يتم اعتماد الكتاب من قبل مجلس الأبحاث السويدي ، ومؤسسة البحوث الاستراتيجية السويدية والمجتمع السويدي السرطان ، وسرطان الأطفال المجتمع السويدي ، آك Wibergs الأساس والأساس Jeanssons.

1. تقديم لجنة التحقيق إلى الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شارك في transfect الخلايا مع التحقيق الذي تجريه الحنق على أساس المقاومة ومنح البلازميد. اختيار طريقة ترنسفكأيشن تتسم بالكفاءة في نوع الخلايا اهتمامك. U2OS للخلايا ، ومعيار أساليب ترنسفكأيشن فوسفات الكالسيوم يعطي نتائج كافية 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد الخلايا الموجودة في المضادات الحيوية المناسبة لسبعة أيام على الأقل. هذا يثري كمية من الخلايا معربا عن التحقيق ويحد من كمية الخلايا التي تحتوي على مستويات التعبير السامة ، أو مستويات التعبير التي تؤثر بشدة على دورة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (اختياري) حدد لاستنساخ مستقرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام خلايا ثابتة أو حي ، تحقق من أن كلا CFP وYFP موجودة في جميع الخلايا في النسبة تقريبا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حالة احتواء بعض الخلايا فقط أو CFP YFP ، حدث تأشب احتمالا. يمكن أن يحدث إما أثناء إعادة التركيب نمو البكتيريا أو بعد ترنسفكأيشن لجنة التحقيق ، وربما في الحالة الأخيرة تعتمد على نوعية البلازميد. كرر ع البلازميدالجبر ويصبح خطي من قبل البلازميد ترنسفكأيشن إذا استمرت المشكلة. </li></ol> 2. ratiometric رصد الحنق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا البذور على أطباق أسفل الزجاج ، أو زلات لتركيب الغطاء في الغرفة. تأكد من أن أطباق / زلات تغطية توجد 1.5 (170 ميكرون سميكة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل الخلايا في النمو دون الحمراء المتوسطة الفينول على مجهر epifluorescence بمحركات مع مجموعة التحكم في درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية. ضمان تنظيم درجة الحموضة وسائل الإعلام ، إما عن طريق CO 2 أو باستخدام ثاني أكسيد الكربون 2 وسائل الإعلام المستقلة مثل يبوويتز - 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التركيز على الخلايا باستخدام الضوء المرسل. لا تبدو على الخلايا باستخدام ضوء الفلورسنت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يبدأ من خلال الحصول على صورة 12 بت أو 16 باستخدام الإثارة YFP (YFPex) ومرشحات YFP الانبعاثات (YFPem) ومرآة مناسبة مزدوج اللون. استخدام binning القصوى المتاحة التي لا يزال يسمح القرار المطلوب التحت خلوية. باستخدام binning عالية لتقليل مدة التعرض أو شدة أمر حاسم لتجنب الضيائية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أناasure أو تقدير شدة الضوضاء الخلفية وتقريبية من خلال قياس أو تقدير متوسط ​​، والحد الأدنى الخام والقيم بكسل كحد أقصى في منطقة خالية من الخلايا. تغيير وقت التعرض ومحايدة مرشحات الكثافة بحيث إشارة المتوسط ​​في الخلية هو ما يقرب من كثافة الخلفية بالإضافة إلى خمسة إلى عشرة أضعاف الفرق بين الحد الأقصى وشدة الخلفية دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق من أن الصور ليست على وشك المشبعة. ينبغي للكثافة القصوى في صورة أقل من نصف النطاق الديناميكي (مثل ماكس 2000 في صورة 12 بت) للسماح لشدة الخلافات عندما تدخل خلايا الانقسام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 2،4-2،6 باستخدام الإثارة وعوامل الانبعاثات CFP YFP ومرآة مناسبة مزدوج اللون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد مناطق متعددة مع خلايا transfected ، باستثناء المناطق المستخدمة ل2،4-2،7 نقطة ، وضمان أقصى قدر من كثافة أقل من نصف النطاق الديناميكي في جميع الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء تجربة مرور الزمن اكتساب صورتين كل 45 دقائق باستخدام YFPex -- YFPem وCFPex -- YFPem مجموعات التصفية. </li></ol> 3. وتحسين شروط التحقق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح الصور التي اكتسبوها ورصد زمن دورة الخلية من الانقسام على الانقسام للخلايا التي تعبر عن لجنة التحقيق transfected. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قارن دورة الخلية قياس الوقت لنشر البيانات لنوع من الخلايا المستخدمة. بدلا من ذلك ، untransfected الفيلم من خلال الحصول على خلايا صورة واحدة من الضوء ينتقل فقط (على سبيل المثال مدينة دبي للإنترنت ، أو مرحلة التباين) في كل ساعة للحصول على أوقات إشارة دورة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حالة الوقت من الانقسام الخيطي ليتوافق مع مواعيد مرجعية دورة الخلية ، انتقل إلى الخطوة 4. بدلا من ذلك ، وإعادة الحصول على صور باستخدام الصعب التعرض لمزيد من الوقت أو عدة نقاط ض المستويات وكرر الخطوة 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> transfected الفيلم في حالة من الانقسام في وقت لالانقسام لا تتوافق مع إشارة توقيت دورة الخلية ، من خلال الحصول على خلايا صورة واحدة من الضوء ينتقل فقط (على سبيل المثال مدينة دبي للإنترنت ، أو مرحلة النقيض) كل ساعة تليها صورة واحدة في نهايةالتجربة لتحديد الخلايا transfected. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كانت الخلايا لا تزال تظهر transfected مرات أطول دورة الخلية ، كرر الخطوة 1 ولكن أقل transfect التحقيق أو تحديد لاستنساخ المستقرة التي تحتوي على كميات منخفضة جدا من التحقيق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كانت الخلايا طبيعية تظهر transfected مرات دورة الخلية في غياب ضوء الفلورسنت ، وكرر الخطوة 2 ولكن أقل من التعرض عن طريق تعديل binning ، مرشحات الكثافة محايدة ، ومدة التعرض ، والوقت بين الصور. </li></ol> 4. تحليل الحنق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن إجراء التحليل من قبل معظم البرامج المخصصة لالمجهري. هنا ونحن تصف كيفية إجراء التحليل باستخدام ImageJ مجانية ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij</a> ) الاستفادة من البرنامج المساعد زائد نسبة ( <a href="http://imagej.nih.gov/ij/plugins/ratio-plus.html" target="_blank">http://imagej.nih.gov/ij/plugins/ratio-plus . HTML</a> ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح الصور في ImageJ. في حالة الصور في شكل لSTAC متعدد الألوانك (على سبيل المثال Deltavision) ، فصل عن طريق تحويل القنوات الفردية الأولى هم لhyperstack : صورة لhyperstack - hyperstack المكدس والانقسام في وقت لاحق لهم باستخدام مداخن قناة واحدة : صورة - hyperstack - تقليل أبعاد </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مضاعفة YFPex -- مكدس YFPem به مع 3 : عملية - الرياضيات ضرب هذه الخطوة اختيارية ، والغرض منه هو زيادة وضوح بصرية للصور عن طريق ضمان أن النسب ليست في نطاق بين 0 و 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في YFPex -- مكدس YFPem ، رسم المنطقة ذات الاهتمام (ROI) في المنطقة التي تخلو من الخلايا ، ولكن هذا هو على مقربة من خلية إلى أن يقاس. قد خلايا مختلفة في نفس الصورة تتطلب مختلف المناطق ، لأن كلا من الخلفية وكثافة الإشارة عادة في مركز أقوى من الصورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى مدير ROI العائد على الاستثمار : تحليل عائد الاستثمار ، الأدوات ، مدير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس كثافة متوسط ​​العائد على الاستثمار في YFPex على حد سواء -- وYFPem CFPex و-- مكدس YFPem : تحليل القياس </em&gt;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار في timepoints متعددة والتحقق من أن شدة الخلفية بالقرب من الخلية التي تهم مماثلة طوال الفيلم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط القياسات لتشمل الحد الأدنى من شدة : تحليل لضبط قياسات مين وماكس قيمة الرمادي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم المنطقة التي تغطي معظم الاهتمام من خلية وقياس كثافة أدنى في YFPex على حد سواء -- وYFPem CFPex و-- YFPem المكدس. تأخذ الفرق بين الحد الأدنى من قياس كثافة وشدة الخلفية من 4.6 وتقسيمها على اثنين. يوفر هذا تقدير لقيمة بدءا قطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح نسبة زائد. حدد YFPex -- YFPem وCFPex و-- YFPem المكدس. لنسبة الحنق ، حدد CFPex -- YFPem كما المكدس 1 ، لمقلوب نسبة الحنق تصور تحقيقات حيث يقلل كفاءة الحنق على الفسفرة ، حدد YFPex -- YFPem كما مكدس 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج قياس كثافة الخلفية والقيم لقطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين التحجيم من المكدس نسبة الناتج وتطبيق ش تبدو مناسبةع الجدول (طرفية) لتصور التغييرات النسبة. </li></ol> 5. ممثل النتائج Plk1 النشاط مرئية الأول في النواة في المرحلة G2 والقمم خلال الانقسام. الشكل 3 يوضح تجربة باستخدام إعدادات الضيائية الحد الأدنى كما هو موضح في القسم 2. يرجى ملاحظة أن هذا هو نتيجة ممثل الأولية والتي يمكن تعديلها أو ظروف التعرض الوقت بين الصور لزيادة اشارة الى نسبة الضوضاء أو قرار مؤقت. يوضح الشكل 3D أن غالبية الخلايا تتكاثر معربا عن التحقيق مع خلية دورة الزمن ما بين 20 و 25 ساعة ، مشيرا الى ان ظروف التصوير ومستويات التعبير عن التحقيق لا تؤثر على توقيت دورة الخلية. وإن كان هناك ضجيج كبير ، والاتجاه نحو زيادة النشاط في Plk1 G2 وتبلغ ذروتها في 14 الانقسام مرئيا بوضوح (الشكل 3A). معالجة البيانات الخام ، والتي تعني هنا الترشيح المقدمة بوصفها kymograph (الشكل 3B) ، أو في تقدير حجم را مقلوب المتوسط<html> يمكن تيو (الشكل 3C) تعزيز الوضوح. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3410/3410fig1.jpg" /> الشكل 1. مبدأ تحقيق الحنق القائم على رصد أنشطة كيناز والفوسفاتيز. ترتبط اثنين fluorophores ، CFP عادة (الأزرق) وYFP (الأخضر) ، من خلال مجال الفوسفات وملزمة (البرتقال) وتسلسل phosphorylatable (الصفراء). الفسفرة (الحمراء) يتوسط ملزمة إلى المجال الفوسفات وملزمة ، وبالتالي إحداث تغيير متعلق بتكوين جزئي في التحقيق. نتائج تغيير متعلق بتكوين جزئي في الفرق في المسافة أو التوجه fluorophores بين البلدين ، الأمر الذي يؤثر على كفاءة بين الحنق وYFP CFP. ويمكن تصور أن يكون الحنق التي CFP مثيرة ورصد الانبعاثات YFP (الخطوط المنقطة). <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3410/3410fig2.jpg" /> الشكل 2. مخطط تخطيطي لإجراء التجارب. p_upload/3410/3410fig3.jpg &quot;/&gt; الشكل 3. Plk1 النشاط مرئية الأول في النواة في المرحلة G2 والقمم خلال الانقسام. وتم تصوير الخلايا U2OS تعبر عن رصد المسبار الحنق المستندة Plk1 النشاط لمدة 60 ساعة 9،14 باستخدام نظام التصوير Deltavision Spectris مجهزة الهدف NA 20X الهواء 0.7 و مصباح الزئبق. وقد تم اختيار ظروف التصوير لسبب الضيائية الحد الأدنى ، كما هو مبين في المادة 2 ، وذلك باستخدام مرشحات binning 4x والكثافة المحايدة التي تمنع 99 ٪ من ضوء واردة. A ، تمثيل الألوان الزائفة مقلوب نسبة - الحنق ، بعد خلية واحدة إلى 4 الانقسامات. B ، kymograph من الخلية هو مبين في وبعد تطبيق مرشح الوسط. C ، القياس الكمي لمقلوب نسبة الحنق من الخلية هو موضح في D A. ، التراكمي دخول الإنقسامية من 50 الحنق التحقيق خلايا الإعراب ، بما في ذلك انقسامات الخلايا الوليدة.

