NIAID منح K22AI081748.

1. وبيوفيلم بالتنقيط تدفق مفاعل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وبيوفيلم تدفق مفاعل بالتنقيط (يمكن عادة ما تكون متاحة من تقنيات Biosurface أو العرف تصميم إصدارات أن تدلي بها محلات آلة الجامعة ، انظر الشكل 1) يتم تجميعها وتعقيمها. ويشمل التجمع كوبونات الالصاق في الغرف وغرفة أغطية تأمين. يتم تعقيم الغرفة ، جنبا إلى جنب مع بيوفيلم المتوسطة (مرق الصويا تريبسيني 2 غرام / لتر والجلوكوز 2 غرام / لتر) ، وأنابيب المغذيات مؤثر من قبل التعقيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غير متشكلة تلقيح من مفاعل بالتنقيط تدفق من خلال وضع المفاعل على سطح مستو ، خطوط أنابيب لقط النفايات السائلة ، وتعبئة كل غرفة مع 10 مل من مرق الصويا زيتية واضاف ان 10 ميكرولتر من س. ثقافة المذهبة نمت بين عشية وضحاها في مرق الصويا زيتية. المفاعل تلقيح هي المكان ثم في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 18 ساعة من الحضانة ، هو غير مثبت في أنابيب مياه الصرف ويتم وضع المفاعل على كتلة خشبية خفض إلى زاوية 10 درجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توصيل أنابيب جو معقم و مطهر مؤثر المغذيات إلى زجاجة تحتوي على مغذيات التدفق المستمر مرق. تغذية خط الأنابيب من خلال مضخة وأنابيب للرئيس عن طريق تشغيل المضخة على أقصى سرعة (سوف تختلف تبعا لنموذج المضخة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة وتستعد للأنابيب مؤثر وقف الضخ ونعلق إبر الاتصال (22 المقياس ، 1 بوصة) إلى نهاية كل أنبوب. مسح سدادة مدخل الغرفة مع الايثانول مسح وإدراج جو معقم و مطهر الإبر عن طريق سدادة المدخل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على مضخة والسماح لوسائل الإعلام لبالتنقيط ببطء (معدل التدفق ~ 125 ميكرولتر / دقيقة) خلال القسائم. وينبغي أن تدفق وسائل الاعلام الهابط على القسيمة من ميناء سدادة مدخل الى ميناء المخلفات السائلة. تشغيل المفاعل في التدفق المستمر لمدة 2-5 أيام (اعتمادا على التطبيق) ، والتحقق من حين لآخر لمياه الصرف المفاعل المناسب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد الأغشية الحيوية مفاعل بالتنقيط تدفق ، ووقف وإزالة مضخة بعناية الإبر من المفاعل. ويمكن بعد ذلك المفاعل يتم وضعها على سطح مستو ، ويمكن أن تكون القسائم إزالة جو معقم و مطهر باستخدام ملقط معقم. إذا كان المطلوب المجهري ، ويمكن الآن كوبونات يمكن معالجتها وفقا لذلك (الشكل 2B هو صورة مجهرية الإلكترون المسح من بيوفيلم S. المذهبة نمت في مفاعل بيوفيلم بالتنقيط). إذا كان تقدير حجم الكتلة الحيوية بيوفيلم أو دراسات علم وظائف الأعضاء والهدف من هذه الدراسة ، يمكن إزالة بيوفيلم من القسيمة باستخدام مكشطة الخلية. مخزنة في حين عقد كوبونات بالملقط ، كشط بلطف بيوفيلم كوبون في أنبوب مخروطي الشكل تحتوي على الفوسفات المالحة باستخدام مكشطة الخلية. ملاحظة : لقياس مستعمرة في الأغشية الحيوية ، فمن الضروري أن التجانس في الأغشية الحيوية التي تحصد بمنديل الخالط إلى تفصيل وتشكيل كتل تعليق متجانسة. نماذج مختلفة من الأنسجة التجانس هي مناسبة لهذا التطبيق. علينا الاستفادة من العلم فيشر Tissuemiser الخالط (المنتج # 15-338-420) بأقصى سرعة لمدة 1 دقيقة لعينات بيوفيلم التجانس. وعدم التجانس في بيوفيلم يؤدي إلى التقليل من مستعمرة موجودة في العينة. </li></ol> 2. وقرص دائري مفاعل بيوفيلم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تجميعها في بيوفيلم القرص الدورية مفاعل (متاح من تقنيات المتاحة من Biosurface أو يمكن أن تكون مصنوعة من العرف ، انظر الشكل 3) وتعقيمها. تجميع المفاعل المقام الأول عن طريق الغزل كوبونات القرص في فتحات من القرص الغزل ووضعه في كوب زجاج 1 لتر مع منفذ تجاوز. ويستخدم عدد 15 سدادة