فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور كريس تايلور (جامعة ولاية أوهايو) لإدخال التكنولوجيا شعر الجذر إلى مختبرنا والدكاترة. Senthil سوبرامانيان (جنوب داكوتا جامعة ولاية) ، وخوان تشانغ (Ludong جامعة شاندونغ الصين) لتحسين البروتوكول. كما نشكر الدكتور تشنغ هاو (الزراعة جامعة نانجينغ) ليساعد في صنع هذا الفيديو. ويدعم هذا العمل في جزء من المنح المقدمة من وزارة الطاقة (DE - SC0001295) ، جبهة الخلاص الوطني (MCB - 0923779) وزارة الزراعة (2010-65116-20514) لOY

وقد استخدم البروتوكول التالي لإنشاء محطات الجذر شعر مركب في أنواع البقول طراز M. truncatula. وقد تم تكييف بروتوكولات مماثلة لأنواع النباتات لا يقل عن ثمانية 1-4. استخدمنا M. truncatula النباتات الجذرية شعر مركب لدراسة وظائف الجينات في جذر والتنمية العقيدات. تم فصل البروتوكول إلى أربعة أقسام : 1) إعداد المواد النباتية ؛ 2) محطات توليد جذر شعر مركب ، 3) التكافلية العدوى الوزن الرطب ؛ و 4) المعدلة وراثيا تحديد الجذر. استخدمنا ناقلات الثنائية التي تحتوي على بروتين الفلورية الخضراء (GFP) الجين كمراسلة لفحص جذور النباتات المعدلة وراثيا في مركب 3. مقارنة مع المضادات الحيوية القائمة على الاختيار ، القائم على الفحص GFP سريعة ، سهلة ، وغير مكلفة. في بناء لدينا ، هو الدافع وراء ER - التعبير الأمثل عن طريق الجينات GFP مروج للاليوبيكويتين السوبر ، الذي إشارات قوية في الجذور التأسيسية GFP المعدلة وراثيا ، مما يسمح للجذور التمييز بسهولة بين المعدلة وراثيا وغير المعدلة وراثيا. 1. إعداد مواد نباتية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتم حصاد البذور M. truncautla من النباتات التي تزرع في الدفيئة (الرطوبة النسبية 50 ٪ ، 16 / 8 ح الضوء / الظلام ، 22/18 درجة مئوية اليوم / الليلة درجة الحرارة). ويمكن تخزين البذور الناضجة في 4 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ومشطوب البذور في حوالي 100 مل من حامض الكبريتيك 10 المركزة (95-98 ٪ ، سيغما الدريخ ، MO) لمدة 10 دقيقة مع اهتزاز الدورية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم شطف البذور 5-7 مرات بالماء المعقم مع الإثارة لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم يتم نقع البذور في الماء في درجة حرارة الغرفة لمدة 6 ساعات والاحتفاظ بها في 4 درجات مئوية لمدة 36-48 ساعة لمزامنة الإنبات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتنتشر حوالي 20-30 البذور على أوراق الترشيح رطبة توضع في طبق بتري. يتم الاحتفاظ بها عند 22 درجة مئوية ، مع 16 / 8 ح الضوء / الظلام دورة ، و 40 μmol.m -2. ق شدة الضوء -1 ، لمدة 5-6 أيام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم نقل الشتلات نبتت في التربة ، ووضعها في الاحتباس الحراري لمدة شهر. </li></ol> 2. محطات توليد جذر مركب مشعر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحولت يبني ثنائي تحمل جينات من الاهتمام إلى A. rhizogenes باستخدام البروتوكولات القياسية. وهندستها لدينا مجموعة من ناقلات ثنائية تحتوي على الجين GFP كعلامة التي تسهل فحص الأنسجة وراثيا. تحتوي هذه النواقل المختلفة والمروجين لها جميع مواقع الاستنساخ عبارة (Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا) للتعبير عن مدى أو إسكات الجينات المستهدفة 