<ol>
	<li>Sun, Y., Wallrabe, H., Seo, S. A., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET+microscopy+in+2010:+the+legacy+of+Theodor+Forster+on+the+100th+anniversary+of+his+birth.">FRET microscopy in 2010: the legacy of Theodor Forster on the 100th anniversary of his birth.</a> Chemphyschem. 12, 462-474 (2011).</li><li>Allen, M. D., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+dynamics+of+protein+kinase+A+activity+visualized+by+FRET-based+reporters.">Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 348, 716-721 (2006).</li><li>Kunkel, M. T., Ni, Q., Tsien, R. Y., Zhang, J., Newton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+dynamics+of+protein+kinase+B/Akt+signaling+revealed+by+a+genetically+encoded+fluorescent+reporter.">Spatio-temporal dynamics of protein kinase B/Akt signaling revealed by a genetically encoded fluorescent reporter.</a> J. Biol. Chem. 280, (2005).</li><li>Violin, J. D., Zhang, J., Tsien, R. Y., Newton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+fluorescent+reporter+reveals+oscillatory+phosphorylation+by+protein+kinase.">A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphorylation by protein kinase.</a> C. J. Cell. Biol. 161, 899-909 (2003).</li><li>Kunkel, M. T., Toker, A., Tsien, R. Y., Newton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-dependent+regulation+of+protein+kinase+D+revealed+by+a+genetically+encoded+kinase+activity+reporter.">Calcium-dependent regulation of protein kinase D revealed by a genetically encoded kinase activity reporter.</a> Journal of Biological Chemistry. 282, 6733-6742 (2007).</li><li>Harvey, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+fluorescent+sensor+of+ERK+activity.">A genetically encoded fluorescent sensor of ERK activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19264-19269 (2008).</li><li>Fosbrink, M., Aye-Han, N. N., Cheong, R., Levchenko, A., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+JNK+activity+dynamics+with+a+genetically+encoded+fluorescent+biosensor.">Visualization of JNK activity dynamics with a genetically encoded fluorescent biosensor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5459-5464 (2010).</li><li>Gavet, O., Pines, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+activation+of+CyclinB1-Cdk1+coordinates+entry+to+mitosis.">Progressive activation of CyclinB1-Cdk1 coordinates entry to mitosis.</a> Dev. Cell. 18, 533-543 (2010).</li><li>Fuller, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midzone+activation+of+aurora+B+in+anaphase+produces+an+intracellular+phosphorylation+gradient.">Midzone activation of aurora B in anaphase produces an intracellular phosphorylation gradient.</a> Nature. 453, 1132-1136 (2008).</li><li>Ni, Q., Titov, D. V., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+protein+kinase+dynamics+in+living+cells+with+FRET+reporters.">Analyzing protein kinase dynamics in living cells with FRET reporters.</a> Methods. 40, 279-286 .</li><li>Morgan, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The cell cycle : principles of control. , (2007).</li><li>Lindqvist, A., Rodriguez-Bravo, V., Medema, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+decision+to+enter+mitosis:+feedback+and+redundancy+in+the+mitotic+entry+network.">The decision to enter mitosis: feedback and redundancy in the mitotic entry network.</a> J. Cell. Biol. 185, 193-202 (2009).</li><li>Gavet, O., Pines, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+cyclin+B1-Cdk1+synchronizes+events+in+the+nucleus+and+the+cytoplasm+at+mitosis.">Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis.</a> J. Cell. Biol. 189, 247-259 (2010).</li><li>Macurek, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polo-like+kinase-1+is+activated+by+aurora+A+to+promote+checkpoint+recovery.">Polo-like kinase-1 is activated by aurora A to promote checkpoint recovery.</a> Nature. 455, 119-123 (2008).</li><li>van der Eb, A. J., Graham, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+transforming+activity+of+tumor+virus+DNA.">Assay of transforming activity of tumor virus DNA.</a> Methods. Enzymol. 65, 826-839 (1980).</li><li>Lamprecht, M. R., Sabatini, D. M., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+free,+versatile+software+for+automated+biological+image+analysis.">CellProfiler: free, versatile software for automated biological image analysis.</a> Biotechniques. 42, 71-75 (2007).</li><li>Roszik, J., Lisboa, D., Szollosi, J., Vereb, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+intensity-based+ratiometric+FRET+in+image+cytometry--approaches+and+a+software+solution.">Evaluation of intensity-based ratiometric FRET in image cytometry--approaches and a software solution.</a> Cytometry A. 75, 761-767 (2009).</li></ol>