مطاطية مع حفر ثقوب في ذلك إلى السماح لوسائل الإعلام والتهوية وتدفق سقف المفاعل. المفاعل ، بيوفيلم وسائل الإعلام (مرق الصويا تريبسيني 2 غرام / لتر والجلوكوز 2 غرام / لتر) ثم يتم تعقيم ، ومدخل الأنبوب بواسطة التعقيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هو تحصين للبيوفيلم القرص الدورية المفاعل من خلال وضع 250 مليليتر من المتوسط ​​العقيمة في المفاعل ، وإضافة 0.5 مل من S. بين عشية وضحاها ثقافة المذهبة التي تزرع في مرق الصويا زيتية. ثم يتم وضع المفاعل على طبق من اثارة تعيين إلى 250 دورة في الدقيقة والمحتضنة ليلا لدرجة الحرارة المطلوبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 16 ساعة من الحضانة توصيل الأنابيب لمدخل الميناء على خزان والمتوسطة وذلك لربط مضخة تمعجية. المضخة هو بدوره بعد ذلك على تدفق وتعيين إلى 0.25 مل ~ / دقيقة (يمكن تغييرها تدفق يتوقف على معدل النمو المنشود). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 24 ساعة من وقف المفاعل وإزالة جو معقم و مطهر القرص دون لمس كوبونات بيوفيلم. مخزنة إزالة القسائم باستخدام ملقط معقم وتراجع كل واحد في المياه المالحة الفوسفات لإزالة أي بكتيريا فضفاضة يعلق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاختبار المركب المضادة للميكروبات ، يمكن وضع رقائق في الآبار الفردية 96 لوحة تحتوي على مركبات جيدا من الاهتمام. بعد الحضانة ، يتم نقلها إلى 1.5 رقائق أنابيب microcentrifuge مل تحتوي على 1 مل المالحة العازلة الفوسفات ومتجانسة مع النسيج الخالط لتفريق بيوفيلم سليمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مخففة ثم الخلايا المسلسل ومطلي على المغذيات آجار المتوسطة لتحديد قابلة للحياة formi مستعمرةنانوغرام وحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملاحظة : يمكن إجراء العديد من الاختلافات حول البروتوكول أعلاه. على سبيل المثال ، يمكن أن تكون مغلفة كوبونات القرص الغزل مع أو مصنوعة من المركبات المضادة للبيوفيلم المحتملة لاختبار نجاعة. ويمكن أيضا أن يتم تقييم المشتتات بيوفيلم أن تفرخ القسائم في المركبات مشتتة والبكتيريا الكمي المرفقة مقابل منفصلة. </li></ol> 3. ممثل النتائج ويرد مثال على انشاء مفاعل تدفق بالتنقيط إذا الشكل 1. بعد ثلاثة أيام من تدفق سوف مبالغ طائلة من بيوفيلم تتراكم على سطح القسيمة ، 2A الشكل. فإن مجموع الكتلة الحيوية تختلف باختلاف السلالات البكتيرية وظروف النمو دقيقة. A صورة مجهرية الإلكترون المسح من س. ويرد بيوفيلم المذهبة التي تزرع في مفاعل بالتنقيط تدفق 2B في الشكل. ويرد في مفاعل القرص الدورية 3A الرقم. ويمكن تكييف البروتوكول وصف لمتطلبات معينة من الكائنات الحية الدقيقة أي عموما قادرة على تشكيل بيوفيلم. ويبين الشكل 3B القرص الغزل مع 18 أقراص بلاستيكية ملصقة. وخصوصا في هذه الأغشية الحيوية قرص نمت مناسبة تماما للاختبار المضادة للميكروبات وتسفر عن نتائج غاية 11 استنساخه. <img src="/files/ftp_upload/2470/2470fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. المفاعل تدفق الإعداد بالتنقيط. وصفت عناصر هامة. <img src="/files/ftp_upload/2470/2470fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. مثال على تدفق بالتنقيط س. بيوفيلم المذهبة. أ) كانت تزرع هذه بيوفيلم لمدة ثلاثة أيام بعد بروتوكول صفها. تتم إزالة الأغطية من الغرفتين الأولى من المفاعل لإظهار S. الصفراء المكورات بيوفيلم الكتلة الحيوية. ب) صورة مجهرية الإلكترون Sacnning من S. بيوفيلم المذهبة التي تزرع في بالتنقيط مفاعل التدفق. <img src="/files/ftp_upload/2470/2470fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. المفاعل القرص بالتناوب. أ) مثال على القرص الغزل مفاعل قيد التشغيل. وصفت عنصرا رئيسيا. ب) عن قرب عرض قرص الغزل.