3،5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هو مثقف rhizogenes ألف رطل في المتوسط ​​50ml مع اختيار المضادات الحيوية المناسبة عند 28 درجة مئوية لمدة 16-24 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجمع البكتيريا وإعادة تعليق على التركيز النهائي للOD 600 = 0.3 في النيتروجين خالية من المغذيات النباتية حل (الجدول رقم 1 و 6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شعر لدعم التجديد الجذري ، ومصفوفة دعم معقمة (&quot;الصوف الصخري&quot; ، Hummert الدولية ، والأرض ، مدينة MO) ويقتطع من المقابس من حوالي 3 سم 3. نضع 4 شمعات في طبق بتري واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وشوهدت حفرة على رأس كل المكونات باستخدام ماصة الحافة لتسهيل إدخال explants ألف. يضاف rhizogenes (5 مل) إلى كل المكونات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويستأصل قسم تبادل لاطلاق النار مع البراعم الإبطية 2-3 قبل قطع مائلة. ثم يتم إدراج يزدرع في المكونات ، ونمت عند 22 درجة مئوية لمدة نحو ثلاثة أسابيع. علينا أن نحافظ على explants Medicago دون سقي في الأيام ال 10 الأولى ، ثم ، والمياه لهم حل النيتروجين 5 مل خالية عند الضرورة. وجدنا ان ازالة النسيج الإنشائي القمي قد تقلل من تشكيل جذور العرضي. </li></ol> 3. التكافلية الوزن الرطب (Sinorhizobium Meliloti) العدوى <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ثلاثة أسابيع ، فإن بعض جذور عرضية تخرج من الصوف الصخري. يتم نقل النباتات الجذرية شعر مركب إلى الرمل أو الفيرميكوليت (معقمة) ، مع أو من دون الصوف الصخري. أنها نمت في الاحتباس الحراري الى 22 درجة مئوية ، 16 / 8 ح الضوء / الظلام دورة ، و 300 μmol.m -2. ق -1 شدة الضوء لمدة أكثر من أسبوع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الوزن الرطب قبل الإصابة ، S. هو مثقف meliloti 1201 في 50 - استخراج مانيتول الخميرة مل متوسطة لمدة 7 أيام عند 30 درجة مئوية (الجدول رقم 2 ، و6،7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مخففة إعادة علقت خلايا الوزن الرطب إلى تركيز النهائي من OD 600 = 0.08 باستخدام النيتروجين حل التغذية الحرة. وتعليق 10 مل جديدة من S. تم تطبيق meliloti لكل مصنع المركبة للحث على تشكيل العقيدات. </li></ol> 4. تحديد الجذر المعدلة وراثيا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد اسبوعين من التلقيح الوزن الرطب ، والنباتات مركب تصل الجذور عن طريق الغسيل في الماء. يمكن فصلها بسهولة الجذور من رمال أو البيرلايت في الماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضع جذور شعر تحت المجهر الأشعة فوق البنفسجية (نيكون SMZ1500 ، الإثارة 460 500nm ، 505nm مزدوج اللون ، الحاجز أكثر من 510nm). جذور المعدلة وراثيا هي GFP إيجابية والجذور هي العارض GFP سلبية. ثم نجمعها accordin الجذورز إشارة GFP ، وتحصي أعداد العقيدات ، وقياس طول الجذر ، وحساب الجذر الوحشي الكثافة. وتستخدم جذور GFP السلبية السيطرة. </li></ol> 5. ممثل النتيجة في تجربتنا ، وإعادة إحياء جذور الشعر الجديد من explants في 2-3 أسابيع بعد A. rhizogenes innoculation. تحت المجهر الأشعة فوق البنفسجية ، والجذور وراثيا تحمل جينات GFP تظهر قوية مخضر (الشكل 1). وكان 25 ٪ من جذور أنتجت كمية من الجذور وإعادة إحياء جزء من