساعة في 4 درجات مئوية تحت التحريض التناوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل مأخوذة صغيرة من البروتين النقي (10-20 ميكرولتر) وتجميد الثلج الجاف لمدة 30 دقيقة. تخزين aliquots في -80 درجة مئوية، وتجنب العديد من ذوبان الجليد / دورات التجمد. </li></ol>

<ol>
	<li>Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+affinity+tags+for+protein+purification.">Comparison of affinity tags for protein purification.</a> Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).</li><li>Thain, A., Gaston, K., Jenkins, O., Clarke, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+separation+of+GST+fusion+proteins+from+co-purifying+GroEL.">A method for the separation of GST fusion proteins from co-purifying GroEL.</a> Trends Genet. 12, 209-210 (1996).</li><li>Carr, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+recombinant+form+of+the+V+antigen+of+Yersinia+pestis,+using+three+different+expression+systems.">Expression of a recombinant form of the V antigen of Yersinia pestis, using three different expression systems.</a> Vaccine. 18, 153-159 (1999).</li><li>Armisen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+adsorption+of+poly-His+tagged+glutaryl+acylase+on+tailor-made+metal+chelate+supports.">Selective adsorption of poly-His tagged glutaryl acylase on tailor-made metal chelate supports.</a> J. Chromatogr. A. 848, 61-70 (1999).</li><li>Kuhn, S., Zipfel, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+baculovirus+expression+vector+pBSV-8His+directs+secretion+of+histidine-tagged+proteins.">The baculovirus expression vector pBSV-8His directs secretion of histidine-tagged proteins.</a> Gene. 162, 225-229 (1995).</li><li>Buisson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+of+breast+cancer+proteins+PALB2+and+piccolo+BRCA2+in+stimulating+homologous+recombination.">Cooperation of breast cancer proteins PALB2 and piccolo BRCA2 in stimulating homologous recombination.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1247-1254 (2010).</li><li>Filimonova, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoforms+of+Serratia+marcescens+nuclease.+The+role+of+Mg2++in+the+hydrolysis+mechanism.">Isoforms of Serratia marcescens nuclease. The role of Mg2+ in the hydrolysis mechanism.</a> Biochemistry. 62, 983-988 (1997).</li><li>Thorslund, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+breast+cancer+tumor+suppressor+BRCA2+promotes+the+specific+targeting+of+RAD51+to+single-stranded+DNA.">The breast cancer tumor suppressor BRCA2 promotes the specific targeting of RAD51 to single-stranded DNA.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1263-1265 (2010).</li><li>Genois, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+BRCA2+and+RAD51+for+promoting+homologous+recombination+in+Leishmania+infantum.">Interactions between BRCA2 and RAD51 for promoting homologous recombination in Leishmania infantum.</a> Nucleic Acids Res. 40, 6570-6584 (2012).</li><li>Shrestha, B., Smee, C., Gileadi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+expression+vector+system:+an+emerging+host+for+high-throughput+eukaryotic+protein+expression.">Baculovirus expression vector system: an emerging host for high-throughput eukaryotic protein expression.</a> Methods Mol. Biol. 439, 269-289 (2008).</li></ol>