<ol>
	<li>Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+Biofilms.">Microbial Biofilms.</a> Annu. Rev. Microbiol. 49, 711-745 (1995).</li><li>Costerton, J. W., Cheng, K. J., Gessey, G. G., Ladd, T. I., Nickel, J. C., Dasgupta, M., Marrie, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+biofilms+in+nature+and+disease.">Bacterial biofilms in nature and disease.</a> Ann. Rev. Microbiol. 41, 435-464 (1987).</li><li>O'Toole, G. A., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+biofilm+formation+in+Pseudomonas+fluorescens+WCS365+proceeds+via+multiple,+convergent+signaling+pathways:+a+genetic+analysis.">Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signaling pathways: a genetic analysis.</a> Mol. Micro. 28, 449-461 (2002).</li><li>Boles, B. R., Horswill, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agr-mediated+dispersal+of+Staphylococcus+aureus+biofilms.">Agr-mediated dispersal of Staphylococcus aureus biofilms.</a> PLoS Pathog. 4, e1000052-e1000052 (2008).</li><li>Goeres, D. M., Haamilton, M. A., Beck, N. A., Buckingham-Meyer, K., Hilyard, J., Loetterle, L. A., Walker, D. K., Stewart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+growing+a+biofilm+under+low+shear+at+the+air-liquid+interface+using+the+drip+flow+biofilm+reactor.">A method for growing a biofilm under low shear at the air-liquid interface using the drip flow biofilm reactor.</a> Nature Protocols. 4, 783-788 (2009).</li><li>Fu, W., Forster, T., Mayer, O., Curtin, J. J., Lehman, S. M., Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophage+cocktail+for+the+prevention+of+biofilm+formation+by+Pseudomonas+aeruginosa+on+catheters+in+an+in+vitro+model+system.">Bacteriophage cocktail for the prevention of biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa on catheters in an in vitro model system.</a> Antimicrob Agents Chemother. 54, 397-404 (2010).</li><li>Xu, K. D., McFeters, G. A., Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+resistance+to+antimicrobial+agents.">Biofilm resistance to antimicrobial agents.</a> Microbiology. 146, 547-549 (2000).</li><li>Xu, K. D., Stewart, P. S., Xia, F., Huang, C. T., McFeters, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+physiological+heterogeneity+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+is+determined+by+oxygen+availability.">Spatial physiological heterogeneity in Pseudomonas aeruginosa biofilm is determined by oxygen availability.</a> Appl. Environ. Microbiol. 64, 4035-4039 (1998).</li><li>Boles, B. R., Thoendel, M., Singh, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-generated+diversity+produces+"insurance+effects"+in+biofilm+communities.">Self-generated diversity produces "insurance effects" in biofilm communities.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 16630-16635 (2004).</li><li>Pitts, B., Willse, A., McFeters, G. A., Hamilton, M. A., Zelver, N., Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+repeatable+laboratory+method+for+testing+the+efficacy+of+biocides+against+toilet+bowl+biofilms.">A repeatable laboratory method for testing the efficacy of biocides against toilet bowl biofilms.</a> J. Appl. Microbiol. 91, 117-11 (2001).</li><li>Boles, B. R., Thoendel, M., Singh, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhamnolipids+mediate+detachment+of+Pseudomonas+aeruginosa+from+biofilms.">Rhamnolipids mediate detachment of Pseudomonas aeruginosa from biofilms.</a> Mol. Microbiol. 57, 1210-1223 (2005).</li><li>Hentzer, M., Teitzel, G. M., Balzer, G. J., Heydorn, A., Molin, S., Givskov, M., Parsek, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate+overproduction+affects+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+structure+and+function.">Alginate overproduction affects Pseudomonas aeruginosa biofilm structure and function.</a> J. Bacteriol. 183, 5395-5401 (2001).</li><li>Lin, H. Y., Chen, C. T., Huang, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+merocyanine+540+for+photodynamic+inactivation+of+Staphylococcus+aureus+planktonic+and+biofilm+cells.">Use of merocyanine 540 for photodynamic inactivation of Staphylococcus aureus planktonic and biofilm cells.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 6453-6458 (2004).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