جذور GFP إيجابية تعتمد على ظروف وبيئة explants نمو متوسط ​​plants.On المركب وجذور شعر المعدلة وراثيا 3 لزيادة كفاءة التحول ، 1) عذاب غطاء من البلاستيك ، كما هو موضح في شريط الفيديو ، ويكفي للحفاظ على الرطوبة في علبة النمو خلال الأيام القليلة الأولى ، والنباتات لا تتطلب سوى القليل من الماء في الأيام القليلة الأولى. الري المفرط يضر تشكيل جذور شعر ؛ 2) تركيز innoculant الأجرعية مهم للتحول. كمية زائدة من الخلايا ليست مفيدة لتشكيل جذور شعر أو تشكيل العقيدات. لتكوين العقيدات ، والحل يحتاج إلى سقي النيتروجين خالية ، وإلا فإن العقيدات القليلة النموذج. يمكن أن تتولد جذور النباتات شعر مركب باستخدام النبتات أو الشتلات entact كمادة انطلاق. تعديلات طفيفة على البروتوكول أعلاه هي ncessary لتوليد جذور شعر من الأنسجة الأخرى 8. الأهم من ذلك ، شعر كل جذر هو حدث التحول مستقلة. ولذلك ، فإن الظواهر التي لوحظت في مصنع واحد مركب من مجموع الأحداث transforamtion عديدة تحتاج إلى تأكيد من التكرار في محطات متعددة مركب <img src="/files/ftp_upload/2633/2633fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. يمكن فرز ألف جذور المعدلة وراثيا في الفترة من جذور شعر. وتم تشكيل العقيدات باء في جذور النباتات شعر مركب ، ونحن وضعت لمدة 4 أسابيع من العمر م. النباتات يمكن truncatula الجذر شعر تحت المجهر الأشعة فوق البنفسجية وجذور GFP إيجابية التعرف عليها بسهولة. (السهم الأحمر : GFP الجذرية ؛ السهم الأصفر : عدم GFP الجذر) <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> الأوراق المالية </td><td> g/200ml </td><td> الأسهم مل / لتر </td></tr><tr><td> MgSO 4 0.7 H 2 O </td><td> 12.3 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> CaCl 2 0.2 H 2 O </td><td> 14.7 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> K 2 4 هبو 0.3 H 2 O </td><td> 6.8 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> K 2 SO 4 </td><td> 11 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> 3 الحديد الكلورين 0.6 H 2 O </td><td> 0.49 </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> المغذيات الدقيقة </td><td> انظر أدناه </td><td> 1 </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> المغذيات الدقيقة </td><td> ز للتر الواحد </td></tr><tr><td> H 3 BO 3 </td><td> 0،142 </td></tr><tr><td> MnSO 4. H 2 O </td><td> 0،077 </td></tr><tr><td> 4 ZnSO 0.7 H 2 O </td><td> 0.1725 </td></tr><tr><td> كبريتات النحاس 0.5 4 H 2 O </td><td> 0،037 </td></tr><tr><td> NaMoO 4. H 2 O </td><td> 0،024 </td></tr><tr><td> كوكلي 2. H 2 O </td><td> 0.0025 </td></tr><tr><td> NISO 4 </td><td> 0،001 </td></tr></tbody></table> الجدول 1. الحل التغذية Nitogen خالية <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> K 2 HPO4 </td><td> 0.5g </td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم </td><td> 0.1g </td></tr><tr><td> MgSO 4 · 7H 2 O </td><td> 0.2g </td></tr><tr><td> مستخلصات الخميرة </td><td> 0.4g </td></tr><tr><td> مانيتول </td><td> 10G </td></tr><tr><td> الرقم الهيدروجيني = 6.8 </td><td></td></tr></tbody></table> الجدول 2. خلاصة الخميرة المتوسطة مانيتول (لتر)