إلى صاحب GST بروتوكول تنقية المعروضة هنا هي مناسبة لتنقية مجموعة واسعة من الأحجام من البروتينات المؤتلف: نحن تنقيته بنجاح لى RAD51 (41kDa)، piBRCA2 (120kDa)، PALB2 (130kDa)، ونسبة عالية من البروتين الوزن الجزيئي غير المستقرة الليشمانيا الطفلية: لي BRCA2 (125kDa) 6،9. وعلاوة على ذلك، فإن البروتينات المنقى مع هذا البروتوكول النشطة كيميائيا 6. نجاح هذه الطريقة يعتمد فقط على التعبير، القابلية للذوبان والاستقرار من البروتين المطلوب. ناقلات البيولوجيا الجزيئية للتعبير في المضيفين الآخرين، مثل E. كولاي أو الخميرة، يمكن تعديلها بسهولة باستخدام ضريبة السلع والخدمات على نطاق واسع والعلامات صاحب. هذا يسلط الضوء على تطبيق وفعالية التكلفة لهذه التقنية موجودة بالنسبة لمعظم مختبرات البيولوجيا الجزيئية. مجموعة متنوعة من المزايا تأثر قرارنا لاختيار الخلايا المصابة أكثر من الخلايا البكتيرية أو الثدييات لrecombinanالتعبير ر البروتين وتنقية. على سبيل المثال، يمكن للتعديلات ما بعد النقل مثل مثيلة، والفسفرة ubiquitinylation تؤثر بشدة على وظيفة الأنزيمية من البروتين 10. وبالتالي، لدراسة خصائص الفسيولوجية للبروتين، فمن مواتية لاستخدام نظام يسمح لتعديل ما بعد النقل، مثل خلايا Sf9 المصابة. ميزة أخرى لاستخدام أكثر من Sf9 خلايا الثدييات، على سبيل المثال، هو من طبيعة اقتصادية، حيث ان النظام الخلية المصابة يتطلب أقل بكثير الخلايا ويوجد أسلوب ترنسفكأيشن مكلفة بالمقارنة مع نظام الثدييات. فإن بساطة أسلوب قدمت مساعدة الباحثين في الحصول على البروتين أو بروتين معقد في شكل منقى للغاية مع أجهزة المختبر القياسية، وهو أمر مفيد للمختبر مع الحد الأدنى من المعدات.