الأغشية الحيوية ونمت في المفاعلات مختلفة في كثير من الأحيان ، والخصائص المختلفة لكل مفاعل لها تطبيقات مختلفة. في هذا العمل ، ونحن تصف استخدام المفاعلات بيوفيلم هما : بيوفيلم تدفق مفاعل بالتنقيط ومفاعل القرص بالتناوب. المفاعلات بالتنقيط تدفق مفيدة لنمو منخفض في الأغشية الحيوية القص واجهة الهواء السائل وقابلة للتكيف مع مجموعة متنوعة من الظروف. نجدهم مريحة للغاية للدراسات حيث كمية كبيرة من الكتلة الحيوية بيوفيلم أمر مرغوب فيه. ويمكن بسهولة أن تتكيف هذا الإعداد للدراسات التي تنطوي على رصد microsensor واختبار السطوح antibiofilm المحتملة. المفاعل القرص الدورية مفيد لنمو بيوفيلم متطابقة على أقراص متعددة في إطار بيئة إزالة القص معتدلة. قدرة هذا المفاعل لانتاج الأغشية الحيوية متطابقة متعددة على الأقراص القابلة للإزالة يجعلها مثالية للدراسات التي تنطوي على اختبار المركبات المضادة للميكروبات والسطوح مقاومة بيوفيلم. والعديد من التطبيقات المحتملة عند استخدام هذه المفاعلات بيوفيلم ويتم تشجيع الباحثين على تعديل البروتوكول لأفضل نموذج احتياجاتهم بحثية محددة. هذه البروتوكولات توفير بدائل للخلية تدفق ثابت والمقايسات الأغشية الحيوية التي استخدمت بشكل مكثف في الماضي. فإنها قد تتيح أيضا مزيدا من القدرة على محاكاة عدوى سريرية متنوعة. ومع ذلك ، هناك قيود محتملة مع كل أسلوب. على سبيل المثال ، مفاعلات بالتنقيط تدفق والمفاعلات القرص الدورية ليست مثالية لتصور الأغشية الحيوية بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر. أيضا ، فإن فسيولوجيا الأغشية الحيوية تزرع في أنواع مختلفة من المفاعلات تختلف من المرجح بدرجة كبيرة. على سبيل المثال ، فإن المفاعل بالتنقيط تدفق النتيجة في بيوفيلم يتعرض التدرجات الغذائية الشديدة ، التي هي مختلفة تماما عن التدفق الصفحي موحد من وسائل الإعلام عبر تدفق المغذيات بيوفيلم الخلية. في نهاية المطاف ، فإن النوع من المفاعلات المستخدمة تعتمد على بيوفيلم يجري تناول المسائل والمحققين ينبغي أن ندرك أن العديد من أنظمة مفاعل بيوفيلم تتوفر لدراساتهم.

Erratum: The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Drip Flow Reactors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BioSurface Technologies Corporation</td>
<td>DFR 110</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rotating Disk Reactors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BioSurface Technologies Corporation</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

the use of drip flow and rotating disk reactors for staphylococcus aureus biofilm analysis