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

رصد الحنق في جميع مراحل دورة الخلية تتطلب الاعتبارات التي هي أقل أهمية عند تقييم الاستجابات قصيرة الأجل للمؤثرات الخارجية. الأولى ، يتم بسهولة تقدم دورة الخلية مضطرب من جراء إشارات الإجهاد ، والتي تتطلب أن يتم الاحتفاظ الضيائية إلى الحد الأدنى. ثانيا ، يمكن لجميع الصحفيين تؤثر على العمليات الخلوية التي المعايرة من كاينيسات ، phosphatases أو مجالات التفاعل. ربما الطريقة الأكثر مباشرة لتقييم ما إذا كانت ظروف تجريبية كافية لقياس طول دورة الخلية من الانقسام إلى الانقسام وذلك لمقارنة التجارب المستقلة مضان التصوير والتعبير عن التحقيق. وثمة عامل حاسم في رصد نسب الحنق في جميع مراحل دورة الخلية لمقاومة إغراء الحصول على صور جميلة مع دقة عالية. على الرغم من أن ضبط الدقيق يتوقف على مدى حساسية النظام المجهر ومستوى التعبير وطبيعة التحقيق على وجه الخصوص ، من المهم استخداممستوى binning الذي يتوافق مع ما هو ضروري للغاية لرؤيته. على الرغم من أن الوقت بين CFPex -- YFPem وYFPex -- صور YFPem حاجة إلى أن تكون قصيرة لتجنب التغييرات في مورفولوجية الخلية ، في أيدينا هو أفضل الأوقات للحفاظ على التعرض لأكثر من 0.1 ثانية ، والحد من شدة ضوء الفلورسنت من خلال مرشحات الكثافة محايدة . كيف يؤثر الضيائية دورة الخلية يعتمد إلى حد كبير على مستويات التعبير وتوطين التحقيق. والمسبار الذي يتم مترجمة إلى لونين ، مثلا عن طريق الاندماج مع هيستون ، ويجعل الخلايا أكثر حساسية للضوء الفلورسنت ، ويفترض أن يتم إنشاؤها منذ تركات الضوئية في المناطق القريبة من الحمض النووي. لذا فمن الأهمية بمكان لرصد الخلايا التي تعبر عن مستويات منخفضة نسبيا للصحفيين وإعادة فحص الخلية دورة توقيت إذا توطين التحقيق إلى الهياكل التحت خلوية مختلفة. مطلوبة عدة تجارب مراقبة للتحقق من أن الحنق موجود فيالإعداد التجريبية والتي تعكس التغيرات نسبة الفسفرة الفعلي للتحقيق. عدا الضوابط الفنية ، مثل تثبيط أو استنزاف لكيناز ، فإنه من المستحسن أن إجراء تجارب الكيمياء الحيوية للتحقق من أن لجنة التحقيق فسفرته ، تحور في موقع الفوسفات ومتقبل المتوقع خلال التحقيق إلى بقايا غير phosphorylatable ، والمتقبلة لphotobleaching تثبت وقوع الحنق. للحصول على مثال من التحقق من صحة واسعة النطاق ، انظر الشكل 3 التكميلية في المرجع 14. على الرغم من أنه هو الأفضل من الناحية النظرية لتقييم التغيرات الحنق من خلال رصد الانبعاثات على حد سواء وCFP YFP ، حساسة للغاية مثل هذه الاجهزة لتركيز تغييرات وظروف الإضاءة ، ويمكن أن تؤدي بسهولة إلى التحف. الحساسية للتغيرات التركيز يرجع إلى انحراف لوني ، حيث CFP وانبعاث YFP لا تركز على نقطة واحدة. التغييرات الإضاءة تعتمد بشكل كبير على محاذاة مختلفة من مسار الضوء. هذا هو بارز وخاصة عند استخدام مكعبات تحتوي على فلترمرآة مزدوج اللون. ويمكن تقليل التركيز وتغيير الإضاءة باستخدام تصحيح الأهداف ومكعبات تصفية محاذاة بعناية. ومع ذلك ، في تجربتنا ، والحفاظ على تصفية ثابت الانبعاثات يعطي نتائج متفوقة ، ويفضل باستخدام الإعداد مع تحكم منفصل من الإثارة وعوامل الانبعاثات. يتم تقليل حجم الحنق وحظ تغير بواسطة bleedthrough من CFP مضان إلى تصفية YFP الانبعاثات. في حالة bleedthrough هي كبيرة ، وهو CFPex اضافية -- يمكن الحصول عليها لتصحيح صورة CFPem bleedthrough في CFPex -- صورة YFPem. ومع ذلك ، هذه التصويبات حساسة جدا للتركيز الخلافات ، وربما يعرض التحف. بالإضافة إلى ذلك ، فإنها تتطلب صورة اضافية ، والتي قد تنتج الضيائية. على الرغم من أن أقل من قضية إلا عندما الانبعاثات YFP الرصد وحفظ الخلايا في التركيز طوال 24H + الوقت الفاصل بين التجربة يمكن أن يكون تحديا. لتجنب التركيز الانجرافات ، تأكد من أن المجهروطبق قبل تحسنت وان درجة الحرارة في الغرفة لا تتقلب. بدلا من ذلك ، استخدام نظام ضبط تلقائي للصورة التي لا ترتكز على التصوير من التحقيق transfected. اختيار الهدف الذي لاستخدام يعتمد على تطبيق معين. والتي تعتمد على النفط الهدف NA عالية بجمع مزيد من الضوء ويعطي قرار زيادة ، ولكنه أكثر حساسية للتغيرات التركيز وغير عملي في الاجهزة عالية المحتوى. نحن نفضل استخدام هدفا الهواء مع NA مرتفعة نسبيا لدراسة حشوية أو نووية الحنق ، نسب ، واستخدام النفط مرتفعة NA الأهداف فقط عندما يطلب القرار أعلى التحت خلوية. هذه الورقة تناقش طريقة مباشرة لفيلم الحنق المستندة إلى تحقيقات من خلال دورة الخلية التي تستخدم المعدات التي تتوفر عادة لكثير من الباحثين علوم الحياة ، وتتطلب فقط المعرفة القاعدية من المجهري ومعالجة الصور. بدائل أكثر تخصصا تشمل استخدام شق شعاع ، الإسفار M مدى الحياةicroscopy (فليم) (1) وبرنامج لأتمتة الكائن 16 تجزئة وحساب نسبة 17 الحنق.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> الكاشف </td><td> كتالوج رقم </td><td> شركة </td></tr><tr><td> يبوفيتش L - 15 ، أي أحمر الفينول </td><td> 21083-027 </td><td> GIBCO ، بواسطة تقنيات الحياة </td></tr><tr><td> DMEM + Glutamax - I </td><td> 31966 </td><td> GIBCO ، بواسطة تقنيات الحياة </td></tr><tr><td> الجنين مصل البقر (FBS) </td><td> SV30160.03 </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> 0.05 ٪ التربسين EDTA </td><td> SH30236.01 </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> البنسلين الستربتوميسين </td><td> SV30010 </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> 14287 </td><td> GIBCO ، بواسطة تقنيات الحياة </td></tr><tr><td> بوروميسين </td><td> P8833 </td><td> سيغما الدريخ </td></tr></tbody></table>