تنقية البروتينات المؤتلف أمر حاسم لمعالجة المسائل الأساسية في الكيمياء الحيوية. الطرق التقليدية لتنقية البروتين مثل التبادل الأيوني اللوني وحجم الاستبعاد اللوني تعتمد على الخصائص الفيزيائية للبروتين الهدف مثل نقطة تساوي الكهربية وتهمة أو حجم، على التوالي. ويجري تقاسم خصائص البروتين الأخير من قبل مجموعة متنوعة من البروتينات، مما يزيد بشكل كبير من فرصة تلويث البروتينات في تنقية البروتين الاستراتيجيات التقليدية. يمكن الالتفاف على هذه المشكلة مع استخدام الأعمدة تنقية متعددة، والتي تستغرق وقتا طويلا. في نفس الوقت، وأساليب اللوني الأخيرة مطالبة الإعداد التجريبية مكلفة. تنقية تقارب علامة يزيد بشدة المستهدفة التحديد، كما هو الحال في معظم الحالات سوف يكون علامة فريدة من نوعها لبروتين من الفائدة. في الدراسات الحديثة، وقد استخدم على نطاق واسع تنقية العلم أو HA-تقارب. وعلى النقيض من تفصيل القائمةombinant بروتوكولات تنقية البروتين التي تستخدم به واحد، أنشأنا مزيج فريد من اثنين من العلامات. ينطوي أسلوبنا الانصهار من علامة GST في N-محطة وصاحب العلامة في محطة سي من البروتين من الفائدة، لالنسبة المثلى بين كمية ونقاء البروتين المطلوب. ضريبة السلع والخدمات هو علامة طويلة (29 كيلو دالتون)، والتي هي ذات كفاءة عالية لتنقية على الجلوتاثيون الخرز سيفاروز. وعلاوة على ذلك، وذلك باستخدام GST يضمن فعاليتها من حيث التكلفة لدينا أسلوب 1. إمكانية يلتصق قبالة GST مع انزيم PreScission (مع تسلسل الاعتراف LeuGluValLeuPheGln / GlyPro، مما أدى إلى إضافة اثنين فقط من الأحماض الأمينية) والعديد من المزايا، على سبيل المثال، فإن هذه الاستراتيجية يتجنب التعديلات وظائف البروتين الفسيولوجية بسبب عائق تفارغي. الصغير صاحب العلامة تنصهر مع غيرها من أقصى البروتين يخدم في خطوة تنقية الثانية لزيادة البروتين النقاء بغسل قبالة GST المشقوق، وكذلك البروتينات وغيرها من تدهور<html> الملوثات. بالإضافة إلى ذلك، لا يتطلب البروتوكول خطوة لغسيل الكلى عند التبديل من ضريبة السلع والخدمات إلى صاحب تنقية خطوة العمود (راتنج تالون). الملوثات شيوعا في مثل هذه العمليات هي تنقية الحرارة صدمة البروتينات (HSP). إضافة خطوة الحضانة مع MgCl 2 و ATP يسمح إزالة هذه الملوثات (الشكل 1). البروتين سريع اللوني السائل (FPLC) وعالية الأداء اللوني السائل (HPLC) هي التقنيات الشائعة التي تعتمد على الأجهزة باهظة الثمن لتوليد عالية الغلة من البروتين المنقى من الفائدة. بروتوكول تنقية دفعة نقدم هنا، في المقابل، هو دليل ولا يتطلب الإعداد فعال مكلفة. يمكن التوصل إلى ارتفاع العائد من البروتين عن طريق التوسع في البروتوكول. في نفس الوقت، مع بروتوكول تنقية دفعة، ويمكن تعديل حجم شطف من أجل تعزيز تركيز البروتين، والتي لا تعطى مع FPLC أو HPLC. ntent &quot;&gt; أيضا، مع دفعة GST-صاحب بروتوكول تنقية والبروتينات مع حجم المدى من 10-300 كيلو دالتون ~ يمكن تنقيته. واحدة من أكبر مزايا تعطى من حقيقة أن واحدا يمكن تنقية العديد من البروتينات في نفس الوقت ، على سبيل المثال، على حد سواء من النوع البري والبروتين متحولة. إن نجاح بروتوكول المعروضة تعتمد فقط على مستوى التعبير والذوبان من البروتين من الفائدة.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.Coli DH10Bac (competent)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bac-to-Bac Baculovirus Expression System</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxi Prep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12163</td>
			<td>Solution I and II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Pure Bluo-Gal</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>15519028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>15529019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 infected cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PreScission enzyme</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>27084301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grace&#39;s infected medium supplemented</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>11605-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum characterized</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P/S (Penicillin-Streptomycin)</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Sepharose resin</td>
			<td>GE bioscience</td>
			<td>17075605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talon resin</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>635504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>288324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>15710064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal GST-antibody</td>
			<td>Production in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal 6X-His-antibody</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>631212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer (tight)</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator (Fisher dismembrator)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Model 150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis bag (50 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2115217</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gst-his purification: a two-step affinity purification protocol yielding full-length purified proteins

فحوصات أساسية في علم الإنزيمات لتوصيف البيوكيميائية من البروتينات في المختبر يتطلب تركيزات عالية من البروتين المنقى من الفائدة. يجب بروتوكولات تنقية البروتين الجمع بين الكفاءة والبساطة والفعالية من حيث التكلفة 1. هنا، نحن تصف طريقة GST-باعتباره صاحب الصغيرة الحجم نظام لتنقية تقارب جديدة للبروتينات المؤتلف، استنادا إلى N-محطة الجلوتاثيون سيفاروز الوسم (GST) وعلامة 2،3 10xHis-C المبنى رقم 4، وكلاهما تنصهر للبروتين من الفائدة. يتم استخدام بناء الأخير لتوليد مراقبة الحشرات، لإصابة Sf9 الخلايا المصابة للتعبير البروتين 5. GST هو علامة طويلة نوعا ما (29 كيلو دالتون) والذي يعمل على ضمان كفاءة التنقية. ومع ذلك، فإنه قد تؤثر على الخصائص الفسيولوجية للبروتين. وبالتالي، يتم لاحقا المشقوق قبالة البروتين باستخدام انزيم PreScission 6. من أجل ضمان أقصى قدر من النقاء وإزالة GST المشقوق، ونحنوأضاف خطوة تنقية تقارب الثانية على أساس صغيرة نسبيا صاحب العلامة. الأهم من ذلك، ويستند أسلوبنا على اثنين من العلامات المختلفة المرافقة طرفي البروتين، والذي هو أداة فعالة لإزالة البروتينات المتدهورة، وبالتالي، يثري البروتينات كامل طول. طريقة المقدمة هنا لا يحتاج إلى الإعداد فعال مكلفة، مثل FPLC. بالإضافة إلى ذلك، ونحن دمج MgCl 2 و ATP يغسل لإزالة الشوائب الحرارة بروتين الصدمة والعلاج نوكلياز لإلغاء تلويث الأحماض النووية. وباختصار، فإن مزيج من اثنين من الكلمات المختلفة المرافقة N-و-C محطة والقدرة على تنشق مرة واحدة من العلامات، وضمانات الانتعاش من البروتين العالية النقاء وطول الكامل من الاهتمام.