ويعتقد أن معظم الميكروبات في الطبيعة في الوجود والسطحية المصاحبة للمجتمعات المحلية في الأغشية الحيوية. 1 الأغشية الحيوية الجرثومية المغطى داخل مصفوفة وتعلق على تشكيل سطح الأرض. بيوفيلم 2 والتنمية تدرس عادة في المختبر باستخدام نظم الدفعي مثل لوحات أو تدفق microtiter نظم ، مثل خلايا التدفق. هذه المنهجيات هي مفيدة لفحص المكتبات متحولة والكيميائية (لوحات microtiter) 3 أو الأغشية الحيوية المتنامية للمرئيات (خلايا تدفق) 4. هنا نقدم بروتوكولات وإجراءات تفصيلية عن المكورات العنقودية الذهبية المتزايد في نوعين من الأغشية الحيوية إضافية نظام التدفق : بيوفيلم في تدفق مفاعل بالتنقيط وبيوفيلم القرص مفاعل بالتناوب. تم تصميم المفاعلات بالتنقيط تدفق بيوفيلم لدراسة الأغشية الحيوية نمت في ظل ظروف القص منخفضة. بالتنقيط تدفق 5 المفاعل يتكون من أربع قنوات اختبار بالتوازي مع ذلك ، كل قادر على عقد one ميكروسكوب القسيمة الشريحة القياسية الحجم ، أو طول قسطرة أو مهمة. المفاعل بالتنقيط تدفق مثالية لرصد microsensor ، الدراسات العامة بيوفيلم ، وعينات بيوفيلم cryosectioning ، وارتفاع إنتاج الكتلة الحيوية ، وتقييم المواد الطبية ، وسكنى اختبار الجهاز الطبي. 6،7،8،9 المفاعل القرص الدورية يتكون من قرص يحتوي على تجاويف للتفلون القسائم القابلة للإزالة. القسائم القابلة للإزالة (10) التي يمكن من أي مادة ألالة. الجزء السفلي من قرص يحتوي على المغناطيس الدورية للسماح للشريط تناوب على القرص لإنشاء القص السائل عبر سطح سطح دافق القسائم. يوضع القرص بأكمله يحتوي على 18 قسيمة في كوب مل 1000 سفينة المفاعل الجانبية الذراع. ويتم توزيع وسائل الاعلام من خلال النمو السائل السفينة في حين يتم تدوير القرص من قبل النمام المغناطيسي. تتم إزالة القسائم من السفينة المفاعل ثم كشط لجمع عينة بيوفيلم لمزيد من الدراسة أو التصوير المجهري. تم تصميم المفاعلات القرص الدورية لتقييم كفاءة المختبر بالطرق البيولوجية ، وإزالة بيوفيلم ، وأداء المواد المانعة للقاذورات. 9،11،12،13

Watch this Scientific Journal Video about The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis at JoVE.com

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

وتعرض لاستخدام بروتوكولات مفتوحة مع نظام الأغشية الحيوية تدفق مفاعلات تدفق بالتنقيط والدورية المفاعلات القرص بالتفصيل.

استخدام الري بالتنقيط وتدفق مفاعلات الأقراص الدوارة ل المكورات العنقودية الذهبية التحليل بيوفيلم

Most microbes in nature are thought to exist as surface-associated communities in biofilms.1  Bacterial biofilms are encased within a matrix and attached ...

the-use-drip-flow-rotating-disk-reactors-for-staphylococcus-aureus

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

17.1K Views.  University of Michigan. وتعرض لاستخدام بروتوكولات مفتوحة مع نظام الأغشية الحيوية تدفق مفاعلات تدفق بالتنقيط والدورية المفاعلات القرص بالتفصيل.

Video: The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA)

MRSA is a worldwide threat to public health, and MRSA skin and soft-tissue infections now account for more than half of all soft-tissue infections in the United States. Among soft-tissue infections, myositis, pyomyositis, and necrotizing fasciitis have been increasingly reported in association with MRSA arising from the community. To understand the interplay between MRSA and host immunity leading to more severe infection, the availability of animal models is critical, permitting the study of host and bacterial factors. Several infection models have been introduced to assess the pathogenesis of S. aureus during superficial skin infection. Here, we describe a subcutaneous infection model that examines the skin, subcutaneous, and muscle pathologies.

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus MRSA

Murine skin and soft tissue infection model is utilized for assessing the virulence function of methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and the host immunological responses. Here, we presented a subcutaneous infection model for skin and soft tissue infection.

تحت الجلد من العدوى المكورات العنقودية المذهبة المقاومة للميثيسيلين (MRSA)

MRSA is a worldwide threat to public health, and MRSA skin and soft-tissue infections now account for more than half of all soft-tissue infections in the ...