monitoring kinase and phosphatase activities through the cell cycle by ratiometric fret

فورستر نقل الطاقة الرنين (الحنق) على أساس السماح للصحفيين 1 تقييم كيناز الذاتية والأنشطة الفوسفاتيز في الخلايا الحية. وعادة ما تتألف مثل هذه التحقيقات من المتغيرات من CFP وYFP ، تدخلت تسلسل phosphorylatable مجال الفوسفات وملزم. على الفسفرة ، والتشكل التغييرات التحقيق ، مما يؤدي الى تغيير في المسافة أو الميل بين CFP وYFP ، مما يؤدي إلى تغيير في كفاءة الحنق (الشكل 1). وقد نشرت تحقيقات عدة خلال العقد الماضي ، ورصد تحركات التوازن نشاط متعددة وphosphatases ، بما في ذلك مراسلي PKA 2 ، 3 PKB ، PKC 4 ، 5 PKD ، إرك 6 ، 7 JNK ، CDK 18 ، أورورا B 9 و 9 Plk1 . نظرا لتصميم وحدات ، تحقيقات إضافية من المرجح أن تظهر في 10 في المستقبل القريب. يتأثر تطور خلال دورة الخلية signali الإجهاد11 نانوغرام المسارات. على وجه الخصوص ، وينظم دورة الخلية بشكل مختلف خلال رابط الجأش النمو بالمقارنة مع الخلايا عندما يتماثلون للشفاء من الإجهاد 12. الوقت الفاصل بين التصوير من الخلايا من خلال دورة الخلية لذا يتطلب الحذر خاصة. هذا يصبح مشكلة خاصة عندما توظف ratiometric التصوير ، لأن المطلوب صورتين مع اشارة الى ارتفاع نسبة الضوضاء إلى تفسير صحيح للنتائج. Ratiometric الحنق وقد تم التصوير في الغالب من التغيرات في دورة الخلية تعتمد أنشطة كيناز والفوسفاتيز يقتصر على أقسام فرعية للدورة الخلية 8،9،13،14. هنا ، نحن نناقش طريقة لرصد الحنق على أساس تحقيقات باستخدام التصوير ratiometric طوال دورة الخلية البشرية. أسلوب يعتمد على المعدات التي تتوفر لكثير من الباحثين في علوم الحياة و لا يتطلب معرفة متخصصة المجهري أو معالجة الصور.

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET at JoVE.com

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

يتزايد استخدام الحنق المستندة للصحفيين لرصد كيناز والفوسفاتيز الأنشطة في الخلايا الحية. نحن هنا وصف الأسلوب على كيفية استخدام الحنق المستندة للصحفيين لتقييم دورة الخلية التي تعتمد على التغيرات في الفسفرة الهدف.

رصد كيناز والفوسفاتيز الأنشطة من خلال دورة الخلية التي Ratiometric الحنق

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

monitoring-kinase-phosphatase-activities-through-cell-cycle

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

14.2K Views.  Karolinska Institutet. يتزايد استخدام الحنق المستندة للصحفيين لرصد كيناز والفوسفاتيز الأنشطة في الخلايا الحية. نحن هنا وصف الأسلوب على كيفية استخدام الحنق المستندة للصحفيين لتقييم دورة الخلية التي تعتمد على التغيرات في الفسفرة الهدف.