من أجل توضيح الكفاءة للله GST بروتوكول تنقية، ونحن تنقيته Rec14، وهو S. البروتين pombe من 32.9 كيلو دالتون. تم استنساخ [كدنا] Rec14 في منطقتنا تعديل ناقلات pFastBac1 السماح اضافات من ضريبة السلع والخدمات وصاحب-به في وN-C-تيرميني، على التوالي (الشكل 1A). تم الفيروسة العصوية المؤتلف ثم أعدت واستخدامها لتصيب الخلايا المصابة SF9 للتعبير البروتين. حضنت لست] خلية قابلة للذوبان مع حبات GST وكان مزال بروتينات ملزمة الشق ضريبة السلع والخدمات مع PreScission البروتيني. كان الناتج Rec14-صاحب البروتين ومزال تقارب تنقيته على الراتنج TALON والبروتينات المربوطة مع العازلة التي تحتوي على 500 ملي TALON إيميدازول. صاحب-Rec14 كان مدال المنقى في المخزن تخزين وتخزينها في -80 درجة مئوية (الشكل 1B). ولست] الخلية القابلة للذوبان ومجموعه من الخلايا المصابة SF9 مع الفيروسة العصوية المؤتلف Rec14، أو المصابة وهمية عن السيطرة، تم تحليلها من قبل Coomأسيي تلطيخ الأزرق، مما يسمح لنا لتأكيد التعبير عن بروتين GST-Rec14-صاحب (الشكل 3A). أثناء عملية تنقية، تم تحليل العديد من العينات لمتابعة كفاءة الأسلوب. تحليل هذه العينات بواسطة Coomassie الأزرق تلطيخ (الشكل 3B) يبين أنه خلال الخطوة الأولى للتنقية، GST-Rec14 تم بشكل صحيح منضمة إلى حبات GST، مع الوزن الجزيئي واضح من 60 كيلو دالتون ~ بسبب انصهار Rec14 (32.9 كيلو دالتون) مع ضريبة المبيعات (29 كيلو دالتون) (حارة 1). بعد انشقاق PreScission من ضريبة السلع والخدمات، وخالية من GST-Rec14 صاحب يهاجر حوالي 37 كيلو دالتون (حارة 2) في حين أن ضريبة السلع والخدمات المشقوق يمكن تصور على حبات GST (حارة 3، حوالي 25 كيلو دالتون). على الرغم من جزء من ضريبة السلع والخدمات خالية من Rec14 التي لا تزال ملزمة لحبات GST (حارة 3)، والإثراء ملحوظ في Rec14-تم تحقيقه صاحب (حارة 2، مع عدم وجود الملوثات مرئية على تلطيخ Coomassie الأزرق). ويمكن تحسين هذه الخطوة من خلال زيادة فترة حضانة من البروتين مع PreScission. تحليل Rec14-صاحب منضمة إلى TALONالخرز (بعد الخطوة 7.1، حارة 4) مقارنة مع البروتينات مزال بعد تنقية GST خطوة (حارة 2)، وتبين أن نسبة كبيرة من Rec14-صاحب منضما إلى حبات تالون. بعد عدة غسلات، وكان صاحب Rec14-مزال وجمعها. أجريت ثلاث elutions. وكشف تحليل نقاء عالية من Rec14-صاحب (لا الملوثات مرئية بواسطة Coomassie تلطيخ، الممرات 5-7)، وأكبر تركيز للRec14-صاحب في شطف الأولى. بعد شطف (حارة 8) يوضح المقارنة بين الكسور مزال (الممرات 5-7) لحبات TALON كفاءة شطف، منذ-صاحب Rec14 يمكن أن يتم الكشف عن عدد قليل فقط كما ملزمة على الخرز. وتعرض العينات المستخدمة في الشكل 3B إلى تحليل لطخة غربية مع المضادة للضريبة السلع والخدمات والأجسام المضادة للله من أجل متابعة Rec14 في جميع أنحاء الداخلي (الشكل 3C). وصمة عار مكافحة GST يظهر أن بعض GST-Rec14 وضريبة السلع والخدمات وحدها، كانت موجودة في البروتينات مزال من الخطوة تنقية GST (حارة 2)، وعشرفي الملوثات وإزالتها عن طريق تقارب خطوة تنقية صاحب العلامة. هذه وصمة عار يسمح لنا أيضا لمراقبة ذلك ضريبة السلع والخدمات قد أزيلت بكفاءة من Rec14 من العلاج PreScission وخطوة تنقية صاحب العلامة (الممرات 4-8). يهدف لمكافحة وصمة عار له للكشف عن Rec14. وبالتالي يمكن أن نؤكد أن GST-Rec14-صاحب وRec14-صاحب لم المشقوق تماما وإزالتها من حبات GST (حارة 11). علاوة على ذلك، بتركيز عال، يبدو Rec14 لتجميع (حارة 13). وباختصار، فإن النتائج المقدمة تثبت كفاءة تنقية GST-صاحب لتنقية S. pombe Rec14. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50320/50320fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50320/50320fig1.jpg" /> الشكل 1. الملخص التخطيطي للله GST-خطوتين طريقة تنقية تقارب. A. GST-Rec14-صاحب بناء المستنسخة في pFastBac (Baculovir<html> . ناقلات لنا التعبير) B. تقارب خطوتين تنقية GST-Rec14-Sf9 من صاحب المحللة الخلية القابلة للذوبان:.، تليها PreScission الانقسام من ضريبة السلع والخدمات GST ملزم، وشطف مع إيميدازول ملزم TALON <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50320/50320fig1large.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض أكبر شخصية</a> . <img alt="الرقم 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50320/50320fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50320/50320fig2.jpg" /> الشكل 2. التمثيل التخطيطي pFastBac1-GST-10xHis. GST (الأخضر)، PreScission موقع البروتيني (الضوء الأزرق)، يتم عرض الموقع multicloning (الحمراء)، و10 صاحب العلامة (الأزرق الداكن). في الحالة الأدنى هي متواليات النوكليوتيدات مصدرها PET-52B (+). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50320/50320fig2large.jpg" target="_blank">اضغط هنا لعرض أكبر شخصية</a> . <html> together.within صفحة = &quot;دائما&quot;&gt; <img alt="الرقم 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50320/50320fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50320/50320fig3.jpg" /> الرقم 3. نتيجة مثالية من صاحب GST-تنقية Rec14. A. Coomassie تلوين جزء من الكل البروتين (حارة 2 و 3) والمحللة الخلية القابلة للذوبان (حارة 4 و 5) من خلايا Sf9 همية المعالجة (حارة 2 و 4) أو المصابين GST-Rec14-صاحب الفيروسة العصوية (حارة 3 و 5). Rec14-GST صاحب وتمتلك الوزن الجزيئي من حوالي 32.9 كيلو دالتون و 29 كيلو دالتون، على التوالي، وGST-Rec14-صاحب انصهار بروتين لديه الوزن الجزيئي من حوالي 61.9 كيلو دالتون. B. Coomassie تلطيخ يدل كل خطوة من طريقة تنقية البروتين (ل انظر شرح مفصل الداخلي) C. طخة غربية من الكسور التالية الإجراء تنقية مع المضادة للضريبة السلع والخدمات (حارة 1-8) ومعاداة صاحب (حارة 9-16) الأجسام المضادة.upload/50320/50320fig3large.jpg &quot;الهدف =&quot; _blank &quot;&gt; اضغط هنا لعرض أكبر شخصية.

Watch this Scientific Journal Video about GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins at JoVE.com

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

في هذا البروتوكول، ونحن يبرهن على وجود نطاق صغير طريقة تنقية البروتين كفاءة عالية وفعالة من حيث التكلفة، والذي يسمح تنقية البروتينات المؤتلف من خلال الجمع بين فريد شطورة GST-علامة وصغيرة صاحب العلامة.

GST-صاحب تنقية: A خطوتين تقارب بروتوكول تنقية استسلام كامل طول البروتينات تنقية

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

gst-his-purification-two-step-affinity-purification-protocol-yielding

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

41.3K Views.  Hôtel-Dieu de Québec.  في هذا البروتوكول، ونحن يبرهن على وجود نطاق صغير طريقة تنقية البروتين كفاءة عالية وفعالة من حيث التكلفة، والذي يسمح تنقية البروتينات المؤتلف من خلال الجمع بين فريد شطورة GST-علامة وصغيرة صاحب العلامة. 

Video: GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

تلطيخ من البروتينات في الهلام مع Coomassie G - 250 دون عضوي حمض الخليك والمذيبات

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key selective advantages. First, renaturation of disordered aggregates by Hsp104 empowers yeast survival after various protein-misfolding stresses, including heat shock3,5,11,12. Second, remodeling of cross-beta amyloid fibrils by Hsp104 enables yeast to exploit myriad prions (infectious amyloids) as a reservoir of beneficial and heritable phenotypic variation13-22. Remarkably, Hsp104 directly remodels preamyloid oligomers and amyloid fibrils, including those comprised of the yeast prion proteins Sup35 and Ure223-30. This amyloid-remodeling functionality is a specialized facet of yeast Hsp104. The E. coli orthologue, ClpB, fails to remodel preamyloid oligomers or amyloid fibrils26,31,32.
Hsp104 orthologues are found in all kingdoms of life except, perplexingly, animals. Indeed, whether animal cells possess any enzymatic system that couples protein disaggregation to renaturation (rather than degradation) remains unknown33-35. Thus, we and others have proposed that Hsp104 might be developed as a therapeutic agent for various neurodegenerative diseases connected with the misfolding of specific proteins into toxic preamyloid oligomers and amyloid fibrils4,7,23,36-38. There are no treatments that directly target the aggregated species associated with these diseases. Yet, Hsp104 dissolves toxic oligomers and amyloid fibrils composed of alpha-synuclein, which are connected with Parkinson's Disease23 as well as amyloid forms of PrP39. Importantly, Hsp104 reduces protein aggregation and ameliorates neurodegeneration in rodent models of Parkinson's Disease23 and Huntington's disease38. Ideally, to optimize therapy and minimize side effects, Hsp104 would be engineered and potentiated to selectively remodel specific aggregates central to the disease in question4,7. However, the limited structural and mechanistic understanding of how Hsp104 disaggregates such a diverse repertoire of aggregated structures and unrelated proteins frustrates these endeavors30,40-42.
To understand the structure and mechanism of Hsp104, it is essential to study the pure protein and reconstitute its disaggregase activity with minimal components. Hsp104 is a 102kDa protein with a pI of ~5.3, which hexamerizes in the presence of ADP or ATP, or at high protein concentrations in the absence of nucleotide43-46. Here, we describe an optimized protocol for the purification of highly active, stable Hsp104 from E. coli. The use of E. coli allows simplified large-scale production and our method can be performed quickly and reliably for numerous Hsp104 variants. Our protocol increases Hsp104 purity and simplifies His6-tag removal compared to a previous purification method from E. coli47. Moreover, our protocol is more facile and convenient than two more recent protocols26,48.