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in Rat

Endovascular infections, including endocarditis, are life-threatening infectious syndromes1-3. Staphylococcus aureus is the most common world-wide cause of such syndromes with unacceptably high morbidity and mortality even with appropriate antimicrobial agent treatments4-6. The increase in infections due to methicillin-resistant S. aureus (MRSA), the high rates of vancomycin clinical treatment failures and growing problems of linezolid and daptomycin resistance have all further complicated the management of patients with such infections, and led to high healthcare costs7, 8. In addition, it should be emphasized that most recent studies with antibiotic treatment outcomes have been based in clinical settings, and thus might well be influenced by host factors varying from patient-to-patient. Therefore, a relevant animal model of endovascular infection in which host factors are similar from animal-to-animal is more crucial to investigate microbial pathogenesis, as well as the efficacy of novel antimicrobial agents. Endocarditis in rat is a well-established experimental animal model that closely approximates human native valve endocarditis. This model has been used to examine the role of particular staphylococcal virulence factors and the efficacy of antibiotic treatment regimens for staphylococcal endocarditis. In this report, we describe the experimental endocarditis model due to MRSA that could be used to investigate bacterial pathogenesis and response to antibiotic treatment.

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus MRSA in Rat

Experimental rat endocarditis model due to methicillin-resistant S. aureus.

نموذج تجريبي من التهاب الشغاف مقاومة مثسلين<em&gt; المكورات العنقودية الذهبية</em&gt; (MRSA) في الجرذ

Endovascular infections, including endocarditis, are life-threatening infectious syndromes1-3. Staphylococcus aureus is the most common world-wide cause ...

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant reservoir of iron inside the human host is heme, which is the cofactor of hemoglobin. To acquire iron from hemoglobin, S. aureus utilizes an elaborate system known as the iron-regulated surface determinant (Isd) system1. Components of the Isd system first bind host hemoglobin, then extract and import heme, and finally liberate iron from heme in the bacterial cytoplasm2,3. This pathway has been dissected through numerous in vitro studies4-9. Further, the contribution of the Isd system to infection has been repeatedly demonstrated in mouse models8,10-14. Establishing the contribution of the Isd system to hemoglobin-derived iron acquisition and growth has proven to be more challenging. Growth assays using hemoglobin as a sole iron source are complicated by the instability of commercially available hemoglobin, contaminating free iron in the growth medium, and toxicity associated with iron chelators. Here we present a method that overcomes these limitations. High quality hemoglobin is prepared from fresh blood and is stored in liquid nitrogen. Purified hemoglobin is supplemented into iron-deplete medium mimicking the iron-poor environment encountered by pathogens inside the vertebrate host. By starving S. aureus of free iron and supplementing with a minimally manipulated form of hemoglobin we induce growth in a manner that is entirely dependent on the ability to bind hemoglobin, extract heme, pass heme through the bacterial cell envelope and degrade heme in the cytoplasm. This assay will be useful for researchers seeking to elucidate the mechanisms of hemoglobin-/heme-derived iron acquisition in S. aureus and possibly other bacterial pathogens.

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Here we describe a growth assay for Staphylococcus aureus using hemoglobin as the sole source of available nutrient iron. This assay establishes the role of bacterial factors involved in hemoglobin-derived iron acquisition.

المكورات العنقودية الذهبية النمو باستخدام الهيموجلوبين الإنسان باعتبارها المصدر الحديد

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and clonal strain relatedness of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), particularly with the emerging outbreaks of community-associated MRSA (CA-MRSA) occurring on a worldwide basis. Traditional PCR typing schemes classify SCCmec by targeting and identifying the individual mec and ccr gene complex types, but require the use of many primer sets and multiple individual PCR experiments. We designed and published a simple multiplex PCR assay for quick-screening of major SCCmec types and subtypes I to V, and later updated it as new sequence information became available. This simple assay targets individual SCCmec types in a single reaction, is easy to interpret and has been extensively used worldwide. However, due to the sophisticated nature of the assay and the large number of primers present in the reaction, there is the potential for difficulties while adapting this assay to individual laboratories. To facilitate the process of establishing a MRSA SCCmec assay, here we demonstrate how to set up our multiplex PCR assay, and discuss some of the vital steps and procedural nuances that make it successful.

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

We demonstrate a simple multiplex PCR assay for quick-screening and typing of Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) types I-V for methicillin-resistant Staphylococcus aureus, and provide some of the vital steps and procedural nuances that make it successful for adapting this assay to individual laboratories.