<ol>
	<li>Limpens, E., Ramos, J., Franken, C., Raz, V., Compaan, B., Franssen, H., Bisseling, T., Geurts, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+in+Agrobacterium+rhizogenes-transformed+roots+of+Arabidopsis+and+Medicago+truncatula.">RNA interference in Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Arabidopsis and Medicago truncatula.</a> J. Exp. Bot. 55, 983-992 (2004).</li><li>Collier, R., Fuchs, B., Walter, N., Kevin, L. W., Taylor, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vitro+composite+plants:+an+inexpensive,+rapid+method+for+root+biology.">Ex vitro composite plants: an inexpensive, rapid method for root biology.</a> Plant J. 43, 449-457 (2005).</li><li>Zhang, J., Subramanian, S., Stacey, G., Yu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavones+and+flavonols+play+distinct+critical+roles+during+nodulation+of+Medicago+truncatula+by+Sinorhizobium+meliloti.">Flavones and flavonols play distinct critical roles during nodulation of Medicago truncatula by Sinorhizobium meliloti.</a> Plant J. 57, 171-183 (2009).</li><li>Boisson-Dernier, A., Chabaud, M., Garcia, F., Becard, G., Rosenberg, C., Barker, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-rhizogenes-transformed+roots+of+Medicago+truncatula+for+the+study+of+nitrogen-fixing+and+endomycorrhizal+symbiotic+associations.">Agrobacterium-rhizogenes-transformed roots of Medicago truncatula for the study of nitrogen-fixing and endomycorrhizal symbiotic associations.</a> Mol. Plant-Microbe Interact. 14, 695-700 (2001).</li><li>Zhang, J., Subramanian, S., Zhang, Y., Yu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavone+synthases+from+Medicago+truncatula+are+flavanone-2-hydroxylases+and+are+important+for+nodulation.">Flavone synthases from Medicago truncatula are flavanone-2-hydroxylases and are important for nodulation.</a> Plant Physiol. 144, 741-751 .</li><li>Subramanian, S., Hu, X., Lu, G., Odelland, J., Yu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promoters+of+two+isoflavone+synthase+genes+respond+differentially+to+nodulation+and+defense+signals+in+transgenic+soybean+roots.">The promoters of two isoflavone synthase genes respond differentially to nodulation and defense signals in transgenic soybean roots.</a> Plant Mol Biol. 54, 623-639 (2004).</li><li>Vincent, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A manual for the practical study of root nodule bacteria International Biological Program Handbook. , 1-13 (1970).</li><li>Subramanian, S., Graham, M. Y., Yu, O., Graham, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Interference+of+Soybean+Isoflavone+Synthase+Genes+Leads+to+Silencing+in+Tissues+Distal+to+the+Transformation+Site+and+to+Enhanced+Susceptibility+to+Phytophthora+sojae.">RNA Interference of Soybean Isoflavone Synthase Genes Leads to Silencing in Tissues Distal to the Transformation Site and to Enhanced Susceptibility to Phytophthora sojae.</a> Plant Physiol. 137, 1345-1353 (2005).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