Here, we describe a protocol for the purification of highly active Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation. This scheme exploits a His6-tagged construct for affinity purification from E. coli followed by anion-exchange chromatography, His6-tag removal with TEV protease, and size-exclusion chromatography.

تنقية Hsp104 ، وهو بروتين Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers. Particularly troublesome is the fact that lysis of cells releases a large number of proteases and nucleases which can degrade ribosomes. Thus, it is important to separate ribosomes from these enzymes as quickly as possible. Unfortunately, conventional differential ultracentrifugation methods leaves ribosomes exposed to these enzymes for unacceptably long periods of time, impacting their structural integrity and functionality. To address this problem, we utilize a chromatographic method using a cysteine charged Sulfolink resin. This simple and rapid application significantly reduces co-purifying proteolytic and nucleolytic activities, producing high yields of intact, highly biochemically active yeast ribosomes. We suggest that this method should also be applicable to mammalian ribosomes. The simplicity of the method, and the enhanced purity and activity of chromatographically purified ribosome represents a significant technical advancement for the study of eukaryotic ribosomes.

Contamination of preparations of eukaryotic ribosomes purified by traditional methods by co-purifying nucleases and proteases negatively impacts on downstream biochemical and structural analyses. A rapid and simple chromatographic purification method is used to solve this problem using yeast ribosomes as a model system.

الكروماتوغرافي تنقية ريبوسوم الخميرة نشطة للغاية

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

متعامد تنقية البروتين الميسر عن طريق بطاقات تقارب Bispecific الصغيرة

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

تحديد الشركاء البروتين عن طريق التفاعل جنبا الى جنب الانجذاب تنقية

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

تحديد بروتين في مجمعات<em&gt; كولاي</em&gt; استخدام المتعاقبة تنقية تقارب الببتيد في تركيبة مع جنبا إلى جنب الطيف الكتلي

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

عالية الإنتاجية تنقية تقارب الموسومة البروتينات المؤتلف

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

تنقية النصوص والأيضات من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; رؤساء

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

البروتين طريقة خالية من تنقية تجليد تحديد الانجذاب من قبل Thermophoresis الميكروسكيل

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. However, the use of biochemical screens aimed at extending the knowledge gained from genetic analysis was explored only recently. Here we describe a method to purify the protein complex that associates with any protein of interest from adult fly heads. This method takes advantage of the Drosophila GAL4/UAS system to express a bait protein fused with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag in fly neurons in vivo, and then implements two rounds of purification using a TAP procedure similar to the one originally established in yeast1 to purify the interacting protein complex. At the end of this procedure, a mixture of multiple protein complexes is obtained whose molecular identities can be determined by mass spectrometry. Validation of the candidate proteins will benefit from the resource and ease of performing loss-of-function studies in flies. Similar approaches can be applied to other fly tissues. We believe that the combination of genetic manipulations and this proteomic approach in the fly model system holds tremendous potential for tackling fundamental problems in the field of neurobiology and beyond.

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila is famous for its powerful genetic manipulation, but not for its suitability of in-depth biochemical analysis. Here we present a TAP-based procedure to identify interacting partners of any protein of interest from the fly brain. This procedure can potentially lead to new avenues of research.

تحديد البروتين البروتين التفاعل في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; رؤساء الكبار حسب جنبا الى جنب الانجذاب تنقية (وات)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

GST-صاحب تنقية: A خطوتين تقارب بروتوكول تنقية استسلام كامل طول البروتينات تنقية

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video