?????? PCR ????? ??????? ?? ?????????? ????? ???????? ????? ?? ????? ??? ?????? ?? ????????? ??????<em&gt; ???????? ????????? ???????</em

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing  is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and  clonal strain ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs) and other toxins produced and secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils. To study the effects of the PSMs on neutrophils we isolate fresh neutrophils using density gradient centrifugation. These neutrophils are loaded with a dye that fluoresces upon calcium mobilization. The activation of neutrophils by PSMs initiates a rapid and transient increase in the free intracellular calcium concentration. In a flow cytometry experiment this rapid mobilization can be measured by monitoring the fluorescence of a pre-loaded dye that reacts to the increased concentration of free Ca2+. Using this method we can determine the PSM concentration necessary to activate the neutrophil, and measure the effects of specific and general inhibitors of the neutrophil activation.	
	To investigate the expression of the PSMs in the intracellular space, we have constructed reporter fusions of the promoter of the PSM&alpha; operon to GFP. When these reporter strains of S. aureus are phagocytosed by neutrophils, the induction of expression can be observed using fluorescence microscopy.

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of PSMs and other toxins secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils using flow cytometry and fluorescence microscopy.

دراسة تفاعلات<em&gt; المكورات العنقودية الذهبية</em&gt; مع العدلات بواسطة التدفق الخلوي والوقت الفاصل بين المجهري

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority of laboratory work is conducted with planktonic cells. Here, we describe a peg plate biofilm assay as performed with Staphylococcus aureus. Bacterial biofilms are grown on pegs attached to a 96-well microtiter plate lid, washed through gentle submersion in buffer, and placed in a drug challenge plate. After subsequent incubation they are again washed and moved to a final recovery plate, in which the fluorescent dye resazurin serves as a viability indicator. This assay offers greatly increased ease-of-use, reliability, and reproducibility, as well as a wealth of data when conducted as a kinetic read. Moreover, this assay can be adapted to a medium-throughput drug screening approach by which an endpoint fluorescent readout is taken instead, offering a path for drug discovery efforts.

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Most bacterial infections produce a biofilm. By virtue of their environment, biofilm associated bacteria are often phenotypically drug resistant. Novel antibacterial molecules that kill bacteria in biofilms are thus a high priority. We establish an assay to quickly screen for antimicrobial compounds that are effective at eradicating biofilms.

استهداف بيوفيلم أسوشيتد<em&gt; المكورات العنقودية الذهبية</em&gt; استخدام ريسازورين استنادا الفحص المخدرات-القابلية

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, therefore, suitable to be used for routine purposes. For best resolution, data evaluation and data management, a miniaturized electrophoresis system is required. Together with such an electrophoresis system and the in-house developed software (freely available here) assignment of the pattern of bands to a genotype is standardized and straight forward. DNA extraction is simple (boiling prep), setting-up of the reactions is easy and they can be run on any standard PCR machine. PCR cycling is common except prolonged ramping and elongation times. Compared to spa typing and Multi Locus Sequence Typing (MLST), RS-PCR does not require DNA sequencing what simplifies the analysis considerably and allows a high throughput. Furthermore, the resolution for bovine strains of S. aureus is at least as good as spa typing and better than MLST or pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). The RS-PCR data base includes presently a total of 141 genotypes and variants. The method is highly associated with the virulence gene pattern, contagiosity and pathogenicity of S. aureus strains involved in bovine mastitis. S. aureus genotype B (GTB) is contagious and causes herds problems causing large costs in the Switzerland and other European countries. All the other genotypes observed in Switzerland infect individual cows and quarters. Genotyping by RS-PCR allows the reliable prediction of the epidemiological and the pathogenic potential of S. aureus involved in bovine intramammary infection (IMI), two key factors for clinical veterinary medicine. Because of these beneficial properties together with moderate costs and a high sample throughput the goal of this publication is to give a detailed, step-by-step protocol for easily establishing and running RS-PCR for genotyping S. aureus in other laboratories.

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

Here, ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is used together with a miniaturized electrophoresis system as a fast and high resolution method for genotyping S. aureus at moderate costs allowing a high throughput.

التنميط الجيني ل<em&gt; المكورات العنقودية الذهبية</em&gt; من جانب خاص بالريبوسوم فاصل PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to antibiotics. Genomic studies reveal that S. aureus carries many virulence and resistance genes located in mobile genetic elements, suggesting that horizontal gene transfer (HGT) plays a critical role in S. aureus evolution. However, a full and detailed description of the methodology used to study HGT in S. aureus is still lacking, especially regarding natural transformation, which has been recently reported in this bacterium. This work describes three protocols that are useful for the in vitro investigation of HGT in S. aureus: conjugation, phage transduction, and natural transformation. To this aim, the cfr gene (chloramphenicol/florfenicol resistance), which confers the Phenicols, Lincosamides, Oxazolidinones, Pleuromutilins, and Streptogramin A (PhLOPSA)-resistance phenotype, was used. Understanding the mechanisms through which S. aureus transfers genetic materials to other strains is essential to comprehending the rapid acquisition of resistance and helps to clarify the modes of dissemination reported in surveillance programs or to further predict the spreading mode in the future.

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

We describe here three different protocols for the in vitro investigation of conjugation, transduction, and natural transformation in Staphylococcus aureus.

منهجية لدراسة نقل أفقي جين في<em&gt; المكورات العنقودية الذهبية</em

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can have pathological significance. An ideal method for examining alterations to monocytes is whole blood flow cytometry as the minimal handling of samples by this method limits artifactual cell activation. However, many different approaches are taken to gate the monocyte subsets leading to inconsistent identification of the subsets between studies. Here we demonstrate a method using whole blood flow cytometry to identify and characterize human monocyte subsets (classical, intermediate, and non-classical). We outline how to prepare the blood samples for flow cytometry, gate the subsets (ensure contaminating cells have been removed), and determine monocyte subset expression of surface markers &#8212; in this example M1 and M2 markers. This protocol can be extended to other studies that require a standard gating method for assessing monocyte subset proportions and monocyte subset expression of other functional markers.

Here we present a protocol for characterizing monocyte subsets by whole blood flow cytometry. This includes outlining how to gate the subsets and assess their expression of surface markers and giving an example of the assessment of the expression of M1 (inflammatory) and M2 markers (anti-inflammatory).

وصف مجموعات فرعية الوحيدات البشرية بالدم كله يتدفق التحليل الخلوي

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence rates of S. aureus infection climbing annually, there is a demand for additional research in its&#160;pathogenicity. Animal models of infectious disease advance our understanding of the host-pathogen response and lead to the development of effective therapeutics. Neutrophils play a primary role in the innate immune response that controls S. aureus infections by forming an abscess to wall off the infection and facilitate bacterial clearance; the number of neutrophils that infiltrate an S. aureus skin infection often correlates with disease outcome. LysM-EGFP mice, which possess the enhanced green fluorescent protein (EGFP) inserted in the Lysozyme M (LysM) promoter region (expressed primarily by neutrophils), when used in conjunction with in vivo whole animal fluorescence imaging (FLI) provide&#160;a means of quantifying neutrophil emigration noninvasively and longitudinally into wounded skin. When combined with a bioluminescent S. aureus strain and sequential in vivo whole animal bioluminescent imaging (BLI), it is possible to longitudinally monitor both the neutrophil recruitment dynamics and in vivo bacterial burden at the site of infection in anesthetized mice from onset of infection to resolution or death. Mice are more resistant to a number of virulence factors produced by S. aureus that facilitate effective colonization and infection in humans. Immunodeficient mice provide a more sensitive animal model to examine persistent S. aureus infections and the ability of therapeutics to boost innate immune responses. Herein, we characterize responses in LysM-EGFP mice that have been bred to MyD88-deficient mice (LysM-EGFP&#215;MyD88-/- mice) along with wild-type LysM-EGFP mice to investigate S. aureus skin wound infection. Multispectral simultaneous detection enabled study of neutrophil recruitment dynamics by using in vivo FLI, bacterial burden by using in vivo BLI, and wound healing longitudinally and noninvasively over time.

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

An approach is described for real-time detection of the innate immune response to cutaneous wounding and Staphylococcus aureus infection of mice. By comparing LysM-EGFP mice (which possess fluorescent neutrophils) with a LysM-EGFP crossbred immunodeficient mouse strain, we advance our understanding of infection and the development of approaches to combat infection.

نموذج الماوس لتقييم الفطرية الاستجابة المناعية للعدوى المكوّرات العنقودية الذهبية

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...