محطة توليد شعر جذر مركب هو وسيلة سريعة وسهلة للحصول على كميات كبيرة من المواد المعدلة وراثيا عن الأنواع dicot كثيرة. على الرغم من أن هذه الطريقة لا يمكن ان تنتج البذور المعدلة وراثيا ، يمكن أن تنتج المواد المعدلة وراثيا في غضون بضعة أسابيع. الأسلوب هو مناسبة خاصة بالنسبة للنباتات التي تجد صعوبة إقامة مزارع الأنسجة أو توليد transformants مستقرة. على مر السنين ، وقد استخدمنا هذه التقنية لدراسة وظائف الجينات ووظائفها المروج ، microRNAs ، الجذر الوحشي والتنمية الجذرية ، والدفاع ، واستجابات التوتر اللاأحيائية ، nodulation والعمليات التكافلية الأخرى ، والاستجابات هرمون التنميط الأيضية ، والتنميط الجيني ، وتحليل البروتين ، و غيرها من العمليات البيولوجية. البروتوكول هو قوية وقابلة للتكرار.

generation of composite plants in medicago truncatula used for nodulation assays

مشابهة لtumerfaciens الأجرعية ، يمكن rhizogenes الأجرعية نقل السلطات الوطنية المعينة الاجانب الى خلايا النبات على أساس الحكم الذاتي الذي يحفز الجذر (ري) البلازميد ألف. يمكن أن يسبب شعر rhizogenes تشكيل الجذر على الأنسجة النباتية والنباتات شكل مركب بعد التحول. مركب على هذه النباتات ، وبعض من الجذور وإعادة إحياء المعدلة وراثيا ، التي تحمل نوع T - DNA البرية وناقلات ثنائية هندسيا ، بينما يطلق النار لا تزال غير المعدلة وراثيا ، ويعملون على توفير الطاقة ودعم النمو. وهذه النباتات جذر شعر مركب لا تنتج البذور المعدلة وراثيا ، ولكن هناك عددا من الميزات الهامة التي تجعل من هذه النباتات المركبة مفيدة جدا في مجال البحوث النباتية. أولا ، مع طائفة واسعة المضيف ، A. ويمكن تحويل rhizogenes الأنواع النباتية كثيرة ، ولا سيما dicots ، مما يسمح للهندسة الوراثية في مجموعة متنوعة من الأنواع. الثانية ، A. rhizogenes يصيب الأنسجة وexplants مباشرة ، ولا الثقافات الأنسجة قبل التحول من الضروري الحصول على النباتات المركبة ، مما يجعلها مثالية لتحويل الأنواع النباتية المتمردة. وعلاوة على ذلك ، يمكن توليد أنسجة الجذر المعدلة وراثيا في غضون أسابيع. لtruncatula Medicago ، يمكننا الحصول على الجذور كما المعدلة وراثيا في فترة قصيرة تبلغ ثلاثة أسابيع ، وأسرع من الانخفاض الطبيعي التحول الأزهار Arabidopsis. عموما ، وشعر تكنولوجيا جذور النباتات المركب هو أداة مرنة ومفيدة لدراسة وظائف الجينات والجذر الظواهر ذات الصلة. هنا علينا أن نظهر كيف يمكن استخدام جذور النباتات شعر مركب لدراسة النباتات الريزوبيم التفاعلات وnodulation في M. يصعب تحويل الأنواع truncatula.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Composite Plants in Medicago truncatula used for Nodulation Assays at JoVE.com

Generation of Composite Plants in Medicago truncatula used for Nodulation Assays

نظهر كيف يمكن استخدام جذور النباتات شعر مركب لدراسة النباتات الريزوبيم التفاعلات وnodulation في الأنواع يصعب تحويل -<em&gt; Medicago truncatula</em&gt;.

جيل من النباتات في المركب Medicago truncatula تستخدم لفحوصات Nodulation

Similar to Agrobacterium tumerfaciens, Agrobacterium rhizogenes can transfer foreign DNAs into plant cells based on the autonomous root-inducing (Ri) ...

generation-composite-plants-medicago-truncatula-used-for-nodulation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Composite Plants in Medicago truncatula used for Nodulation Assays

16.0K Views.  Donald Danforth Plant Science Center. نظهر كيف يمكن استخدام جذور النباتات شعر مركب لدراسة النباتات الريزوبيم التفاعلات وnodulation في الأنواع يصعب تحويل - Medicago truncatula.

Video: Generation of Composite Plants in Medicago truncatula used for Nodulation Assays

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical shock or electrical stimulation is available for study of various aspects of seizure activity and behavior. All flies, including wild-type, will undergo seizure-like activity if stimulated at a high enough voltage. Seizure like activity is an all-or-nothing response and each genotype has a specific seizure threshold. The seizure threshold of a specific genotype of fly can be altered either by treatment with a drug or by genetic suppression or enhancement. The threshold is easily measured by electrophysiology. Seizure-like activity can be induced via high frequency electrical stimulation delivered directly to the brain and recorded through the dorsal longitudinal muscles (DLMs) in the thorax. The DLMs are innervated by part of the giant fiber system. Starting with low voltage, high frequency stimulation, and subsequently raising the voltage in small increments, the seizure threshold for a single fly can be measured.

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Using high frequency electrical stimulation, seizure-like activity can be induced in Drosophila. This activity is easily recorded from the giant fiber system.

فحوصات Neurocircuit عن المضبوطات في المسوخ من الصرع ذبابة الفاكهة</em

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal regeneration and sprouting by secreting growth factors 1,2 and providing growth promoting adhesion molecules 3 and extracellular matrix molecules 4. In addition they myelinate the demyelinated axons at the site of injury 5.
However following transplantation, Schwann cells do not migrate from the site of implant and do not intermingle with the host astrocytes 6,7. This results in formation of a sharp boundary between the Schwann cells and astrocytes, creating an obstacle for growing axons trying to exit the graft back into the host tissue proximally and distally. Astrocytes in contact with Schwann cells also undergo hypertrophy and up-regulate the inhibitory molecules 8-13.
In vitro assays have been used to model Schwann cell-astrocyte interactions and have been important in understanding the mechanism underlying the cellular behaviour.
These in vitro assays include boundary assay, where a co-culture is made using two different cells with each cell type occupying different territories with only a small gap separating the two cell fronts. As the cells divide and migrate, the two cellular fronts get closer to each other and finally collide. This allows the behaviour of the two cellular populations to be analyzed at the boundary. Another variation of the same technique is to mix the two cellular populations in culture and over time the two cell types segregate with Schwann cells clumped together as islands in between astrocytes together creating multiple Schwann-astrocyte boundaries.
The second assay used in studying the interaction of two cell types is the migration assay where cellular movement can be tracked on the surface of the other cell type monolayer 14,15. This assay is commonly known as inverted coverslip assay. Schwann cells are cultured on small glass fragments and they are inverted face down onto the surface of astrocyte monolayers and migration is assessed from the edge of coverslip.
Both assays have been instrumental in studying the underlying mechanisms involved in the cellular exclusion and boundary formation. Some of the molecules identified using these techniques include N-Cadherins 15, Chondroitin Sulphate proteoglycans(CSPGs) 16,17, FGF/Heparin 18, Eph/Ephrins19.
This article intends to describe boundary assay and migration assay in stepwise fashion and elucidate the possible technical problems that might occur.

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

This article intends to describe in stepwise fashion the commonly used in vitro assays used in studying Schwann cell-asrtocyte interactions.

تحليل شفان نجمية طريق التفاعلات في المختبر فحوصات

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene expression. Microarray and next generation sequencing approaches are being used to investigate developmental, physiological and stress response processes, dissect epigenetic and small RNA pathways, and build large gene regulatory networks1-3. While these techniques facilitate the simultaneous analysis of large gene sets, they typically provide a very limited spatiotemporal resolution of gene expression changes. This limitation can be partially overcome by using either profiling method in conjunction with lasermicrodissection or fluorescence-activated cell sorting4-7. However, to fully understand the biological role of a gene, knowledge of its spatiotemporal pattern of expression at a cellular resolution is essential. Particularly, when studying development or the effects of environmental stimuli and mutants can the detailed analysis of a gene's expression pattern become essential. For instance, subtle quantitative differences in the expression levels of key regulatory genes can lead to dramatic phenotypes when associated with the loss or gain of expression in specific cell types. 
Several methods are routinely used for the detailed examination of gene expression patterns. One is through analysis of transgenic reporter lines. Such analysis can, however, become time-consuming when analyzing multiple genes or working in plants recalcitrant to transformation. Moreover, an independent validation to ensure that the transgene expression pattern mimics that of the endogenous gene is typically required. Immunohistochemical protein localization or mRNA in situ hybridization present relatively fast alternatives for the direct visualization of gene expression within cells and tissues. The latter has the distinct advantage that it can be readily used on any gene of interest. In situ hybridization allows detection of target mRNAs in cells by hybridization with a labeled anti-sense RNA probe obtained by in vitro transcription of the gene of interest. 
Here we outline a protocol for the in situ localization of gene expression in plants that is highly sensitivity and specific. It is optimized for use with paraformaldehyde fixed, paraffin-embedded sections, which give excellent preservation of histology, and DIG-labeled probes that are visualized by immuno-detection and alkaline-phosphatase colorimetric reaction. This protocol has been successfully applied to a number of tissues from a wide range of plant species, and can be used to analyze expression of mRNAs as well as small RNAs8-14.

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

The in situ hybridization protocol described here allows a direct localization of mRNA and small RNA expression at the cellular level with high sensitivity and specificity. The procedure is optimized for paraffin-embedded plant tissue sections, is applicable to a wide range of plants and tissues, and can be completed within ten days.

في الموقع التهجين لتوطين دقيقة من النصوص في النباتات

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

فحوصات بالإضافة لرصد طوي ثانية بروتين في<em&gt; خميرة الخباز</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Viability Assays for Cells in Culture

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized viability assays are expensive in terms of equipment but can be faster and more objective than manual cell counts. The present report describes the use of three such viability assays. Two of these assays are infrared and one is luminescent. Both infrared assays rely on a 16&#160;bit Odyssey Imager. One infrared assay uses the DRAQ5 stain for nuclei combined with the Sapphire stain for cytosol and is visualized in the 700 nm channel. The other infrared assay, an In-Cell Western, uses antibodies against cytoskeletal proteins (&#945;-tubulin or microtubule associated protein 2) and labels them in the 800 nm channel. The third viability assay is a commonly used luminescent assay for ATP, but we use a quarter of the recommended volume to save on cost. These measurements are all linear and correlate with the number of cells plated, but vary in sensitivity. All three assays circumvent time-consuming microscopy and sample the entire well, thereby reducing sampling error. Finally, all of the assays can easily be completed within one day of the end of the experiment, allowing greater numbers of experiments to be performed within short timeframes. However, they all rely on the assumption that cell numbers remain in proportion to signal strength after treatments, an assumption that is sometimes not met, especially for cellular ATP. Furthermore, if cells increase or decrease in size after treatment, this might affect signal strength without affecting cell number. We conclude that all viability assays, including manual counts, suffer from a number of caveats, but that computerized viability assays are well worth the initial investment. Using all three assays together yields a comprehensive view of cellular structure and function.

Therapeutic compounds are often first examined in vitro with viability assays. Blind cell counts by a human observer can be highly sensitive to small changes in cell number but do not assess function. Computerized viability assays, as described here, can assess both structure and function in an objective manner.

فحوصات قابلية للخلايا في الثقافة

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

كفاءة الجيل المستحثة الإنسان افرة القوة الخلايا الجذعية من الخلايا الجسدية البشرية مع سينداي الفيروسات

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

Most techniques used to study small molecules, such as pharmaceutical drugs or endogenous metabolites, employ tissue extracts which require the homogenization of the tissue of interest that could potentially cause changes in the metabolic pathways being studied1. Mass spectrometric imaging (MSI) is a powerful analytical tool that can provide spatial information of analytes within intact slices of biological tissue samples1-5. This technique has been used extensively to study various types of compounds including proteins, peptides, lipids, and small molecules such as endogenous metabolites. With matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI)-MSI, spatial distributions of multiple metabolites can be simultaneously detected. Herein, a method developed specifically for conducting untargeted metabolomics MSI experiments on legume roots and root nodules is presented which could reveal insights into the biological processes taking place. The method presented here shows a typical MSI workflow, from sample preparation to image acquisition, and focuses on the matrix application step, demonstrating several matrix application techniques that are useful for detecting small molecules. Once the MS images are generated, the analysis and identification of metabolites of interest is discussed and demonstrated. The standard workflow presented here can be easily modified for different tissue types, molecular species, and instrumentation.

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

Mass spectrometric imaging (MSI) is a powerful tool that can be used to discover and identify various chemical species in intact tissues, preserving the compounds in their native environments, which can provide new insights into biological processes. Herein a MSI method developed for the analysis of small molecules is described.&#160;

التصوير MALDI الكتلة الطيفي للتحقيق في المستقلبات في<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; الجذر العقيدات

Most techniques used to study small molecules, such as pharmaceutical drugs or endogenous metabolites, employ tissue extracts which require the ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ binding proteins that initiate Ca2+ signaling cascades. However, we still know little about how stimulus specific Ca2+ signals are generated. The specificity of a Ca2+ signal may be attributed to the sophisticated regulation of the activities of Ca2+ channels and/or transporters in response to a given stimulus. To identify these cellular components and understand their functions, it is crucial to use systems that allow a sensitive and robust recording of Ca2+ signals at both the tissue and cellular levels. Genetically encoded Ca2+ indicators that are targeted to different cellular compartments have provided a platform for live cell confocal imaging of cellular Ca2+ signals. Here we describe instructions for the use of two Ca2+ detection systems: aequorin based FAS (film adhesive seedlings) luminescence Ca2+ imaging and case12 based live cell confocal fluorescence Ca2+ imaging. Luminescence imaging using the FAS system provides a simple, robust and sensitive detection of spatial and temporal Ca2+ signals at the tissue level, while live cell confocal imaging using Case12 provides simultaneous detection of cytosolic and nuclear Ca2+ signals at a high resolution.

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Ca2+ signaling regulates diverse biological processes in plants. Here we present approaches for monitoring abiotic stress induced spatial and temporal Ca2+ signals in Arabidopsis cells and tissues using the genetically encoded Ca2+ indicators Aequorin or Case12.

قياس المكانية والزمانية كاليفورنيا<sup&gt; 2+</sup&gt; إشارات في النباتات نبات الأرابيدوبسيس

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

MRM Microcoil Performance Calibration and Usage Demonstrated on Medicago truncatula Roots at 22 T

This protocol describes a signal-to-noise ratio (SNR) calibration and sample preparation method for solenoidal microcoils combined with biological samples, designed for high-resolution magnetic resonance imaging (MRI), also referred to as MR microscopy (MRM). It may be used at pre-clinical MRI spectrometers, demonstrated on Medicago truncatula root samples. Microcoils increase sensitivity by matching the size of the RF resonator to the size of the sample of interest, thereby enabling higher image resolutions in a given data acquisition time. Due to the relatively simple design, solenoidal microcoils are straightforward and cheap to construct and can be easily adapted to the sample requirements. Systematically, we explain how to calibrate new or home-built microcoils, using a reference solution. The calibration steps include: pulse power determination using a nutation curve; estimation of RF-field homogeneity; and calculating a volume-normalized signal-to-noise ratio (SNR) using standard pulse sequences. Important steps in sample preparation for small biological samples are discussed, as well as possible mitigating factors such as magnetic susceptibility differences. The applications of an optimized solenoid coil are demonstrated by high-resolution (13 x 13 x 13 &#956;m3, 2.2 pL) 3D imaging of a root sample.

MRM Microcoil Performance Calibration and Usage Demonstrated on Medicago truncatula Roots at 22 T

A protocol to study biological tissue at high spatial resolution using ultra-high field magnetic resonance microscopy (MRM) using microcoils is presented. Step-by-step instructions are provided for characterizing the microcoils. Finally, optimization of imaging is demonstrated on plant roots.

MRM Microcoil معايرة الأداء والاستخدام أظهرت على جذور طاعون Medicago في 22 T

This protocol describes a signal-to-noise ratio (SNR) calibration and sample preparation method for solenoidal microcoils combined with biological ...

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify transcriptional regulatory networks that govern developmental processes it is necessary to measure the spatial and temporal gene expression profiles of these individual cell types. Therefore, insight into the spatio-temporal control of gene expression is essential to gain understanding of how biological and developmental processes are regulated. Here, we describe a laser-capture microdissection (LCM) method to isolate small number of cells from three barley embryo organs over a time-course during germination followed by transcript profiling. The method consists of tissue fixation, tissue processing, paraffin embedding, sectioning, LCM and RNA extraction followed by real-time PCR or RNA-seq. This method has enabled us to obtain spatial and temporal profiles of seed organ transcriptomes from varying numbers of cells (tens to hundreds), providing much greater tissue-specificity than typical bulk-tissue analyses. From these data we were able to define and compare transcriptional regulatory networks as well as predict candidate regulatory transcription factors for individual tissues. The method should be applicable to other plant tissues with minimal optimization.

Presented here is a protocol for laser-capture microdissection (LCM) of plant tissues. LCM is a microscopic technique for isolating areas of tissue in a contamination-free manner. The procedure includes tissue fixation, paraffin embedding, sectioning, LCM and RNA extraction. RNA is used in the downstream tissue-specific, temporally resolved analysis of transcriptomes.