Video: Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

Drawing Blood from Rats through the Saphenous Vein and by Cardiac Puncture

Drawing blood from rodents is necessary for a large number of both in vitro and in vivo studies. Sites of blood draws are numerous in rodents: retro-orbital sinus, jugular vein, maxillary vein, saphenous vein, heart. Each technique has its advantages and disadvantages, and some are not approved any more in some countries (e.g., retro-orbital draws in Holland). A discussion of different techniques for drawing blood are available 1-3.
Here, we present two techniques for drawing blood from rats, each with its specific applications.
Blood draw from the saphenous vein, provided it is done properly, induces minimal distress in animals and does not require anesthesia. This technique allows repeated draws of small amounts of blood, such as needed for pharmacokinetic studies 4,5, determining plasma chemistry, or blood counts 6.
Cardiac puncture allows the collection of large amounts of blood from a single animal (up to 10 ml of blood can be drawn from a 150 g rat). This technique is therefore very useful as a terminal procedure when drawing blood from the saphenous would not provide a large enough sample. We use cardiac puncture when we need sufficient amounts of serum from a specific strain of rats to grow T lymphocyte lines in vitro 4-9.

Blood draws are necessary in a large number of studies, for example to study the pharmacokinetics profile of a compound. Here, we demonstrate how to draw blood from rats using two techniques: blood draw from the saphenous vein or by cardiac puncture.

سحب الدم من الفئران عن طريق الوريد الصافن والبزل القلب

Drawing blood from rodents is necessary for a large number of both in vitro and in vivo studies. Sites of blood draws are numerous in rodents: ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

تحليل المركز دورة الخلية في خلايا الثدييات

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

الحنق المجهر لمراقبة الوقت الحقيقي من أحداث في اشارة الخلايا الحية باستخدام أجهزة الاستشعار Unimolecular

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into nucleosomes. Thermodynamics of dsDNA bending has been studied by a method called cyclization which relies on DNA ligase to covalently join short sticky ends of a dsDNA. However, ligation efficiency can be affected by many factors that are not related to dsDNA looping such as the DNA structure surrounding the joined sticky ends, and ligase can also affect the apparent looping rate through mechanisms such as nonspecific binding. Here, we show how to measure dsDNA looping kinetics without ligase by detecting transient DNA loop formation by FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). dsDNA molecules are constructed using a simple PCR-based protocol with a FRET pair and a biotin linker. The looping probability density known as the J factor is extracted from the looping rate and the annealing rate between two disconnected sticky ends. By testing two dsDNAs with different intrinsic curvatures, we show that the J factor is sensitive to the intrinsic shape of the dsDNA.

This study presents a detailed experimental procedure to measure looping dynamics of double-stranded DNA using single-molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). The protocol also describes how to extract the looping probability density called the J factor.

دراسة الحمض النووي عن طريق حلقات جزيء واحد الحنق

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

جيل المعدلة وراثيا<em&gt; حيدرة</em&gt; من جانب الأجنة حقن مكروي

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells. In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on unsynchronized cells making it difficult to order the temporal events required for cell cycle progression, genome replication, and division. Caulobacter crescentus provides an excellent model system for the bacterial cell cycle whereby cells can be rapidly synchronized in a G0 state by density centrifugation. Cell cycle synchronization experiments have been used to establish the molecular events governing chromosome replication and segregation, to map a genetic regulatory network controlling cell cycle progression, and to identify the establishment of polar signaling complexes required for asymmetric cell division. Here we provide a detailed protocol for the rapid synchronization of Caulobacter NA1000 cells. Synchronization can be performed in a large-scale format for gene expression profiling and western blot assays, as well as a small-scale format for microscopy or FACS assays. The rapid synchronizability and high cell yields of Caulobacter make this organism a powerful model system for studies of the bacterial cell cycle.

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

Synchronization of bacterial cells is essential for studies of the bacterial cell cycle and development. Caulobacter crescentus is synchronizable through density centrifugation allowing a rapid and powerful tool for studies of the bacterial cell cycle. Here we provide a detailed protocol for the synchronization of Caulobacter cells.

تزامن<em&gt; العنيقاء Crescentus</em&gt; للتحقيق في دورة الخلية البكتيرية

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells.  In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on ...

Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The nuclear-encoded proteins are transported into mitochondria guided by their mitochondria targeting sequences (MTS); however, a majority of mitochondrial localized proteins lack an identifiable MTS. Nevertheless, the fact that MTS can instruct proteins to go into the mitochondria provides a valuable tool for studying mitochondrial functions of normally nuclear and/or cytoplasmic proteins. We have recently identified the cell cycle kinase CyclinB1/Cdk1 complex in the mitochondria. To specifically study the mitochondrial functions of this complex, mitochondrial overexpression and knock-down of this complex without interfering with its nuclear or cytoplasmic functions were essential. By tagging CyclinB1/Cdk1 with MTS, we were able to achieve mitochondrial overexpression of this complex to study its mitochondrial targets as well as functions. Via tagging dominant-negative Cdk1 with MTS, inhibition of Cdk1 activity was accomplished particularly in the mitochondria. Potential mitochondrial targets of CyclinB1/Cdk1 complex were identified using a gel-based proteomics approach. Unlike traditional 2D gel analysis, we employed 2-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE) technology followed by phosphoprotein staining to fluorescently label differentially phosphorylated proteins in mitochondrial Cdk1 expressing cells. Identification of phosphoprotein spots that were altered in wild type versus dominant negative Cdk1 bearing mitochondria revealed the identity of mitochondrial targets of Cdk1. Finally, to determine the effect of CyclinB1/Cdk1 mitochondrial localization in cell cycle progression, a cell proliferation assay using a synthetic thymidine analogue EdU (5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine) was used to monitor the cells as they go through the cell cycle and replicate their DNA. Altogether, we demonstrated a variety of approaches available to study mitochondrial localization and activity of a cell cycle kinase. These are advanced, yet easy to follow methods that will be beneficial to many cell biology researchers.

Here, we outline how to study mitochondrial localization of a (cell cycle) kinase, and how to determine its sub-mitochondrial location as well as potential mitochondrial substrates/targets. Forced expression of proteins into the mitochondria provides a useful tool for studying the functional consequences of mitochondrial localization of a protein of interest.

المناهج التجريبية لدراسة الميتوكوندريا التعريب وظيفة من دورة الخلية النووية كيناز، Cdk1

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

برازي تحليل جلايكورتيكود: رصد الغدة الكظرية غير الغازية في الخيليات

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

G Protein-selective GPCR Conformations Measured Using FRET Sensors in a Live Cell Suspension Fluorometer Assay

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group developed an intra-molecular FRET sensor to detect the interaction between G&#945; subunits and GPCRs in live cells following agonist stimulation. Here, we detail the protocol for detecting changes in FRET between the &#946;2-adrenergic receptor and the G&#945;s C-terminus peptide upon treatment with 100 &#181;M isoproterenol hydrochloride as previously characterized1. Our FRET sensor is a single polypeptide consisting serially of a full-length GPCR, a FRET acceptor fluorophore (mCitrine), an ER/K SPASM (systematic protein affinity strength modulation) linker, a FRET donor fluorophore (mCerulean), and a G&#945; C-terminal peptide. This protocol will detail cell preparation, transfection conditions, equipment setup, assay execution, and data analysis. This experimental design detects small changes in FRET indicative of protein-protein interactions, and can also be used to compare the strength of interaction across ligands and GPCR-G protein pairings. To enhance the signal-to-noise in our measurements, this protocol requires heightened precision in all steps, and is presented here to enable reproducible execution.

Simple methods to detect the selective activation of G proteins by G protein-coupled receptors remain an outstanding challenge in cell signaling. Here, F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET) biosensors have been developed by pairwise tethering a GPCR to G protein peptides to probe conformational changes at controlled concentrations in live cells.

موافقات لهذه العملية من G البروتين انتقائية تقاس باستخدام الحنق مجسات في لايف تعليق خلية التألق الفحص

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group ...

Real-Time Monitoring of Aurora kinase A Activation using Conformational FRET Biosensors in Live Cells

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon its autophosphorylation on Thr288. AURKA abundance peaks in mitosis, where it controls the stability and the fidelity of the mitotic spindle, and the overall efficiency of mitosis. Although well characterized at the structural level, a consistent monitoring of the activation of AURKA throughout the cell cycle is lacking. A possible solution consists in using genetically-encoded F&#246;rster&#8217;s Resonance Energy Transfer (FRET) biosensors to gain insight into the autophosphorylation of AURKA with sufficient spatiotemporal resolution. Here, we describe a protocol to engineer FRET biosensors detecting Thr288 autophosphorylation, and how to follow this modification during mitosis. First, we provide an overview of possible donor/acceptor FRET pairs, and we show possible cloning and insertion methods of AURKA FRET biosensors in mammalian cells. Then, we provide a step-by-step analysis for rapid FRET measurements by fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) on a custom-built setup. However, this protocol is also applicable to alternative commercial solutions available. We conclude by considering the most appropriate FRET controls for an AURKA-based biosensor, and by highlighting potential future improvements to further increase the sensitivity of this tool.

The activation of the multifunctional Ser/Thr kinase AURKA is hallmarked by its autophosphorylation on Thr288. Fluorescent probes relying on FRET can discriminate between its inactive and activated states. Here, we illustrate some strategies for probe engineering, together with a rapid FRET protocol to follow the kinase activation throughout mitosis.

المراقبة في الوقت الحقيقي لتنشيط Aurora kinase A باستخدام أجهزة الاستشعار الحيوية FRET التوافقية في الخلايا الحية

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon ...